單克隆抗體和基因工程抗體的制備

關(guān)于單克隆抗體和基因工程抗體的制備第一頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日目的要求1.掌握雜交瘤技術(shù)的基本原理2.熟悉單克隆抗體的制備技術(shù)3.熟悉基因工程抗體技術(shù)第二頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

大多數(shù)抗原分子具有多個(gè)抗原決定簇（表位，epitope）。一個(gè)抗原決定簇刺激一個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生一種特異性抗體，一種抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生多種抗體稱為多克隆抗體（polyclonalantibody,PcAb）如免疫血清。由一個(gè)只識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體稱為單克隆抗體(monoclonalantibody,McAb)。概述第三頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日單克隆抗體理化性狀高度均一，其抗原結(jié)合部位完全相同，生物活性專一，特異性強(qiáng)，純度高，效價(jià)高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化及大量制備，是研究抗體的一重大突破。應(yīng)用比較廣，如試劑診斷盒、治療腫瘤、器官移植及自身免疫病等。第四頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理

基本原理是融合的兩種細(xì)胞保持自身的特性，產(chǎn)生具有原來(lái)兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì)胞稱為雜交細(xì)胞。包括B細(xì)胞、T細(xì)胞，前者產(chǎn)生Ig，后者產(chǎn)生CK。第五頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

一、B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)

細(xì)胞是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。B細(xì)胞能產(chǎn)生抗體，但不能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)，而骨髓瘤細(xì)胞不產(chǎn)生抗體但在體外能長(zhǎng)期生長(zhǎng)，二者融合，各保持其本性，既產(chǎn)生抗體又長(zhǎng)期生長(zhǎng)。其原理分為幾個(gè)步驟第六頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

目的是制備抗原特異的McAb，所以融合的細(xì)胞必須經(jīng)抗原免疫的B細(xì)胞，通常取脾，另一是在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)又不產(chǎn)生抗體，所以選腫瘤細(xì)胞即多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，具備以下特點(diǎn)：

（一）細(xì)胞的選擇與融合第七頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.穩(wěn)定、易培養(yǎng)

2.自身不分泌Ig或CK3.融合率高

4.是HGPRT缺陷株

第八頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

目前常用的BALB/c小鼠B細(xì)胞瘤株有P3-X63-Ag8.653C（P3.653）、Sp2/0等。為HAT敏感株，易培養(yǎng),融合率高，最常選用聚乙二醇(PEG)使細(xì)胞膜輕度損傷，細(xì)胞容易融合。第九頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

（二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用

細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過(guò)程。融合后可能出現(xiàn)以下情況:1）脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞

2）瘤細(xì)胞與瘤細(xì)胞

3）脾細(xì)胞與脾細(xì)胞

4）未融合的脾細(xì)胞

5）未融合的瘤細(xì)胞

6）多聚體形式。

3）、4）、6）在體外易死去，不需篩選。第十頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第十一頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日細(xì)胞的DNA合成一般有兩條途徑

一是糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，進(jìn)一步合成DNA，葉酸是重要輔酶。

一是輔助途徑，是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（hypoxanthineguaninephospheribosyltransferase,HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（thymidinekinase,TK）的催化作用合成DNA。第十二頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，當(dāng)氨基蝶呤存在時(shí)，能阻斷第一條途徑。細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分，次黃嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤(aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)，三者取前綴縮寫為HAT培養(yǎng)基，其融合細(xì)胞所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選擇出來(lái)的HGPRT陰性細(xì)胞株。第十三頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日所以，前面提到的2）瘤細(xì)胞與瘤細(xì)胞及5)未融合的瘤細(xì)胞不能生長(zhǎng)，只有1）脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞才能生長(zhǎng)，因?yàn)槠⒓?xì)胞為HGPRT陽(yáng)性，通過(guò)補(bǔ)償途徑代替氨基蝶呤阻斷的主要途徑。第十四頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

（三）有限稀釋與抗原特異性選擇

在免疫動(dòng)物時(shí)，一種抗原往往有多個(gè)表位，一個(gè)B細(xì)胞克隆接受一個(gè)表位，故在免疫動(dòng)物時(shí)是眾多B細(xì)胞克隆的抗體的分泌，而針對(duì)目的抗原的B細(xì)胞只占很少部分，在細(xì)胞融合后，有相當(dāng)一部分是無(wú)關(guān)的細(xì)胞融合體，即融合細(xì)胞分泌的不是目的抗體，要進(jìn)行篩選，分二步稀釋。第十五頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日計(jì)數(shù)，每個(gè)孔只放一個(gè)細(xì)胞，實(shí)際是0至數(shù)個(gè)，整個(gè)過(guò)程為克隆化，將陽(yáng)性細(xì)胞株重復(fù)一次，盡量使抗體更純，將陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行增殖，部分凍存，部分進(jìn)行體外培養(yǎng)或動(dòng)物接種。第十六頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

另外還有其他雜交瘤技術(shù)，如人-人B淋巴細(xì)胞雜交瘤和鼠-人B淋巴細(xì)胞雜交瘤，人骨髓瘤細(xì)胞系體外建株比較困難，生長(zhǎng)不穩(wěn)定，有的分泌IgE，有的分泌Ig的γ、κ鏈。B細(xì)胞取外周血淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、病灶浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞。從理論上講很好，但實(shí)際比較困難，在于缺乏好的親體骨髓瘤細(xì)胞株，較難獲得抗原特異性B淋巴細(xì)胞；人雜交瘤細(xì)胞不能在小鼠或其他動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。

第十七頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日小鼠骨髓瘤與人的B細(xì)胞雜交瘤，該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是易獲得小鼠骨髓瘤細(xì)胞，融合率較高，但最大的缺點(diǎn)是不同種雜交后不穩(wěn)定，雜交瘤傳代后，很快喪失分泌抗體的染色體。第十八頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日二、T細(xì)胞雜交瘤

自B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)后，T淋巴細(xì)胞雜交瘤成為熱門，為獲得淋巴因子，更深入地研究T細(xì)胞的各種功能，雖然有一些小鼠T細(xì)胞雜交瘤成功的報(bào)道，但結(jié)果不滿意，該細(xì)胞很不穩(wěn)定，分泌淋巴因子無(wú)特異性，一種T細(xì)胞雜交瘤可同時(shí)分泌幾種淋巴因子，到目前仍無(wú)突破性進(jìn)展。第十九頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日T淋巴細(xì)胞雜交瘤分為小鼠及人，由于T細(xì)胞功能的多樣化，制備出的T細(xì)胞雜交瘤也各有其特性，如分泌淋巴因子，特異性殺傷功能，分泌抑制因子，自身反應(yīng)性等。其基本過(guò)程是將激活的T細(xì)胞與酶缺陷型T淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞融合，可表達(dá)特異性TCR或其他功能的雜交瘤T細(xì)胞，與B細(xì)胞相以，但細(xì)胞激活和陽(yáng)性克隆篩選較為雜交，不穩(wěn)定，簡(jiǎn)介主要步驟。第二十頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.淋巴瘤細(xì)胞系的選擇1）體外無(wú)限制快速生長(zhǎng)2）融合率高3）不分泌淋巴因子和殺傷功能4）缺乏某一特異性表面抗原或受體5）HGPRT酶缺陷型第二十一頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

2.特異性T細(xì)胞的制備與純化主要有可溶性抗原誘導(dǎo)激活的T細(xì)胞、同種反應(yīng)性T細(xì)胞、人的特異性T細(xì)胞。第二十二頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

3.T細(xì)胞雜交瘤的篩選通常在含有HAT選擇培養(yǎng)基上，用特異性抗體篩選產(chǎn)生淋巴因子的雜交瘤細(xì)胞，用抗CD3-TCR抗體篩選陽(yáng)性細(xì)胞。第二十三頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

三、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)

雜交瘤細(xì)胞形成的初期很不穩(wěn)定，鼠的二倍體細(xì)胞有40對(duì)染色體，雜交后80對(duì)，易丟失，丟失后仍生長(zhǎng)，要檢測(cè)上清液中是否有目的抗體及淋巴因子。第二十四頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日將陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，反復(fù)2～3次，確保為一單細(xì)胞陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存，以防止細(xì)胞染色體丟失，發(fā)生變異或污染，凍存于液氮（-196℃）,凍存時(shí)加小牛血清至20%,加幾滴10%二甲亞砜。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)可用液體、半固體、接種動(dòng)物腹腔。第二十五頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第二節(jié)單克隆抗體的制備技術(shù)

McAb單一、特異、純化，利用雜交瘤技術(shù)制備McAb的基本原理是三個(gè)原則：

1）一種單克隆產(chǎn)生一種抗體

2）雜交瘤細(xì)胞保持雙親細(xì)胞特性

3）篩選培養(yǎng)基第二十六頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

一、單克隆抗體的產(chǎn)生

1.動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞注射同系小鼠腹腔，先注射石蠟或不完全佐劑，使腹腔滲出液增多，1～2周后無(wú)菌方法抽取腹水，離心取上清。

第二十七頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

2.體外培養(yǎng)較常做，用普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞生長(zhǎng)情況收取上清液。另有高密度培養(yǎng)，在單位體積內(nèi)增加細(xì)胞的培養(yǎng)數(shù)量。第二十八頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

二、單克隆抗體的純化

腹水或細(xì)胞上清液，均含有脂蛋白、脂質(zhì)及細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，用濾紙去掉脂質(zhì)和大顆粒，離心去除細(xì)胞碎片和蛋白聚合物。第二十九頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日目前純化方法有十幾種，一般采用鹽析、凝膠過(guò)濾、離子交換層析和辛酸提取等，現(xiàn)在最有效的方法是親和純化法，常用SPA或抗小鼠免疫球蛋白抗體與載體交聯(lián)。稱為Sepharose柱，抗體結(jié)合上去，然后洗脫。第三十頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定

鑒定的方法很多，用已知抗原測(cè)定抗體，幾乎所有的抗原抗體反應(yīng)試驗(yàn)都可以作，如陽(yáng)性，再定量，確定工作濃度。第三十一頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第三節(jié)基因工程抗體技術(shù)

雜交瘤單克隆抗體在診斷、治療、預(yù)防和蛋白質(zhì)提純應(yīng)用中非常廣泛，但對(duì)人是異源性，人抗小鼠抗體，應(yīng)用基因工程技術(shù)減少小鼠源成分，保留原有的抗體特異性。第三十二頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日一、人源化抗體

人源化抗體主要指鼠源性單克隆抗體的基因克隆及DNA重組技術(shù)改造，重新表達(dá)的抗體。其大部分氨基酸序列為人源序列所取代，既基本保留親代鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了鼠異源性。第三十三頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

（一）人-鼠嵌合抗體

通過(guò)基因工程技術(shù)將人IgGC區(qū)與鼠IgGV區(qū)連接，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)表達(dá)制備的抗體稱為嵌合抗體，因IgG的抗原性在C區(qū)，來(lái)自人，故抗原性降低，且半衰期明顯延長(zhǎng)，在介導(dǎo)CDC及ADCC亦明顯增強(qiáng)。

第三十四頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

1.鼠單克隆抗體可變區(qū)基因克隆用探針從該雜交瘤細(xì)胞的基因組文庫(kù)中調(diào)取。用PCR方法從該細(xì)胞的RNA中擴(kuò)增VH

及VL

基因。第三十五頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

2.表達(dá)載體的構(gòu)建人-鼠嵌合抗體的表達(dá)載體基因依可變區(qū)基因克隆的表達(dá)方式不同而分為兩類，從基因文庫(kù)所克隆的可變區(qū)基因帶有上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件及內(nèi)含子剪接信號(hào)，因此載體只需要包括細(xì)胞內(nèi)增殖所必須的抗生素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制的起始序列以及在真核細(xì)胞進(jìn)行選擇的顯性標(biāo)記基因。

第三十六頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

將載體DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)染。導(dǎo)入的DNA整合至細(xì)胞基因組DNA中得到轉(zhuǎn)染子，要得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子需利用真核細(xì)胞的顯性選擇標(biāo)記基因，這些標(biāo)記基因使細(xì)胞獲得對(duì)某些細(xì)胞毒物質(zhì)的抗體，在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的細(xì)胞毒物質(zhì)可殺死轉(zhuǎn)染不成功的細(xì)胞，達(dá)到選擇的目的。第三十七頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

3.表達(dá)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞或大腸桿菌表達(dá)量較少，而應(yīng)用二氫葉酸還原酶（dhfr）擴(kuò)增系統(tǒng)使抗體表達(dá)增強(qiáng)。dhfr是正常核酸代謝必須的酶，缺乏該酶的中華倉(cāng)鼠卵細(xì)胞（CHO））需在有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷條件下利用DNA合成，因此,dhfr作CHO的顯性選擇標(biāo)記基因，在無(wú)次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情況下，只有導(dǎo)入dhfr基因，細(xì)胞才能存活。該糸統(tǒng)可用來(lái)擴(kuò)增導(dǎo)入的目的基因。第三十八頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

(二)改形抗體（reshapedantibody,RAB）應(yīng)用基因工程技術(shù)在嵌合抗體基礎(chǔ)上用人抗體可變區(qū)序列取代鼠源單抗CDR以外的骨架序列，重新構(gòu)成既有鼠源單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體，該抗體對(duì)人無(wú)免疫原性。第三十九頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

（三）抗體的表面修飾

人和鼠IgV區(qū)來(lái)自不同的種屬，輕鏈不同型別，互補(bǔ)性決定區(qū)(complementaritydeterminingregion,CDR)的長(zhǎng)度可不一致，但暴露于表面的AA殘基的位置數(shù)量都很保守，通過(guò)改變表面殘基使其人源化，降低鼠可變區(qū)的異源性，將Fv的表面人源化，消除其免疫原性而不影響Fv

的整體空間構(gòu)象。第四十頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

（四）雙特異性抗體雙特異性抗體（bispecificantibody,BsAb）又稱雙功能抗體。兩個(gè)抗原結(jié)合部位具有不同的特異性，可以同時(shí)與兩種不同特異性抗原發(fā)生結(jié)合。第四十一頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

1.化學(xué)交聯(lián)BsAb分別分離純化兩種抗原的單抗，先使Ig解離后，獲得單價(jià)抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價(jià)抗體或其片段交聯(lián)起來(lái)。該方法易致抗體失活，其產(chǎn)物也難以保證均質(zhì)性。第四十二頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

2.細(xì)胞工程BsAb將二種雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行融合產(chǎn)生雜交瘤，核酸隨機(jī)組合多種多樣。第四十三頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

3.基因工程BsAb用抗體分子片段如ScFv或Fab等，經(jīng)基因操作修飾后，或體外組裝成為BsAb，或直接導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)分泌BsAb。在免疫檢測(cè)、腫瘤放射免疫顯象、藥物剎傷、介導(dǎo)細(xì)胞剎傷效應(yīng)起重要作用。第四十四頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

二、小分子抗體

具有結(jié)合抗原功能的分子片段稱為小分子抗體。其優(yōu)點(diǎn)：1）可在原核細(xì)胞表達(dá)，生產(chǎn)成本低;2）易于穿透血管或組織到靶細(xì)胞部位，有利于疾病的治療；3）不含F(xiàn)c段，副作用小；4）半衰期短，有利于毒素中和及清除。

第四十五頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

小分子抗體包括：抗原結(jié)合片段（fragmentofantigenbinding,Fab），可變區(qū)片段（fragmentofvariableregion,Fv）,單鏈抗體（singlechainFv,ScFv），單區(qū)抗體。另有VH和VL。第四十六頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

1.Fab

由一條完整的L鏈和約為1/2的H鏈組成，是完整抗體的1/3，只有一個(gè)Ag結(jié)合位點(diǎn)，它是將McAb重鏈V區(qū)和CH1區(qū)cDNA與完整輕鏈cDNA連接，在細(xì)胞啟動(dòng)子的控制下分泌表達(dá)。第四十七頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

2.Fv和單鏈抗體（ScFv）

Fv由VH和VL構(gòu)成，非共價(jià)鍵結(jié)合，為完整抗體的1/6，單一抗原結(jié)合位點(diǎn)，VH和VL連接有三種方法：1）用戊二醛處理，使之交聯(lián)；2）引入半胱氨酸殘基，使VH和VL之間形成二硫鍵；3）把VH和VL用一段適當(dāng)?shù)墓押塑账岱肿舆B接起來(lái)，表達(dá)成一個(gè)單鏈，稱為ScFv。第四十八頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

3.單區(qū)抗體及最小識(shí)別單位根據(jù)抗體分子的結(jié)構(gòu)，一般將Fv

稱為抗體的最小單位，但有些更小亞單位仍結(jié)合抗原，如單獨(dú)重鏈VH仍可保留相當(dāng)程度抗原結(jié)合能力，其作用比VL大，稱為單區(qū)抗體（singledomainantibody），其親和力低于完整的Fv，因單區(qū)抗體的疏水區(qū)的暴露，增加了非特異性吸附，水溶性減低，其應(yīng)用受到限制，但分子量小，單位體積濃度高，副作用小，是很有前景的抗體部分。第四十九頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到有多樣性生物功能的融合蛋白，有幾種構(gòu)建方式：

1）將Fab或ScFv與其他生物活性蛋白融合，建成生物導(dǎo)彈。

三、抗體融合蛋白第五十頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日2）在融合時(shí)可根據(jù)某些恒定區(qū)，可使某些生物活性與抗體的生物學(xué)效應(yīng)功能聯(lián)結(jié)在一起。

3）將ScFv與某些細(xì)胞膜蛋白融合，形成嵌合受體，使細(xì)胞結(jié)合抗原。第五十一頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

（一）含F(xiàn)v片段的抗體融合蛋白將Fv

與某些毒素、酶及細(xì)胞因子等的基因連接，能編碼Fv

與毒素、酶及細(xì)胞因子復(fù)合物，即生物導(dǎo)彈，主要在于抗腫瘤。第五十二頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

（二）嵌合受體將ScFv與某些細(xì)胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表達(dá)于細(xì)胞表面。其抗體部分與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合。如將抗體的可變區(qū)基因與TCR的α鏈和β鏈恒定區(qū)融合，將融合基因?qū)隩細(xì)胞，既表達(dá)特異性抗體，又表達(dá)TCR，該TCR不受MHC分子限制。第五十三頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

（三）含F(xiàn)c的抗體融合蛋白如將CD4分子細(xì)胞膜外部分與Fc融合后用真核細(xì)胞表達(dá)，由二硫鍵連接成雙體，分泌到細(xì)胞外，產(chǎn)生二種功能：1）延長(zhǎng)在血循環(huán)中的半衰期；2）通過(guò)功能蛋白與配體分子的作用，將Fc的生物學(xué)效應(yīng)引導(dǎo)至特定目的，如CD4與Fc融合蛋白，CD4是T輔助細(xì)胞表面糖蛋白，是HIV的受體，該融合蛋白能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HIV，可阻斷HIV對(duì)TH的感染，可介導(dǎo)ADCC及CDC，可通過(guò)胎盤。第五十四頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

小分子抗體都是單價(jià)，不能偶聯(lián)。將特異性不同的兩個(gè)小分子抗體連接在一起可獲得雙特異性抗體。（bispecificantibody,BsAb），雙價(jià)ScFv與抗原結(jié)合比單價(jià)敏感性高，親和力大，結(jié)構(gòu)和功能上都更接近親本抗體。BsAb分子片段可從Fab、Fv

或ScFv

組建，可在體內(nèi)或體外連接。四、雙特異性抗體第五十五頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

在小分子抗體的羧基端設(shè)計(jì)半胱氨酸殘基，如帶鉸鏈區(qū)的Fab段或帶半胱氨酸殘基尾巴的ScFv，可在體外通過(guò)化學(xué)交聯(lián)成為雙價(jià)抗體分子，亮氨酸鉸鏈也可用來(lái)構(gòu)建，兩個(gè)不同抗體連接成為功能抗體。如抗體CD3和抗IL-2R的Fab在體外直接介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)表達(dá)IL-2的細(xì)胞有殺傷作用。

（一）雙價(jià)抗體分子的構(gòu)建1.體外構(gòu)建第五十六頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

對(duì)小分子抗體基因的改造修飾，使細(xì)胞直接表達(dá)雙抗體分子，比體外組建更有效，現(xiàn)有以下幾種方法:

2.雙抗體分子的細(xì)胞內(nèi)組建第五十七頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日（1）設(shè)計(jì)促進(jìn)雙聚體形成的結(jié)構(gòu)域，半胱氨酸是促進(jìn)雙聚體形成的結(jié)構(gòu)域，使小分子抗體在大腸桿菌的分泌型表達(dá)過(guò)程中形成雙體，亮氨酸拉鏈和甲基（CH3）亦有螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋結(jié)構(gòu)，使之成為雙體。（2）在基因構(gòu)建上直接將兩個(gè)抗體分子片段融合。（3）雙體分子兩個(gè)ScFv的VH

和VL

相互配對(duì)，可產(chǎn)生雙價(jià)的雙抗體分子。第五十八頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

能同時(shí)結(jié)合兩種不同抗原，因而可介導(dǎo)標(biāo)記物與靶抗原的結(jié)合，或某些高級(jí)分子定位于靶細(xì)胞。在臨床上有以下應(yīng)用：

（二）雙特異性抗體的應(yīng)用第五十九頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日1.在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用一個(gè)臂結(jié)合靶抗原，另一個(gè)臂結(jié)合酶，不需用酶標(biāo)記抗體，避免在標(biāo)記過(guò)程中降低酶及抗體的活性。

2.在腫瘤放射免疫顯像中的應(yīng)用一個(gè)臂結(jié)合腫瘤細(xì)胞，另一個(gè)臂結(jié)合半抗原螯合劑，半抗原螯合劑能選擇與放射性核素結(jié)合。放射免疫顯像，清晰度和靈敏度高。第六十頁(yè)，共六十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日

3.雙特異性抗體介導(dǎo)的藥物殺傷效應(yīng)