牛血清白蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線課件

實驗一

還原糖的測定（3,5-二硝基水楊酸比色法）

東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院

實驗室安全守則

一、實驗課規(guī)則

1、實驗室是師生進行實驗教學(xué)的活動場所，學(xué)生進入實驗室后要保持肅靜，遵守紀(jì)律。提前5分鐘進入實驗室。

2、做實驗前，認真聽教師講解實驗?zāi)康?，步驟，儀器的性能操作方法和注意事項、認真檢查所需儀器設(shè)備，藥品是否齊全、完好，如有缺損要及時向教師報告。

3、實驗時要遵守操作規(guī)程，按照實驗步驟認真操作，嚴(yán)禁違規(guī)操作，嚴(yán)禁未經(jīng)教師指導(dǎo)、許可私自操作。實驗必須按步驟進行，并仔細觀察，做好記錄，課后及時寫好實驗報告。

4、實驗過程中如發(fā)生故障或異常情況，應(yīng)及時報告老師，防止意外事故發(fā)生。

5、應(yīng)愛護實驗器材，愛惜藥品，不隨意玩弄器材藥品。實驗完畢，應(yīng)及時洗滌器皿，并把器材、藥品按規(guī)定位置放好，嚴(yán)禁私自帶走器材、藥品。

6、實驗結(jié)束，要將儀器整理成洗凈，保持桌面，室內(nèi)的整潔，認真清理儀器設(shè)備，關(guān)閉水源電源。由老師檢查后才能離開。

實驗室安全守則

二、安全用電原則：

1、不要私自連接實驗桌上的插頭、插座．不要私自拆卸實驗桌上的插頭、插座。

2、使用學(xué)生電源時，打開開關(guān)之前檢查是否已將用電器連入電路中，如果沒有，須重新連接電路。

3、如果發(fā)現(xiàn)電線絕緣層已損壞，須告知實驗老師，切不可用手直接接觸。

三、使用化學(xué)藥品制度：

1、取用固體化學(xué)藥品用藥匙，不可用手拿。

2、取用少量液體藥品用滴管，大量使用時口對口傾倒，一定要膽大心細。如不慎手上粘有藥品。應(yīng)立即用水沖洗。

3、如果不慎將腐蝕性試劑滴到手上，應(yīng)立即用抹布擦干，再用大量的水清洗。若不慎濺入眼中，應(yīng)立即用清水沖洗，并告知實驗老師。

一、目的

?掌握還原糖定量測定的基本原理；

?學(xué)習(xí)比色定糖法的基本操作；

?熟悉分光光度計的使用方法。

二、原理

還原糖：具有還原性的糖類。分子中含有游離醛基或羰基的單糖和含有游離醛基的二糖都具有還原性。常見的有葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖等；

堿性條件

還原糖＋3,5-二硝基水楊酸

加熱

3-氨基-5-硝基水楊酸＋糖酸

在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度成一定的比例關(guān)系（540nm波長吸收）；

淀粉中所含各種單糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖；利用溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來；

三、實驗材料、儀器、試劑

實驗材料：面粉

儀器：

1、25mL刻度試管(9個);2、大離心管(2個);3、100mL燒杯(1個);4、100mL容量瓶(1個);5、1mL,2mL,20mL刻度吸管各一個;6、恒溫水浴鍋;7、離心機;8、電子天平;9、分光光度計;

試劑:（1）1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖，置于小燒杯中，用少量蒸餾水熔解后，定量轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）3,5-二硝基水楊酸試劑：將6.3g3,5二硝基水楊酸和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。

四、實驗步驟

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：

取7支試管，編號，按表1-1所示的量，精確加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3,5－二硝基水楊酸及蒸餾水，搖勻，沸水浴中加熱5min，取出后立即用冷水冷卻至室溫，再向每管加入21.5mL蒸餾水，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻，在540nm波長下，用0號管調(diào)零，分別讀取1～6號管的吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

項目

管號

0葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(mL)蒸餾水(mL)3,5－二硝基水楊酸試劑(mL)02.01.510.21.81.520.41.61.530.61.41.540.81.21.551.01.01.561.20.81.5?樣品中還原糖的提?。?/p>

稱取3g食用面粉，放在100mL的燒杯中，先以少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加50mL蒸餾水，攪勻，置于50oC恒溫水浴中保溫20min，攪拌，使還原糖浸出，離心（4000rpm10min），用20mL蒸餾水洗，混勻殘渣，再離心，將兩次離心的上清液全部收集在100mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，混勻，作為還原糖待測液。

?顯色和比色：

取2試管，編號，按表1-2所示的量，精確加入待測液和試劑。加完試劑后，其余操作均與制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時相同，測定各管吸光值。

表1-2還原糖含量的測定

項

目

編號

還原糖待測液（mL）

蒸餾水（mL）

3,5－二硝基水楊酸試劑(mL)還原糖測定管號

①

②

22001.51.5五、結(jié)果與計算——實驗數(shù)據(jù)記錄表

測定次數(shù)

各管A值（吸光度）

1234567123平均值

用各管平均A值（吸光度）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

五、結(jié)果與計算

?以管①、②的吸光值平均值，分別利用標(biāo)準(zhǔn)曲線所求得的公式計算出還原糖毫克數(shù)，按下式計算出樣品中還原糖的百分含量。

提取液總體積查曲線所得還原糖毫克數(shù)?測定時取用體積還原糖%??100樣品毫克數(shù)思考題

1．使用紫外分光光度計時應(yīng)注意哪些事項？

2．思考在沒有離心機的情況下怎樣設(shè)計一套方案完成本實驗?

3．為什么標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品含糖量測定應(yīng)同時進行，一起顯色和比色？

4．關(guān)于糖的測定除了本實驗中涉及的水楊酸比色法還有另一種蒽酮比色定糖法，查找相關(guān)資料，比較兩種方法有何異同？

實驗二

可溶性糖的硅膠G薄層層析

東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院

一、目的

?了解薄層層析的一般原理；

?掌握硅膠G薄層層析的基本技術(shù)及其在可溶性糖分離鑒定中的應(yīng)用。

二、原理

植物組織中的可溶性糖可用一定濃度的乙醇提取出來，并可通過一定的手段，去除蛋白質(zhì)，獲得較純的可溶性糖的混合液。

糖為多羥基化合物，具有較強的極性，在硅膠G層上遷移時，與硅膠分子間有一定吸附力，糖羥基多少不同，與硅膠吸附力存在差異，該吸附力的大小順序為：三糖＞二糖＞已糖＞戊糖。

極性不同的糖在硅膠G層上展層時，遷移率(Rf)不同，通過與已知糖的Rf相比較，可分離鑒定植物樣品提取液中糖的種類。

三、實驗材料、儀器、試劑

實驗材料：蘋果

儀器：1、離心機及大離心管；23、研缽；45、量筒：25mL,10mL；7、層析缸；89、玻璃板7.5×15cm；

、藥物天平；

、蒸發(fā)皿；

、恒溫水浴鍋；

、微量點樣管(毛細管)；

、吹風(fēng)機、噴霧器、烘箱；

610

試劑

（1）95%乙醇

（2）80%乙醇

（3）10%Pb(Ac)2

（4）飽和Na2SO4

（5）氯仿

（6）冰乙酸

（7）1%標(biāo)準(zhǔn)糖溶液(10mg/mL)：木糖，果糖，葡萄糖，蔗糖（8）苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑：2g二苯胺，加2mL苯胺，酸，1mLHCl，100mL丙酮，溶后搖勻，置于棕色瓶中。

10mL85%磷

四、實驗步驟

1．硅膠G薄板的制備

稱取硅膠G粉3.5g，羧甲基纖維素納0.03g，加入0.1M硼酸溶液9-12mL，于研缽中充分研磨，待硅膠G開始變稠時,

傾入玻璃板上(7.5×15cm)，快速鋪板，并震蕩均勻，鋪層后的薄板放置在實驗臺上，用前于110oC烘箱中活化1h。

實驗步驟

2．蘋果中可溶性糖提取液的制備：

洗凈蘋果，去果皮，稱5g果肉，在研缽中將果肉磨成勻漿，裝入大離心管中，用20mL95%乙醇，洗滌研缽，洗滌液加入離心管中，浸提30min，然后3500rpm，離心10min，上清液傾入另一大離心管中，殘渣加5mL80%乙醇洗滌，離心取上清液。重復(fù)兩次，合并上清液，于70oC水浴上預(yù)熱上清液，趁熱逐滴加入10%中性醋酸鉛溶液，沉淀蛋白質(zhì)。然后再逐滴加入飽和硫酸鈉，沉淀多余的鉛，3500rpm，離心10min，收集上清液，放入蒸發(fā)皿中，飄在水浴鍋中。于70oC水浴上蒸干，析出物質(zhì)以3～5mL蒸餾水溶解，即得糖抽提液。

實驗步驟

3．蘋果提取液中可溶性糖的分離鑒定：

取活化過的硅膠G玻板一塊，在距底邊1.5cm水平線上確定5個點，相互間隔1cm，其中4個點分別點上木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，另一個點點上蘋果提出液適量，以氯仿∶冰乙酸∶水=30∶35∶5為展層劑，將玻璃板放入層析缸中展層。當(dāng)展層劑前沿達距薄板頂端約1cm處，停止層析，取出玻璃板以吹風(fēng)機吹干。然后以苯胺-二苯胺-磷酸噴霧，于85oC烘箱中烘10min，各種糖即顯出不同顏色，與標(biāo)準(zhǔn)糖比較，根據(jù)色斑顏色及Rf值即可鑒定出蘋果提取液中所存在的可溶性糖種類。

五、結(jié)果與計算

?顯色后照相或繪圖記錄層析圖譜，也可用CS-930進行掃描其展層圖譜。

Rf（值）=溶質(zhì)斑點中心到點樣點的距離

溶劑前沿到點樣點的距離

思考題

1．本實驗中薄層層析的原理是什么?2．影響Rf值的因素有哪些？

3．根據(jù)薄層層析原理，選擇展層溶劑時應(yīng)注意些什么？

4．查找相關(guān)資料，熟悉用薄層層析方法分離各類物質(zhì)常用的固定相、流動相和顯色劑？

實驗三

酵母核糖核酸的提取

東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院

一、目的

?學(xué)習(xí)和掌握從酵母中提制RNA的原理和方法，從而加深對核酸性質(zhì)的認識；

二、原理

酵母核酸中主要是RNA(2.67～10.0%)，DNA很少(0.03～0.516%)，而且菌體容易收集，RNA也易于分離。

RNA提取方法：先使利用高濃度的鹽改變細胞膜的通透性，使RNA從細胞中釋放，并使它和蛋白質(zhì)分離，再根據(jù)核酸在等電點時溶解度最小的性質(zhì)，將pH調(diào)至2.0～2.5，使RNA沉淀，進行離心收集。

該方法提取RNA時應(yīng)注意掌握溫度，避免在20～27oC之間停留時間過長，因為磷酸二酯酶和磷酸單酯酶在該溫度范圍活性較高，會使RNA降解進而降低提取率。

加熱至90～100oC可使蛋白質(zhì)變性，破壞該類酶，有利于RNA的提取。

三、實驗材料、儀器、試劑

實驗材料：干酵母

儀器：1、50mL量筒；2、100mL燒杯；

3、250mL，50mL，10mL燒杯；

4、40mm布氏漏斗；5、125mL吸濾瓶；

6、6cm表面皿；7、UV-5200紫外分光光度計；

8、離心機；9、恒溫水浴；

11、烘箱

10、藥物天平；

試劑

（1）（2）（3）

（化學(xué)純）

乙醇（化學(xué)純）NaCl6mol/LHCl95%

四、實驗步驟

1．RNA提取

稱取干酵母粉5g，倒入100mL燒杯中，加NaCl5g，水50mL，攪拌均勻，置于沸水浴中提取1h。

2.RNA與菌體分離

將上述提取液取出，用自來水冷卻，裝入大離心管內(nèi)，以3500rpm離心10min，留取上清，使提取液與菌體殘渣等分離。

實驗步驟

3．沉淀RNA

將離心得到的上清液傾于100mL燒杯中，并置于放有冰塊的250mL燒杯中冷卻，待冷至10oC以下時，用6mol/LHCl小心地調(diào)節(jié)pH至2.0～2.5，隨著pH下降，溶液中白色沉淀逐漸增加，至等電點時沉淀量最多（注意嚴(yán)格控制pH），調(diào)好后繼續(xù)于冰水中靜置10min，使沉淀充分，顆粒變大。

實驗步驟

4．洗滌和抽濾

上述懸浮液以3500rpm離心10min，得到RNA沉淀，將沉淀物放在10mL小燒杯內(nèi)，用95%的乙醇5～10mL充分攪拌洗滌，在布氏漏斗上用水泵抽氣過濾后，用95%乙醇5～10mL淋洗3次。

由于RNA不溶于乙醇，洗滌不僅可脫水，使沉淀物疏松，便于過濾、干燥，而且可除去可溶性的脂類及色素等雜質(zhì)，提高了制品的純度。

實驗步驟

5．干燥

從布氏漏斗上取下沉淀物，放在表面皿上，鋪成薄層，置于80oC烘箱內(nèi)干燥（約10min)，將干燥后的RNA制品稱重。

6．含量測定

將干燥后的RNA產(chǎn)品用500mL容量瓶定容，配制成濃度為40～80μg/mL的溶液，用蒸餾水作空白，在分光光度計上測定其260nm處的吸光度，如果產(chǎn)物較多超過范圍,可以定容后再稀釋,但是計算時要乘上稀釋倍數(shù)

五、結(jié)果與計算

?按下式計算RNA含量

A260RNA溶液總體積(ml)RNA含量(%)???稀釋倍數(shù)?1000.024?LRNA稱取量(?g)式中：A260為260nm處的吸光度；L為比色杯光徑（cm）；0.024為1mL溶液含1μg

RNA的吸光度。?根據(jù)含量測定的結(jié)果按下式計算提取率：

RNA含量(%)?RNA制品重(g)RNA提取率(%)?酵母重(g)思考題

1.本實驗為什么選擇酵母作為提取RNA的材料？

2．用濃鹽法提取RNA的原理是什么？

3．提取制備RNA常用的方法是哪幾種？各自原理？有何優(yōu)點？

4．制備RNA應(yīng)注意哪些問題？

實驗四DNA瓊脂糖凝膠電泳

東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院

一、目的

?學(xué)習(xí)并掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作；

?通過DNA瓊脂糖凝膠電泳可知DNA的純度、含量和相對分子質(zhì)量。

二、原理

瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學(xué)中最常用DNA分離和鑒定方法，根據(jù)不同構(gòu)像和分子量的DNA在瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同進而對DNA進行分離和鑒定。

DNA分子在高于其等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。

?DNA分子在瓊脂糖凝膠中的泳動速度與電荷、分子大小及構(gòu)象有關(guān)。由于構(gòu)成DNA的糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此能以同樣的速度向正極移動。泳動速度與DNA分子相對分子質(zhì)量的對數(shù)成反比；

?DNA分子的構(gòu)象也影響其遷移速度，同樣相對分子量的DNA，超螺旋共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA遷移速度最快，線狀DNA其次，開環(huán)DNA最慢。

瓊脂糖含量/%

0.5

0.7

最佳線性DNA分辨范圍

1～30kb

0.8～12kb

1.01.2

1.5

2

0.5～10kb400～7000bp

200～3000

50～2000

?觀察瓊脂糖凝膠中DNA的最簡便方法是利用熒光染料溴乙錠染色，EB在紫外燈照射下，發(fā)出紅色熒光。當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，加入的EB插入DNA分子中形成熒光結(jié)合物，使發(fā)射的熒光增強幾十倍，熒光的強度正比于DNA的含量。

?GoldView?是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強的熒光信號，其靈敏度與EB相當(dāng)，在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而且也可用于染RNA。

?綜上所述，通過DNA瓊脂糖凝膠電泳可知DNA的純度、含量和相對分子質(zhì)量。

三、實驗材料、儀器、試劑

實驗材料：質(zhì)粒DNA，PCR產(chǎn)物

儀器：1、Eppendorf管2、Tip3、一次性手套4、移液器

5、錐形瓶6、量筒

7、微波爐8、穩(wěn)壓電泳儀

9、凝膠成像儀10、水平式電泳槽

11、天平12、制膠槽

試劑

（1）TAE緩沖液

40mMTris-乙酸鹽，1mMEDTA(pH8.0)（2）凝膠加樣緩沖液

0.2%溴酚藍，50%蔗糖

：稱取溴酚藍200mg，加重蒸水10mL，在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖50g，加重蒸水溶解后移入溴酚藍溶液中，搖勻后加重蒸水定容至100mL，加10MNaOH1～2滴，調(diào)至藍色。

（3）瓊脂糖

（4）

GoldView?

（5）DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品(DL2000marker)（6）質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物

四、實驗步驟

1．瓊脂糖凝膠的制備

稱取0.25g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入25mL1×TAE緩沖液，置微波爐或水浴鍋中加熱至完全溶化，取出搖勻（看不見顆粒，也可以邊加熱邊搖勻），瓊脂糖終濃度為1%。待瓊脂糖凝膠溶液冷卻至約50oC，再加入GoldView?，搖勻。

實驗步驟

2．凝膠板的制備

(1)將制膠槽置于水平位置。

(3)選擇孔徑適宜的梳子，垂直架在有機玻璃內(nèi)槽的一端，使梳齒距玻璃板之間尚有約1.0mm的距離。

(4)將冷到50oC左右的瓊脂糖凝膠，緩緩倒入有機玻璃內(nèi)槽，厚度適宜(不要有氣泡)。

(5)待凝膠凝固后，小心取出梳子，將膠放入電泳槽內(nèi)，含上樣孔的一端位于負極。

(6)加入足夠的TAE電泳緩沖液，使液面略高出凝膠面。

實驗步驟

3．加樣

取4μL待測質(zhì)粒DNA，

加1μL溴酚藍指示劑，混勻后用移液器將其加入加樣孔(梳孔)，PCR產(chǎn)物直接取8μL加入上樣孔，marker5μL加入上樣孔記錄樣品點樣次序與點樣量。

4．電泳

(1)接通電泳槽與電泳儀電源(DNA片段從負極向正極移動)，DNA的遷移速度與電壓成正比。

(2)當(dāng)溴酚藍染料移動到距凝膠前沿約2cm處，停止電泳。

五、結(jié)果與計算

?在紫外燈下觀察凝膠，有DNA處應(yīng)顯出橘紅色熒光條帶。PCR產(chǎn)物

質(zhì)粒DNA記錄電泳結(jié)果或直接拍照。

思考題

1．制膠過程應(yīng)注意哪些問題？

2．結(jié)合實驗過程總結(jié)點樣的關(guān)鍵技術(shù)

3．你在紫外燈下都觀察到什么了?怎么解釋?

實驗五

用DNS法鑒定蛋白質(zhì)或多肽的N-端氨基酸

東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院

一、目的

?了解并掌握DNS-氨基酸聚酰胺薄膜層析鑒定蛋白質(zhì)或多肽的N-端氨基酸。

二、原理

DNS-Cl在堿性條件下與蛋白質(zhì)或多肽的N-端氨基結(jié)合生成DNS-蛋白質(zhì)或DNS-多肽，再經(jīng)酸水解可釋放出DNS-氨基酸，在紫外光照射下，產(chǎn)生強烈的黃色熒光，可用聚酰胺薄膜層析進行鑒定。

二、原理

DNS-Cl能與蛋白質(zhì)的側(cè)鏈基團巰基、咪唑基、ε-氨基（epsilon-氨基）和酚羥基反應(yīng)，前兩者在酸堿條件下均不穩(wěn)定，酸水解時完全破壞；DNS-ε-賴氨酸和DNS-O-酪氨酸較穩(wěn)定，同時還有DNS-雙-賴氨酸和DNS-雙-酪氨酸生成，展層后在層析圖譜的位點上，都與DNS-α-氨基酸有區(qū)別。

DNS-Cl在pH值過高時，水解產(chǎn)生副產(chǎn)物DNS-OH；DNS-Cl過量時，會產(chǎn)生DNS-NH2，在紫外光照射下，DNS-OH和DNS-NH2產(chǎn)生藍色熒光，而DNS-氨基酸產(chǎn)生黃色熒光，能明顯區(qū)分。

三、實驗材料、儀器、試劑

儀器：2

4

67

1、層析缸

、聚酰胺薄膜(7cm×7cm)3、電吹風(fēng)

、紫外燈

5、點樣管

、50mL離心管

、水浴鍋

試劑

（1）各種層析純標(biāo)準(zhǔn)氨基酸

（2）DNS-Cl丙酮溶液：稱取25mgDNS-Cl溶于10mL丙酮中，貯于棕色瓶中，1個月內(nèi)有效。

（3）1M氫氧化鈉

（4）展層劑：(Ⅰ)V(甲酸，88%)：V(蒸餾水)=1.5：100(Ⅱ)V(苯)：(冰醋酸)=9：1（5）溶解了氨基酸的碳酸氫鈉溶液：稱取2.5μmol層析純的氨基酸，溶于0.5mL0.2M碳酸氫鈉溶液。

四、實驗步驟

1．DNS-標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的制備

取2mL溶解了氨基酸的碳酸氫鈉溶液于50mL的大試管中，加入2mLDNS-Cl丙酮溶液，用1M氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.0～9.5，于室溫避光反應(yīng)2～4h，貯備于暗處。按后面所述的層析溶劑系統(tǒng)，做DNS-氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。

2．樣品的聚酰胺薄膜層析

取聚酰胺薄膜(7cm×7cm)一張，在距離相鄰邊緣各1.0cm處用鉛筆畫一相交直線，作為點樣原點（毛面）。用點樣管取上述DNS-氨基酸樣品液進行點樣，點樣直徑不超過2mm，可分幾次點完，每次點后用冷風(fēng)吹干再點下一次，吹干。

四、實驗步驟

3．展層

光面向外卷曲(兩邊不相接觸)，外扎牛皮筋。直立于盛有20mL展層劑的培養(yǎng)皿中，點樣點置下端，置于展析缸中展層。

先放置于展層劑(I)中，到展層劑距頂端約0.3cm時，取出吹風(fēng)機吹干(充分吹干)，然將膜翻轉(zhuǎn)90oC后放入展層劑(Ⅱ)為第Ⅱ向，到展層劑距頂端約0.3cm時，取出吹干，到紫外燈下照相。

五、結(jié)果與計算

?在紫外燈下觀察DNS-氨基酸的熒光斑點，對照標(biāo)準(zhǔn)圖譜，在相應(yīng)位置標(biāo)出氨基酸名稱。

思考題

1．DNS化測定N-末端的根據(jù)是什么？DNS化的最適pH值是多少？

2．DNS化的副產(chǎn)物是什么？如何除去？

3．DNS-Cl除能與α-氨基反應(yīng)外，還能與氨基酸的什么基團發(fā)生反應(yīng)？生成什么產(chǎn)物？

4．未知樣品（蛋白質(zhì)或肽）的N-末端氨基酸如何確定？

實驗六Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量

東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院

一、目的

??掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；

掌握制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的要領(lǐng)和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品溶液中待測定物質(zhì)含量的方法

。

?熟悉分光光度計的操作。

二、總蛋白測定經(jīng)典和常見的方法比較

方

法

凱氏定氮法

雙縮脲法

靈敏度

0.2～1.0mg氮

優(yōu)

點

準(zhǔn)確性好、精密度高、靈敏度高。

特異性高、準(zhǔn)確度性好、精密度高、操作簡單方便，顯色穩(wěn)定。

缺

點

操作復(fù)雜，費時

適用范圍

用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的定值、對其他方法校正等

為臨床測定血清總蛋白首選方法。

1～20mg靈敏度低

Lowry法

（Folin-酚法）

紫

外

分光光度法

考馬斯亮藍法

（Bradford）

5～250ug靈敏度高、達雙縮脲法的100倍。

干擾物質(zhì)多、操作要求嚴(yán)格計時

適用于測定單一蛋白質(zhì)及測定蛋白質(zhì)含量較少的標(biāo)本如腦脊液

常用于較純的酶和免疫球蛋白測定

常用于需求更高呈色靈敏度的蛋白電泳

50～100mg快速簡便、無損樣品

靈敏度低、干擾物較多

不同蛋白質(zhì)與染料結(jié)合力不一致，對比色杯有吸附作用

影響濁度大小因素多，如加試劑手法、反應(yīng)溫度等

1～5ug靈敏、簡便、快速，干擾因素較少

化學(xué)比濁法

簡便、不需特殊儀器

一般用于測定尿液、腦脊液等蛋白質(zhì)含量較低的樣品

三、原理

?1921年，F(xiàn)olin首創(chuàng)，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍色反應(yīng)。

?1951年，Lowry對此法進行了改進，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。

三、原理

Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：

第一步：雙縮脲反應(yīng)——蛋白質(zhì)肽鍵與銅離子形成絡(luò)合物

蛋白質(zhì)分子含有大量彼此相連的肽鍵（-CO-NH-），同樣能在堿性條件下與Cu2+發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成的紫紅色絡(luò)合物（蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物）。且在540nm處的吸光度與蛋白質(zhì)的含量在5～120g/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

三、原理

第二步：絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin試劑）還原，產(chǎn)生深藍色的磷鉬藍和磷鎢藍混合物；

Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍色反應(yīng)(鉬藍和鎢藍的混合物)。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸(Tyr)，故有此顯色反應(yīng)。即蛋白質(zhì)-Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍色的化合物。顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成線性關(guān)系（正比）。故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出蛋白質(zhì)的含量。

Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯以強度稍有不同。

四、實驗材料、儀器、試劑

實驗材料：綠豆芽

儀器：1、分光光度計

2、離心機

3、分析天平

4、容量瓶（50mL）

5、量筒

6、移液管（1mL、5mL）

試劑

（1）0.5MNaOH（2）試劑甲

（堿性硫酸銅溶液）

（A）稱取10gNa2CO3，2gNaOH和0.25g酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸餾水定容至500mL。

（B）稱取0.5gCuSO4?5H2O，溶解后用蒸餾水定容至100mL。

每次使用前將（A）液50份與（B）液1份，混合，即為試劑甲，其有效期為1天，過期失效。

試劑

（3）試劑乙

（Folin-酚試劑）

將100g鎢酸鈉(Na2WO4?2H2O)、25g鉬酸鈉(Na2MoO4?2H2O)、700mL蒸餾水、50mL85%磷酸及100mL濃鹽酸置于1500mL磨口圓底燒瓶中，混勻后，接上磨口冷凝管，回流10h。再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50mL及液溴數(shù)滴，開口煮沸15min，驅(qū)除過量的溴(在通風(fēng)櫥內(nèi)進行)。冷卻，稀釋至1000mL，過濾，濾液呈微綠色，貯于棕色瓶中，放置于冰箱中。

試劑

（4）牛血清白蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)液（250μg/mL）

在分析天平上精確稱取25mg結(jié)晶牛血清白蛋白，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，燒杯內(nèi)的殘液用少量蒸餾水沖洗數(shù)次，沖洗液一并倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，則配成250μg/mL的牛血清白蛋白溶液。

五、實驗步驟

綠豆芽中蛋白的提取及測定：

（1）準(zhǔn)確稱取綠豆芽1g，放入研缽中，加蒸餾水2mL，研磨。將勻漿轉(zhuǎn)入離心管，并用6mL蒸餾水分次洗滌研缽，并入離心管，4,000rpm離心20min，將上清液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，作為待測液備用。

（2）取普通試管2支，各加入待測溶液1mL，分別加入試劑甲（堿性硫酸銅溶液）5mL，混勻后放置10min，再各加試劑乙（Folin-酚試劑）0.5mL，迅速混勻，室溫放置30min，于650nm波長下測定吸光度，并記錄結(jié)果。

五、實驗步驟

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取6支普通試管，按表9-1加入標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛血清蛋白溶液和蒸餾水，配成一系列不同濃度的牛血清白蛋白溶液，然后各加試劑甲（堿性硫酸銅溶液）

5mL，混合后在室溫下放置10min，再各加0.5mL試劑乙（Folin-酚試劑），立即混合均勻。30min后，以不含蛋白質(zhì)的1號試管為對照，用分光光度計于650nm波長下測定各試管中溶液的吸光度值并記錄結(jié)果。以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表9-1牛血清白蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

試

劑

250μg/mL牛血清白蛋白

(mL)蒸餾水

(mL)管

號

101.020.20.830.40.640.60.450.80.2610蛋白質(zhì)含量

(μg)050100150200250六、注意事項IFolin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。

故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。

七、結(jié)果與計算——實驗數(shù)據(jù)記錄表

各管A值（吸光度）

測定次數(shù)

112345623平均值

用各管平均A值（吸光度）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

七、結(jié)果與計算

?計算出兩重復(fù)樣品吸光度的平均值，根據(jù)未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中計算出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量；

?再按下列公式計算樣品中蛋白質(zhì)的百分含量。

樣品中蛋白質(zhì)含量(%)?X(μg)?稀釋倍數(shù)樣品重(g)?106?100九、思考題

1．Folin-酚法的原理是什么？

2．有哪些因素可干擾Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量？

3．為什么Folin-酚試劑乙要迅速混勻？

4．實驗過程中那些環(huán)節(jié)應(yīng)該特別注意？

實驗七

用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量

東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院

一、目的

?掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量的原理;??學(xué)會安裝和使用垂直板型凝膠電泳裝置;應(yīng)用垂直型、SDS不連續(xù)系統(tǒng)凝膠電泳法、測定蛋白質(zhì)的分子量。

二、原理

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法

(SDS)是一種基于蛋白質(zhì)在電場驅(qū)動下，具有不同的移動能力進而對其進行分離的技術(shù)，與蛋白質(zhì)多肽鏈的長度或分子量相關(guān)。

影響帶電粒子電泳的內(nèi)在因素有三點：分子所帶凈電荷、分子量大小和分子的形狀。

十二烷基硫酸鈉(SodiumDodecylSulfate,SDS)，是一種很強的陰離子表面活性劑，SDS以其疏水基和蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合，形成牢固的帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物；

SDS和蛋白質(zhì)的結(jié)合是高密度的，其重量比通常為1.4∶1，這種高密度結(jié)合，遠遠超過了蛋白質(zhì)原有的凈電荷，從而消除了由于蛋白質(zhì)所帶凈電荷的不同而對電泳遷移率產(chǎn)生的影響。

二、原理

由于SDS-蛋白質(zhì)的復(fù)合物具有均一的電荷密度和荷質(zhì)比，目前認為，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物具有扁平，緊密的橢圓形或棒狀結(jié)構(gòu)，棒的短軸是恒定的，數(shù)量級在18?左右，與蛋白質(zhì)的種類無關(guān)，棒的長軸是變化的，而長軸的變化正比于蛋白質(zhì)的分子量，因此SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合后所形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，消除了由于天然蛋白質(zhì)形狀的不同而對電泳遷移率的影響。

由于SDS和蛋白質(zhì)的結(jié)合，消除了分子自身凈電荷及分子形狀兩個因素的影響，使其電泳遷移率在外界條件固定的情況下，僅取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，因而可通過與已知分子量的蛋白質(zhì)分子遷移率進行比較，求出未知蛋白質(zhì)的分子量。

二、原理

常用的凝膠SDS系統(tǒng)由濃縮凝膠和分離膠構(gòu)成，濃縮膠其丙烯酰胺濃度為4-5%，分離膠濃度為8%-15%，濃縮膠的目的是讓樣品在濃縮層和分離層的界面壓縮到一個超薄的區(qū)域（1-100nm），然后在進入分離膠對蛋白進行分離。

壓縮原理：由于濃縮膠pH是6.8較低，甘氨酸在這里呈兩性離子狀態(tài)存在，所以這一層的離子強度較低，因此電阻較高，進而形成高電場力，使蛋白質(zhì)的在堆集層的遷移速率高于分離層。同時由于濃縮膠孔徑大，對一般蛋白質(zhì)的遷移速率不造成影響；

因此當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)到達堆積層和分離層邊界時，分離層孔徑小，首先到達邊界的蛋白質(zhì)速率便減慢，而后來的蛋白質(zhì)仍然保持高速率遷移，便使得蛋白質(zhì)在邊界處堆積濃縮。

三、實驗材料、儀器、試劑

實驗材料：蛋白質(zhì)

儀器：1、垂直板電泳槽一套

2、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀

3、移液器

4、水浴鍋

5、

燒杯

試劑

（1）丙烯酰胺(Acr)凝膠貯液：22.2gAcr，0.6g甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解并定容到100mL，過濾后避光保存，4oC下可貯藏1-2個月。

（2）10%的SDS溶液

（3）10%的過硫酸銨溶液

（4）四甲基乙二胺(TEMED)溶液

（5）分離膠緩沖液：1.5mol/LpH8.8的Tris-鹽酸緩沖液，將18.15gTris用水溶解后，用6mol/L的鹽酸調(diào)至pH8.8定容到100mL。

（6）濃縮膠緩沖液：0.5mol/LpH6.8的Tris-鹽酸緩沖液，將6gTris溶解后，用6mol/L的鹽酸調(diào)至pH6.8，然后定容到100mL。

試劑

（7）電極緩沖液：將6gTris，28.8g甘氨酸和1gSDS加水溶解后，定容到1000mL，pH應(yīng)為8.3。

（8）樣品緩沖液(2x)：將1gSDS，2mLβ-硫基乙醇，5mL甘油，1.0mL0.1%溴酚蘭和1mL試劑6，用水溶解并稀釋到50mL。

（9）0.1%溴酚蘭溶液

（10）已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（marker)（11）未知分子量的蛋白質(zhì)樣品

（12）考馬斯亮蘭染色液，稱取0.25g考馬斯亮蘭R250加入45mL甲醇，10mL冰醋酸和45mL水。

（13）脫色液：37.5mL冰醋酸，25mL甲醇加水到500mL。

四、實驗步驟

1．電泳槽的安裝：玻璃板先用洗液浸泡，洗滌干凈，然后用水沖洗去除洗滌劑，再用蒸餾水沖洗，直立干燥。將干燥的玻璃板裝入制膠架中，再插入三角形支架，安放在制膠底座上，將制膠底座上的旋鈕旋到相應(yīng)的位置（1.5mm厚的膠旋到1.5，1mm厚的膠旋到1.0)。

2.樣品處理：蛋白液：樣品緩沖液（v:v)=1:1混勻，總體積1mL。

在沸水浴中加熱3-5min，蛋白質(zhì)在SDS和β-硫基乙醇的作用下，變性，變成緊密的棒狀SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

凝膠制備：

?分離膠：按表12-1的配比制備分離膠(10%)。將Acr、水、tris緩沖液(pH8.8)、SDS，過硫酸銨和TEMED按表中的順序和量加入到燒杯中，并混勻，混勻后將凝膠液沿玻壁緩緩地注入凝膠板中，注膠過程應(yīng)防止氣泡的產(chǎn)生，膠液加到距玻璃板頂部1.5-2cm處，立即用移液槍緩慢水平注入蒸餾水（或者異丙醇)。靜置30min后，去掉水層，并用濾紙吸干水滴。

?濃縮膠：按照表12-1的配方制備濃縮膠。將Acr、水、tris緩沖液(pH6.8)、SDS，過硫酸銨和TEMED按表中的順序和量比例加入到燒杯中，混勻，將膠液注入已吸去上層水的分離膠上，注滿，然后立即將梳子插入凝膠板中，靜置約30min后，小心地取出梳子。旋開旋鈕，將制膠架從底座中取出，整個裝置放入電泳槽中，向兩槽內(nèi)注入電泳緩沖液。

點樣：

用微量注射器分別吸取marker10μL,樣品20μL，分別注入到濃縮膠的上樣孔中。

電泳：接通電源，立即電泳。紅色電源線接入正極，黑色電源線插入負極，濃縮膠電壓80v，當(dāng)溴酚藍遷移到界面時，電壓換為140v，繼續(xù)電泳，直到溴酚藍到達凝膠底部，停止電泳。

染色：將凝膠板從電泳槽中取出，去掉濃縮膠，剝下凝膠，利用自來水簡單沖洗凝膠后，將凝膠放入染液中，于30oC下染色約30min，以凝膠整體變藍為宜。

脫色：染色后的凝膠用水沖洗去表面的染料，放入脫色液中，于37oC下脫色，脫色約需24h以上，其間要常更換脫色液。

五、結(jié)果與計算

與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量相比較，大約算出未知樣品的分子量。

電泳后凝膠

染色后凝膠

思考題：

1．SDS－PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理是什么？

2．本實驗是否需在低溫下進行？

3．樣品溶解液中各種試劑的作用是什么？

4．影響實驗誤差可能的原因是什么？根據(jù)你的實驗進行分析。

實驗八

硝酸還原酶活性的測定

東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院

一、目的

?硝酸還原酶是植物中硝酸鹽同化步驟的第一個酶，也是限速酶，處于植物氮代謝的關(guān)鍵位置，它與作物吸收利用氮肥有關(guān)，對農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響，因而硝酸還原酶活力被當(dāng)作植物營養(yǎng)或農(nóng)田施肥的指標(biāo)之一，也可作為品種選育的指標(biāo)之一。

?通過本實驗可以初步掌握測定硝酸還原酶活性的原理和方法。

二、原理

硝酸還原酶可將NO3—還原成NO2—，

NO2—的生成量與硝酸還原酶NR活性相關(guān)。NO2—含量可用磺胺顯色法測定，即在酸性條件下NO2—與對-氨基苯磺酰胺發(fā)生重氮化反應(yīng)，生成的重氮化合物又與N-萘基乙二胺鹽酸鹽生成紅色偶氮化合物，可在540nm下比色測定。

紅色偶氮化合物

二、原理

硝酸還原酶活性一般采用活體法或離體法測定。離體法需將材料磨成勻漿，經(jīng)過濾或離心除去殘渣，以上清液為NR粗酶液進行測定，由于研磨中NADH受損失，必須外加NADH方可測定?；铙w法直接用鮮活組織進行測定，環(huán)境中的NO3—進入細胞后，被NR還原成NO2—

，NO2—又擴散到細胞外并在溶液中積累，測定溶液中NO2—的含量即可得知NR活性的大小，活體法不破壞細胞原有的酶反應(yīng)系統(tǒng)，NADH可由代反應(yīng)不斷生成，無需外加?；铙w法簡便、快速，不需要貴重儀器設(shè)備及低溫條件，但重復(fù)性欠佳，應(yīng)做一定數(shù)量的重復(fù)。本實驗采用活體法。

三、實驗材料、儀器、試劑

實驗材料：

植物的葉、莖、根、發(fā)芽種子、離體的胚、培養(yǎng)細胞等，均可作提取硝酸還原酶NR的材料。本實驗選用發(fā)芽5～6天的小麥幼苗葉片。取樣前須將幼苗移入0.05MKNO3溶液中（pH約6.0）誘導(dǎo)24h，并在取樣前照光3h，切勿在暗期中取樣。

儀器：1、紫外分光光度計

2、真空泵和真空干燥器

3、恒溫水浴

4、刻度吸管（0.5mL，1mL，2mL）

5、天平

6、離心機

試劑

（1）0.1MKNO3：稱取3.03gKNO3溶于300mL0.1MpH7.5的磷酸緩沖液中。

（2）1%磺胺：稱取1g磺胺（NH2C6H4SO2NH2），溶于100mL3MHCl中。

（3）0.02%N-1-萘乙二胺鹽酸鹽：取0.02gN-1萘乙二胺鹽酸鹽（C12H14N2?2HCl）溶于100mL蒸餾水中，盛于棕色瓶避光保存。

（4）30%三氯乙酸：30g三氯乙酸溶于100mL蒸餾水中。

（5）NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液：精確稱取1gNaNO2用蒸餾水溶解后定容至1000mL，然后吸取5mL，再用蒸餾水稀釋成1000mL，即為濃度5μg/ml的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液。

四、實驗步驟

1．活體法測定硝酸還原酶活性

將小麥幼苗葉片洗凈、擦干，剪成0.5cm的段，稱取鮮樣4份，每份1g，分別放入4個編號的試管。1號管先加1.0mL30%三氯乙酸，再向各管分別加入9.0mL0.1MKNO3溶液，混勻，放入真空干燥器，抽氣、放氣數(shù)次，以排出組織間隙的氣體，使底物溶液進入組織，當(dāng)所有的葉片都浸入溶液之后，將試管置暗處25oC下保溫30min，取出試管，向2號管各加1mL30%三氯乙酸終止酶促反應(yīng)。吸取2mL上清液于另一試管，各加2mL1%N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶液，1%磺胺2mL，室溫顯色20min后，540nm波長下測定，用2、3、4號管吸光度平均值與1號管（對照）吸光度之差，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的NaNO2含量（μg），然后代入公式計算。

2．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取8支干凈試管，編號，按表14-1所示試劑：

表14-1NO2含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

試

劑

NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液(mL)蒸餾水(mL)每個試管中NaNO2含量(μg)

1%磺胺(mL)N－萘乙二胺鹽酸鹽(mL)管

號

102.002220.41.622230.81.24搖勻

2222222241.20.8651.60.4862.0010搖勻，室溫下放置20min后，在540mm波長下測定。以NaNO2含量（μg）為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

五、結(jié)果與計算——實驗數(shù)據(jù)記錄表

各管A值（吸光度）

測定次數(shù)

123456123平均值

用各管平均A值（吸光度）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

五、結(jié)果與計算

?把在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的NaNO2含量代入正式計算硝酸還原酶活性：

NaNO2含量(μg)?稀釋倍數(shù)NR活性[NaNO2

(μg)/鮮重(g)?小時]＝

樣品重(g)?時間(小時)

?式中稀釋倍數(shù)對于活體法，指酶促反應(yīng)液體積（10mL）與顯色取用體積（2mL）之比，即等于5。

附注：

（1）無機磷對硝酸還原酶活力有促進作用，因此常用磷酸緩沖液。

（2）活體法酶促反應(yīng)在暗條件下進行，以防光照下葉綠體形成還原型鐵氧還蛋白，促使亞硝酸還原酶把NO2還原成NH3。

（3）提取緩沖液中加入半胱氨酸為的是保護酶分子中的巰基使之不易失活。

思考題：

1．測定硝酸還原酶依據(jù)的原理什么？

2．測定硝酸還原酶的材料為什么要提前一天施用一定量的硝態(tài)氮肥，并且取樣應(yīng)該在晴天進行？

3．測定硝酸還原酶活性的離體法和活體法各有何特點？

4．提取緩沖液中為什么加入半胱氨酸？

實驗九

凝膠層析法分離提取

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶

東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院

一、目的

?掌握凝膠層析法原理；

?學(xué)習(xí)用凝膠層析法分離提取1,5-二磷核酮糖羧化酶的操作方法和實驗技術(shù)。

二、原理

凝膠層析，又叫分子篩層析，是一種液相層析，機理是分子篩效應(yīng)。凝膠層析是指混合物（溶液）隨流動相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時，混合物中各種物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。其中的流動相一般是緩沖液或其它特定的溶液，固定相是一類具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如葡萄糖凝膠、瓊脂糖凝膠等。

適用于蛋白質(zhì)純化，蛋白的濃縮和脫鹽，被廣泛用于蛋白質(zhì)的分離純化中。二、原理

分離原理：當(dāng)含有各種物質(zhì)的樣品溶液緩慢流經(jīng)凝膠析柱時，各物質(zhì)在柱內(nèi)同進行著兩種不同的運動，垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質(zhì)由于直徑很大，隨洗脫溶液一起移動，所以向下移動的速度較快；較小分子量的物質(zhì)既可以在凝膠顆粒間隙中擴散，還會進入到凝膠顆粒的微孔中進行擴散，因此使得小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使得樣品的物質(zhì)按分子量的大到小順序流出柱外而得到分離。分離效果常用洗脫曲線表示。

二、原理

商品名稱：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖殘基通過α－1，6糖苷鍵連接而成，葡聚糖分子之間通過醚橋（甘油基）交聯(lián)形成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；不溶于水，親水性很強，由于它的分子中存在許多羥基，在水本實驗中采用的葡聚糖凝膠，是凝膠層析法中使用最廣泛的一類層析凝膠，中吸水形成凝膠并劇烈膨脹，從而能起分子篩的作用，以此來分離不同分子量的物質(zhì)。

本實驗用凝膠層析法分離提純1,5-二磷酸核酮糖羧化酶，該酶是光合作用中的重要酶系，其分子量約為5×105-6×105，由大小兩種亞基組成，在葉綠體中1,5-二磷核酮糖羧化酶（RuBp羧化酶）含量很多，約占葉綠體間質(zhì)蛋白的50%以上。

三、實驗材料、儀器、試劑

實驗材料：菠菜葉

儀器：1、Sephadex凝膠層析柱1套2、組織搗碎機一臺

3、離心機一臺4、自動收集器一臺

5、紫外檢測儀6、恒溫水浴一臺

7、不銹鋼剪刀一把8、蠕動泵一臺

9、天平10、紗布

11、硅膠管12、橡膠管

13、100mL量筒一支，5mL移液管一支，1mL移液管2支，250mL、500mL燒杯各一支

、100mL試劑

（1）Tris-HClpH7.4(包括兩種)①緩沖液A：內(nèi)含0.05mol/LTris-HCl，1.0mol/LNaCl，1mmol/LEDTA，0.002mol/LMgCl2，0.08mol/Lβ-巰基乙醇。

②緩沖液B：內(nèi)含25mmol/LTris-HCl，0.2mol/LNaCl，0.5mmol/LEDTA（2）(NH4)2SO4

（3）SephadexG50四、實驗步驟

1．粗酶提取液的制備(所有學(xué)生分四組)

取無病新鮮菠菜展開葉50g，洗凈后用濾紙吸干水，剪碎，加入緩沖液A100mL，用組織搗碎機搗成勻漿，用4層紗布擠壓過濾，濾液置于燒杯(250mL)中，在55oC恒溫水浴上保溫維持5min，然后冷卻到20oC，用離心機以4500-5000rpm的速度離心20min，小心倒出上清液，棄去殘渣，量準(zhǔn)上清液體積，計算出該體積的35%飽和度所需(NH4)2SO4的用量(參見硫酸銨飽和度的常用表)，攪拌慢慢加入(NH4)2SO4，4500-5000rpm離心20min收集上清液；上清液再加(NH4)2SO4至65%飽和度(參見硫酸銨飽和度的常用表)，離心收集沉淀，棄去上清液；將沉淀溶于5mL緩沖液B中，通過上述過程得到了粗酶提取液。

調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表(25℃)硫酸銨終濃度，

％飽和度

10202530333540455055606570758090100每1L溶液加固體硫酸銨的克數(shù)①

056114144176196209243277313351390430472516561662767102025硫酸銨初濃度％飽和度

30

5786291185930137784919150916130183123936221615512594251189158127288225193162326262230198365300267235406340307273449382348314494424390356592694520619485583449