細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)入門

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)入門第一頁，共75頁。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)入門第二頁，共75頁。

◆在細(xì)胞培養(yǎng)中注意的一些問題◆細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)程序◆細(xì)胞的復(fù)蘇

◆細(xì)胞的計(jì)數(shù)

◆細(xì)胞(貼壁)的傳代培養(yǎng)

◆細(xì)胞的凍存◆懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)方法

第三頁，共75頁。在細(xì)胞培養(yǎng)中注意的一些問題

環(huán)境

由于體外培養(yǎng)細(xì)胞沒有抗感染能力，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范，也會(huì)導(dǎo)致污染。因而，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠，特別是實(shí)驗(yàn)環(huán)境更為重要。

第四頁，共75頁。1.培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒

★培養(yǎng)室無菌培養(yǎng)室每天都要用速消凈或0.2％的新潔而滅（苯扎溴銨）拖洗地面一次（拖布要專用），紫外線照射消毒30～50min。

第五頁，共75頁?！锍瑑艄ぷ髋_(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗，然后紫外線消毒30min。消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線，降低消毒效果。一些操作用具如移液器、廢液缸。污物盒、試管架等用75％酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線照射消毒。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線。第六頁，共75頁。2.培養(yǎng)前準(zhǔn)備

在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序，有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無誤后將其放置到培養(yǎng)室、超凈臺(tái)內(nèi)，然后開始消毒。這樣可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。第七頁，共75頁。3.培養(yǎng)條件

★氣體環(huán)境：95％空氣加5％CO2混和氣體環(huán)境中。

★

PH值：7.2～7.4★溫度：37℃第八頁，共75頁。

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理1.清洗和浸泡:(1)玻璃器皿:新的玻璃器皿在生產(chǎn)過程中常使玻璃表面呈堿性，并帶有一些如鉛和砷等對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)，使用前必須徹底清洗。首先用自來水初步刷洗，5％稀鹽酸溶液中浸泡過夜。然后用流水徹底沖洗3-5遍，單蒸餾水漂洗3遍，三（雙）蒸水漂洗2遍，烘干備用。第九頁，共75頁。（2)塑料器皿:塑料器皿經(jīng)沖凈后，晾干，用2％NaOH浸泡過夜，自來水沖洗，5％鹽酸浸泡30min，流水徹底沖洗3-5遍，單蒸餾水漂洗3遍，三（雙）蒸水漂洗2遍，烘干備用。針頭式濾器不能泡酸液,用2％NaOH泡6～12小時(shí),或者煮沸20分鐘,常規(guī)沖洗干凈，烘干（60℃以下）備用。使用前要包裝，首先要裝好濾膜，安裝時(shí)注意光面朝上(凹向上)，然后用注射器回抽注入檢查膜是否破損，安裝好膜后將螺旋稍微第十頁，共75頁。

擰松一些，放入鋁盒內(nèi)（或用牛皮紙包裝）外層用紙包裝備用。注意在超凈臺(tái)內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊；膠塞的處理：按常規(guī)沖洗干凈烘干后，用2％氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞要置入單蒸水中浸泡，再用沸水處理30鐘），自來水洗凈，烘干然后再泡入1％稀鹽酸液中30分鐘，用自來水徹底沖洗3-5遍，蒸餾水漂洗3遍，三（雙）蒸漂洗2遍，烘干備用。第十一頁，共75頁。2.包裝：

在消毒前必須進(jìn)行嚴(yán)格包裝，以便消毒及儲(chǔ)存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染。包裝紙（盒）表面用油性記號(hào)筆標(biāo)明物品名稱、消毒日期等。第十二頁，共75頁。

3.消毒:

在組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，務(wù)必保證組織細(xì)胞在無微生物的條件下生長。防止培養(yǎng)物污染可通過消毒滅菌（將已存在的微生物去除）和無菌操作技術(shù)（防止已經(jīng)消毒滅菌的用品被污染）來完成。

第十三頁，共75頁。（1）消毒滅菌的方法:

★物理方法:濕熱（高壓蒸汽）、干熱、紫外線照射線、過濾、離心沉淀等方法殺滅或去除微生物.

★化學(xué)方法:使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。

第十四頁，共75頁。

(2)消毒滅菌的時(shí)間：

★干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)行，需加溫到160℃，保持90～120min方能殺死芽孢。消毒完畢后不可馬上將烤箱門打開，以免冷空氣突然進(jìn)入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。

第十五頁，共75頁。

★濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行消毒，要求是：

◆不能裝太滿，保持消毒器內(nèi)氣體流通。

◆在加熱升壓之前，打開排氣閥門，使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出。關(guān)閉排氣閥門，開始升壓，待達(dá)到所需要的壓力時(shí)，開始記錄時(shí)間，并控制壓力恒定。

第十六頁，共75頁。

◆一般物品：布類、金屬器械、玻璃器皿等消毒的要求是15磅20min；常規(guī)使用液體：消毒15磅15min。橡膠和塑料用品：如濾器、EP管、離心管等高壓10磅15min。

第十七頁，共75頁?！镒贤饩€消毒：主要用于實(shí)驗(yàn)室房間里的空氣、操作臺(tái)表面及桌椅等消毒。時(shí)間為30min－2h左右?！镞^濾除菌消毒：適用于組織細(xì)胞培養(yǎng)使用的液體如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白質(zhì)具有生物活性的液體等。

第十八頁，共75頁。4.細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）:

（1）水：雙蒸水、三蒸水，可高壓除菌。

（2）平衡鹽溶液（PBS)：PH為7.2－7.4，不含鈣鎂離子，可高壓除菌。（3）消化液：

★胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的濃度為0．25％，pH值7.2左右。需過濾除菌。第十九頁，共75頁?！?/p>

EDTA液：常用濃度為0．02％，配制時(shí)采用無Ca2+、Mg2+平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用?！?/p>

胰蛋白酶EDTA－Na2:需過濾除菌。胰蛋白酶和EDTANa2聯(lián)合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要徹底清洗，否則細(xì)胞易脫壁。第二十頁，共75頁。★

膠原酶：適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。可用BSS或含血清的培養(yǎng)液配制，這樣實(shí)驗(yàn)操作簡便同時(shí)提高細(xì)胞成活率。

第二十一頁，共75頁。但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。膠原酶的常用劑量為200U／ml（約為lmg／ml）或0．03％～0．3％。

(4)培養(yǎng)基（液）過濾除菌

常用0．22pm微孔濾膜。

第二十二頁，共75頁。

（4）l640培養(yǎng)液(常用)

（5）DMEM、F12培養(yǎng)液

（6）Ham培養(yǎng)液

(無血清培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)

（7）Hepes：具有較強(qiáng)的緩沖能力，能常時(shí)間恒定緩沖液的PH值。使用濃度可根據(jù)緩沖要求而定。第二十三頁，共75頁。（8）3%L-谷氨酰胺：可作為細(xì)胞能量來源，使用量1％。但其在溶液中極不穩(wěn)定，需重新加入。

（9）丙酮酸鈉、葡萄糖：是屬碳水化合物的成分，是細(xì)胞生命的能量來源。

第二十四頁，共75頁。（10）抗生素：最終濃度為青霉素100U／ml，鏈霉素100U／ml（青霉素為80萬U／瓶，將其溶解于4ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加入0.5ml；鏈霉素為100萬U／瓶，將其溶解在5ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液加0.5ml）。

第二十五頁，共75頁。（11）細(xì)胞生長液：是用以維持細(xì)胞生長增殖的液體。其是配方：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％～90％

血清10％～20％雙抗100u/ml

（12）細(xì)胞維持液：用以維持細(xì)胞緩慢生長或不死的培養(yǎng)液。其是配方：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基95％

血清2％～5％雙抗100u/ml

第二十六頁，共75頁。（13）凍存液：其是配方：10％DMSO40％小牛血清（30％FBS）1％的5.6％NaHCO3

1％雙抗48％（58％）基礎(chǔ)培養(yǎng)液。第二十七頁，共75頁。（14）MEM培養(yǎng)液:其是配方：

63%MEM液

20％的乳蛋白水解物

10％的小牛血清

1％的雙抗（P、S）

用5.6％NaHCO3溶液調(diào)pH至7.2～7.4。第二十八頁，共75頁。

細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)程序

細(xì)胞培養(yǎng)

動(dòng)物組織原代培養(yǎng)細(xì)胞株的體外培養(yǎng)血管、骨髓、羊水、胸水、腹水內(nèi)細(xì)胞株貯存在液氮灌或－80℃細(xì)胞及皮膚、粘膜、神經(jīng)、胚胎、以下的低溫冰箱中腫瘤等組織

分離

復(fù)蘇組織切成1cm3小塊，方法根據(jù)樣本而異。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，立即放入有機(jī)械分散法、剪切分離法、消化分離法37℃水浴箱中充分溶解，立即（胰酶消化分離法、膠原酶法）離心500～1000r/min×1～2min，棄掉上清液。獲得細(xì)胞懸液種入接種入瓶中培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)

第二十九頁，共75頁。37℃培養(yǎng)箱（或5%CO2培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)24小時(shí)后換液去處對(duì)細(xì)胞生長有毒物質(zhì)，如DMSO、細(xì)胞組織殘?jiān)⒓?xì)胞代謝產(chǎn)物

貼壁細(xì)胞

懸浮細(xì)胞直接去掉上清液離心去掉上清液，必要時(shí)做細(xì)胞飼養(yǎng)層以凈化細(xì)胞傳代

細(xì)胞生長80％以上覆蓋培養(yǎng)瓶底，根據(jù)細(xì)胞生長周期不同而異，2－3天或1周左右一代貼壁細(xì)胞懸浮細(xì)胞.消化法，用胰酶－EDTANa2消化，直接吹打或離心法、自然沉淀法，時(shí)間根據(jù)細(xì)胞而定吸一半液到另一瓶

凍存第三十頁，共75頁。凍存程序★

細(xì)胞凍存管寫好標(biāo)簽：細(xì)胞名稱，時(shí)間及保存人。★取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（2～5×1O5cells／ml），收集細(xì)胞前24h換液；★吸出培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞一次，除去，加入消化液胰蛋白酶－EDTANa2（消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞而定），去掉消化液，加入培養(yǎng)液充分混勻，1000rp離心1min,去掉上清液；

★重懸浮于凍存液中，大約1～5×106cells／ml；

★每個(gè)凍存管中加入lml細(xì)胞懸浮液，擰緊蓋子。

★冷凍細(xì)胞應(yīng)緩慢降溫，可用裝有異丙醇的冷凍盒30min～1h后,再放入-200C冰箱中2h左右，然后轉(zhuǎn)至-800C冰箱，可保存數(shù)月，如需長期保存，應(yīng)在-800C冰箱中放3h～8h后轉(zhuǎn)至液氮中。第三十一頁，共75頁。

細(xì)胞計(jì)數(shù)一、原理

細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/毫升表示。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。

第三十二頁，共75頁。

用臺(tái)盼（酚）蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。

第三十三頁，共75頁。二、儀器、用品與試劑

1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、EP管、毛細(xì)吸管等。

2、試劑：SP20細(xì)胞、0.4％臺(tái)盼（酚）蘭其

配方是：臺(tái)盼（酚）蘭0.4g加雙蒸水100ml等。

3、材料：細(xì)胞懸液

第三十四頁，共75頁。細(xì)胞懸液的制備：

用毛吸管吸5滴細(xì)胞懸液到EP管中，加入1滴0.4％臺(tái)盼藍(lán)染液或苯胺黑，混勻，靜置2～3min,活細(xì)胞不會(huì)被染色，而死細(xì)胞著藍(lán)色，這樣加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。

第三十五頁，共75頁。三、操作步驟

1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。

第三十六頁，共75頁。

4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×稀釋倍數(shù)×104/ml

第三十七頁，共75頁。四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：

1.要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

第三十八頁，共75頁。

4.操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。5.數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。第三十九頁，共75頁。第四十頁，共75頁。體外細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)概述

復(fù)蘇細(xì)胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快速融化的手段。這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化。避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。第四十一頁，共75頁。用品和試劑

培養(yǎng)液、吸管、離心管、培養(yǎng)瓶、CHO/Hela細(xì)胞等。操作步驟（圖）第四十二頁，共75頁。注意

★存取凍存管時(shí)都要佩戴防護(hù)眼鏡和手套，凍存管投入存放溫水的器皿中后應(yīng)立即把蓋子扣上，以防發(fā)生意外。

★

離心后上清夜一定要吸干凈，以免因DSMO的毒性造成細(xì)胞活力下降而難以復(fù)活。第四十三頁，共75頁。細(xì)胞傳代培養(yǎng)一、原理

在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和（細(xì)胞增值達(dá)到一定密度后），為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。第四十四頁，共75頁。二、材料和試劑

★細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株CHO

★試劑：0.25％胰酶、1640培養(yǎng)基（含10％小牛血清）。

★儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等。

第四十五頁，共75頁。第四十六頁，共75頁。

三、操作步驟

★將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去?！锛尤?.5～1ml0.25％胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中?！锲靠谌孟鹌と?，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入10ml培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底第四十七頁，共75頁。

發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化。一般室溫消化時(shí)間約為1～3分鐘。

★用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶蓋），置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。

第四十八頁，共75頁。

四、注意事項(xiàng)

★形成的單層細(xì)胞相互匯合，整個(gè)瓶底逐漸被覆蓋時(shí)要立即進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長。

★傳代時(shí)不同的細(xì)胞消化時(shí)間不同，因而要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)進(jìn)行處理。以免因消化過頭而產(chǎn)生過多的細(xì)胞碎片，影響細(xì)胞生長。

第四十九頁，共75頁。

★吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

★防止由于培養(yǎng)細(xì)胞污染等因素造成細(xì)胞系的絕種，要及時(shí)凍存細(xì)胞。

★細(xì)胞檔案要記錄好，如組織來源，生物學(xué)特性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時(shí)間和規(guī)律，細(xì)胞的遺傳學(xué)標(biāo)志，生長形態(tài)，常規(guī)病理染色的標(biāo)本等。

第五十頁，共75頁。附1◆1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置方法:1640粉10.4gHepes2.38g葡萄糖2.5g丙酮酸鈉110mgNaHCO32g雙（三）蒸水加至1000ml第五十一頁，共75頁。附2：◆消化液配制方法：稱取0.25g胰酶蛋白酶（活力為1：250），加100ml無Ca2+、Mg2+的Hank’s液(或PBS液)溶解，濾器過濾除用前可在37℃下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA－Na2，使最終濃度達(dá)0.02％。

第五十二頁，共75頁。細(xì)胞的凍存

一、概述

凍存細(xì)胞時(shí)要緩慢冷凍。因?yàn)榧?xì)胞在直接冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)很快形成冰晶，冰晶的形成將引起一系列的不良反應(yīng)。首先細(xì)胞脫水,部分蛋白質(zhì)由于上述因素而變性，引起細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成和細(xì)胞膜系統(tǒng)上蛋白質(zhì)、酶的變性，引起細(xì)胞能量代謝的障礙。第五十三頁，共75頁。細(xì)胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體在冷凍中易發(fā)生破壞引起胞膜通透性的改變、使細(xì)胞內(nèi)容物喪失。細(xì)胞核內(nèi)DNA也是冷凍時(shí)細(xì)胞易受損傷部分。如細(xì)胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成DNA的空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷性變化，而引起細(xì)胞的死亡。因此在細(xì)胞凍存時(shí)要盡可能的均勻地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。

第五十四頁，共75頁。

目前多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高胞膜對(duì)水的通透性；加上緩慢冷凍方法可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成所造成的細(xì)胞損傷。這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。第五十五頁，共75頁。二、用品和試劑★0.25％胰蛋白酶?！锖?0％－20％(胎牛)血清培養(yǎng)液。★吸管、離心管、2ml凍存管（如質(zhì)量不好，有時(shí)密封不嚴(yán)，使用時(shí)炸裂；因而使用前要仔細(xì)檢查）。★酒精燈（或其他安瓶封口設(shè)備）、封口膠等。第五十六頁，共75頁。★凍存液:

DMSO液：

10％DMSO1％雙抗（過濾）

40％小牛血清（30％FBS）

48％（58％）基礎(chǔ)培養(yǎng)液(無菌)

1％的5.6％NaHCO3(無菌)

無色新鮮甘油（1磅蒸汽高壓消毒）

第五十七頁，共75頁。三、操作步驟

（圖）（1）取生長狀態(tài)好的細(xì)胞即選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，已經(jīng)長滿的細(xì)胞凍存。第五十八頁，共75頁。（2）離心洗滌用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則不需處理。依據(jù)傳代方法把消化好的細(xì)胞收集于離心管加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，離心1000rpm／min×2min。去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液。

第五十九頁，共75頁。（3）加含10％DMSO凍存液加入配制好的凍存培養(yǎng)液（含10％DMSO或甘油），凍存液中細(xì)胞的最終密度為1～5×106／ml左右。用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，然后分裝入無菌凍存管或安瓶中，每只安瓶或凍存管加液l～1．5ml。

第六十頁，共75頁。（4）凍存管用封