動物細胞融合與雜交

關(guān)于動物細胞融合與雜交第一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)細胞融合與雜交概述一.概念和目的細胞融合：自然或人為條件下，兩個或兩個以上細胞相互接觸，發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合形成融合細胞的現(xiàn)象。細胞雜交：不同類型的細胞之間發(fā)生的融合叫做細胞雜交。（種間雜交、種內(nèi)雜交）目的：獲得雜種優(yōu)勢第二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)細胞融合的方法一、細胞融合的一般過程第三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日細胞融合過程可分為：凝集：細胞凝集與細胞膜的糖蛋白有關(guān)蛋白質(zhì)分子重新分布：是細胞融合的必要前提脂質(zhì)分子重排：是實現(xiàn)細胞融合的關(guān)鍵胞質(zhì)合并：后續(xù)的穩(wěn)定步驟。第四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日二．融合方法

最早被采用病毒融合劑有皰疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在內(nèi)的病毒類融合劑。滅活仙臺病毒介導(dǎo)細胞融合過程可以大大提高融合頻率。它在病毒類融合劑中最為有效，使用最廣。1.病毒誘導(dǎo)融合：第五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日

滅活的病毒既保留了誘導(dǎo)細胞融合的能力，又不會感染細胞。滅活仙臺病毒誘導(dǎo)融合的機理第六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日使用仙臺病毒誘導(dǎo)細胞融合步驟先將親本細胞分別制成懸液、混合離心將沉積細胞懸于1ml滅活的仙臺病毒懸液，置冰浴間歇搖動20分鐘，細胞凝集溫度升至37℃

，間歇搖動30分鐘，使其進行融合洗去病毒，即可將融合物懸浮于選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。第七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日2．化學(xué)誘導(dǎo)融合它們主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷酯、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、甘油－醋酸酯、油酸、油胺和二價陽離子載體等。其中則以PEG的使用最為廣泛。第八頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日PEG可能的促融合作用機理

1、PEG可能使細胞膜的脂類分子的物理結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，容易被PEG作用打開細胞膜，使細胞融合。

2、PEG可能會把細胞膜上的蛋白質(zhì)分子排開，使脂質(zhì)體扦入與膜結(jié)合。

3、PEG可能作用于膜磷脂極性基團和細胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面電位下降，同時使膜糖蛋白的排阻體積減少，最終使膜出現(xiàn)缺口，進而融合。第九頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日PEG誘導(dǎo)細胞融合的效果：PEG分子量大小:1000－6000濃度:30－60％。PEG分子量和濃度越大，其融合率越高，但它的細胞毒性和粘度也隨之增大。一般認為PEC濃度為30－50％時，以分子量1000的融合效果最佳。如果濃度增至50％和60％時則改變PEG400為好。PEG的處理時間。懸浮法，1－2分鐘離心法，5－8分鐘第十頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日

若輔以5－15％的二甲亞砜或在融合前先用植物血凝素處理一下，則效果更好。

PEG誘導(dǎo)融合的優(yōu)點：PEG來源廣泛，操作簡單，誘導(dǎo)率也相對于病毒誘導(dǎo)要高。使目前最常用的細胞融合誘導(dǎo)方法。第十一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日3．電融合法：電融合技術(shù)的原理：懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細胞，在1－100MHz和100－1000V/cm的交流電場中，會向小電極移動，并極化成偶極子，而沿電場方向排列成串，此時再加上適當強度和持續(xù)時間的高壓電脈沖、即可使相鄰細胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電擊穿，從而觸發(fā)細胞融合。第十二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第十三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第十四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第十五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日電融合技術(shù)的優(yōu)點①對細胞損傷小。②融合效率高。③融合方法快速，可重復(fù)性強。④融合細胞可在光鏡下直接觀察、跟蹤、鑒定，可控性好。第十六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日最大的不利之處是儀器的購置。在融合大小不同的細胞時存在問題。在融合膜成分不同的細胞時存在困難。電融合技術(shù)的不利之處：第十七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日電融合技術(shù)的改進方法1、物理法磁-電融合法聲-電融合法電-機融合法2、化學(xué)法利用化學(xué)試劑（刀豆蛋白A等）凝集細胞后電融合。3、特異性電融合法利用抗原抗體特異性結(jié)合凝集細胞電擊。第十八頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日三、細胞融合的影響因素1.細胞種類和性質(zhì)（細胞種類、細胞的表面性質(zhì)、親本細胞的親緣關(guān)系）2.融合條件（溫度、pH值、氧氣）3.離子強度和種類（一般是Ca2+，50—100mmol/L）第十九頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)融合子的檢出與鑒定一、融合子的篩選遺傳互補篩選法：HAT篩選營養(yǎng)缺陷型互補選擇法抗性互補選擇法形態(tài)特征選擇法生長特性選擇法第二十頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日脾細胞(B淋巴細胞)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞脾細胞/脾細胞骨髓瘤細胞/骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞脾細胞篩選出不能長期存活不能長期存活第二十一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日HAT培養(yǎng)基篩選H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)第二十二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日二、融合子的鑒定1.細胞學(xué)鑒定：染色體鑒定2.生化分析：同工酶譜分析3.分子生物學(xué)鑒定：DNA探針技術(shù)第二十三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)雜交瘤技術(shù)一、基礎(chǔ)知識：抗體：免疫球蛋白抗原：可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并可與應(yīng)答產(chǎn)物結(jié)合的外來“異物”。免疫反應(yīng)：指機體免疫系統(tǒng)對異己物質(zhì)的識別與清除等一系列復(fù)雜過程?？贵w分子組成：2Fab+1Fc單抗：單克隆抗體是指由一個B細胞分化增殖的子代細胞(漿細胞)產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的抗體。（均一性、特異性）第二十四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第二十五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第二十六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日二.B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)基本原理：正常的可產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞在融合劑的作用下產(chǎn)生融合，雜交的細胞在HAT選擇培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到的為雜交瘤細胞，該細胞既具有可分泌抗體的功能又可在體外大量增殖的能力。第二十七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日KohlerandMilstein

第二十八頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日脾細胞(B淋巴細胞)骨髓瘤細胞雜交瘤細胞長命不分泌抗體分泌抗體短命分泌抗體長命K?hler和Milstein,19751984年Nobel醫(yī)學(xué)獎雜交瘤技術(shù)路線第二十九頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第三十頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日第三十一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日B淋巴細胞本身是一種終末分化細胞，通常不再進行細胞分裂，存活一段時間后便會死亡——短命細胞（一）、親本細胞概述脾臟與B淋巴細胞(Blymphocytes)：一般來講，脾臟有三大功能：1.它是“血庫”，當人體休息安靜時，它貯存血液；當處于運動、失血、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)時，它又將血液排送到血循環(huán)中，以增加血容量。2.脾臟猶如一臺“過濾器”，當血液中出現(xiàn)病菌、抗原、異物、原蟲時，脾臟中的巨噬細胞、淋巴細胞就會將其吃掉。3.脾臟還可以制造免疫球蛋白、補體等免疫物質(zhì)，發(fā)揮免疫作用。第三十二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日B淋巴細胞發(fā)育過程：祖B淋巴細胞前B淋巴細胞成熟B淋巴細胞抗原刺激、遞呈細胞和Th細胞作用活化B淋巴細胞分化為漿細胞第三十三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日骨髓瘤細胞(myelomacells):惡性增殖的轉(zhuǎn)化細胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠分裂和存活——長命細胞。①能在體外連續(xù)生長，倍增期短于24小時；②缺乏HGPRT酶；③克隆效應(yīng)高；④在動物中有致腫瘤性；⑤與小鼠淋巴細胞融合率相當高；⑥本身不合成Ig，且不抑制雜交瘤細胞中的Ig合成基因。骨髓瘤細胞的選擇原則第三十四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日（二）、雜交瘤技術(shù)的操作流程1.動物免疫：目的：在細胞融合后獲得盡可能多的分泌針對于該目標抗原的特異性抗體的雜交瘤細胞.特定目標抗原動物免疫脾臟中B淋巴細胞B淋巴細胞大量增殖刺激能分泌針對于該抗原的特異性抗體第三十五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日免疫動物的選擇選擇免疫動物，即供脾動物，通常選用小鼠。正常供體和骨髓瘤細胞種系發(fā)生越近緣，產(chǎn)生的雜交瘤就越穩(wěn)定(反之亦然)。因為作為融合用的大多數(shù)小鼠骨髓瘤細胞是從BALB/C純系小白鼠取得，所以用BALB/C作脾細胞供體最為合適。第三十六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日常規(guī)免疫法脾內(nèi)一次性免疫法短程免疫法體外免疫法常用免疫方法：“穩(wěn)妥；優(yōu)勢克隆”皮下注射腹腔注射靜脈注射免疫途徑：“省時；省抗原”“省時”“操作繁瑣”第三十七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日免疫方案

a.顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5mlip(腹腔內(nèi)注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5mlip↓3周后加強免疫(融合前三天)

1×10７／0.5mlip或iv(靜脈內(nèi)注射)↓取脾融合第三十八頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日

b.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑;

初次免疫Ag

1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射│(一般0.8～1ml

0.2ml／點)↓3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip│(ip劑量不宜超過0.5ml)↓3周后第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ip│(5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果)↓2～3周后加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv↓3天后取脾融合第三十九頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日（2）、細胞融合及HAT篩選1、細胞融合方法：1)脾細胞懸液的制備：最后一次加強免疫后第3天制備（機械分離法），培養(yǎng)基RPMI1640。

2)骨髓瘤細胞懸液的制備：于對數(shù)生長期挑選形態(tài)較好的細胞，臺盼蘭染色后計數(shù)，挑選80％以上存活率的細胞離心后重新懸浮。2)50%PEG配制：稱取2gPEG（1000或4000）于青霉素瓶加塞，8磅（0.06MPa）15min，待冷至50℃加等量預(yù)熱的不含血清的培養(yǎng)基。第四十頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日1）108小鼠脾細胞與107骨髓瘤細胞混合，離心（1000rpm，10min），棄上清。2）輕扣管底，混勻細胞，37℃水浴3）60s內(nèi)滴加0.6ml50％PEG，邊滴邊搖動試管，30s內(nèi)將細胞懸液吸入吸管靜置30s，再在30s內(nèi)緩慢轉(zhuǎn)入離心管；5min內(nèi)后加入10mlDMEM終止PEG作用。3）離心，棄上清，加15mLHAT培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)入96孔板（預(yù)先有HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)的飼養(yǎng)細胞），每孔100ul。4）37℃孵箱孵育，2-3天換HAT一次，持續(xù)2周3)細胞融合：第四十一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日細胞融合注意事項：1、細胞比例：脾細胞/瘤細胞約5-10/1。2、反應(yīng)時間：慢、轉(zhuǎn)、柔。3、反應(yīng)溫度：37℃，所有用液均需提前預(yù)熱。4、PEG選擇：分子量、濃度（30—50%間）。5、不要使用含有血清的培養(yǎng)基（PEG能引起蛋白質(zhì)沉淀）。第四十二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日2、HAT培養(yǎng)基的篩選融合后細胞混合液HAT培養(yǎng)基2weekslaterHT培養(yǎng)基正常培養(yǎng)基1weeklater第四十三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日HAT培養(yǎng)基篩選H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA內(nèi)源性途徑(主要途徑)谷氨酰胺or單磷酸尿苷酸二氫葉酸還原酶AHT外源性途徑(旁路途徑)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

(HGPRT

)胸腺嘧啶激酶

(TK)(Thymidinekinase)B淋巴細胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤細胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途徑(旁路途徑)第四十四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日（3）、雜交瘤細胞的篩選（抗體的檢測）一般在雜交瘤細胞布滿孔底1／10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則?？煽康暮Y選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。第四十五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標儀檢測技術(shù)原理：第四十六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日（4）、雜交瘤細胞的克隆培養(yǎng)克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細胞丟失。第四十七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日雜交瘤細胞的克隆培養(yǎng)常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法80個細胞/96孔飼養(yǎng)細胞(feedercells)ELISA法檢測單克隆雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。第四十八頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日1）、有限稀釋法有限稀釋法原理是從理論上將細胞稀釋到10個/ml，然后裝成每小孔(96孔板)0.1ml，使每孔理論上含有單個細胞，經(jīng)過培養(yǎng)后即可獲得單個細胞形成集落。有時為了加快克隆細胞生長速度，常采用腹腔巨噬細胞做飼養(yǎng)層細胞。第四十九頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日1.取1.0ml5×104ml細胞+4ml培養(yǎng)基稀釋，得1×104/ml.2.取0.5ml1×104ml細胞液+9.5ml培養(yǎng)基稀釋，得1×103/ml.3.取1.0ml1×103ml細胞液+9.0ml培養(yǎng)基稀釋，得1×102/ml.有限稀釋法舉例：

第五十頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日2）軟瓊脂培養(yǎng)法：本法對于某些抗原，可以把克隆化培養(yǎng)與特異性篩選測定結(jié)合起來進行，所以它的特點是效率較高，速度較快。但缺點是克隆率不高。第五十一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日利用單個細胞在軟瓊脂培養(yǎng)基上的局限化生長，待細胞集落長到肉眼可見后，用巴氏吸管從瓊脂上挑出來(一般8—10天后)，再移到液體培養(yǎng)基中，進行生長繁殖，并檢測培養(yǎng)上清液的活性?；驹淼谖迨摚擦?，編輯于2023年，星期日飼養(yǎng)細胞

在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，需要加入飼養(yǎng)細胞。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞(較為常用)、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞。

第五十三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日飼養(yǎng)層細胞的作用提高培養(yǎng)細胞的密度，使待克隆細胞容易生存與繁殖。腹腔細胞能清除培養(yǎng)中的死亡細胞，從而促進單個細胞克隆的生長。飼養(yǎng)細胞能釋放諸如細胞生長因子類物質(zhì)，起到促進細胞分裂、增殖的作用。第五十四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日目的：保種。方法：離心收集雜交瘤細胞懸液，用含10％DMSO和10％FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若長期保存，則從冰盒轉(zhuǎn)入液氮中。復(fù)蘇：如果凍存的細胞是來自96孔板的一孔，復(fù)蘇后也應(yīng)接種到96孔板的一個孔中（5）雜交瘤細胞的凍存與復(fù)蘇第五十五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日

大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水。（6）單克隆抗體的大量生產(chǎn)第五十六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日腹水的制備

常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。第五十七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期日回顧：1）免疫脾細胞的制備2）骨髓瘤細胞的培養(yǎng)與篩選3）細胞融合（關(guān)鍵）4）HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞5）陽性克隆的篩選（盡早、反復(fù)原則）6）克隆