反義核酸與核酶

第一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義藥物第二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日主要內容一、反義核酸與反義技術反義核酸和反義技術概念反義核酸的基本原理反義核酸的種類反義核酸與反義技術的應用二、核酶技術及其應用核酶概述核酶與RNA修復核酶技術在臨床上的應用核酶技術面臨的問題第三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義核酸和反義技術反義核酸(antisensenucleicacid)

是一段與靶基因的某段序列互補的天然存在或人工合成的核苷酸序列

它可通過堿基配對與細胞內核酸特異結合形成雜交分子，從而在轉錄和翻譯水平調節(jié)靶基因的表達，具有合成方便、序列設計簡單、容易修飾、選擇性高、親和力高等特點反義核酸技術（antisensenucleicacidstechnology)

是根據核酸雜交原理設計的，以選擇性地抑制特定基因表達為目的的一類核酸研究新技術

包括反義RNA(asRNA)、反義DNA(asDNA)、核酶(Rz)第四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義核酸的基本原理絕大多數DNA由兩條堿基互補的單鏈組成，生物信息以核苷酸不同排列順序編碼在DNA鏈上，基因組形成單順反子結構在DNA雙鏈上被轉錄為RNA的鏈為正義鏈，與其相對應的鏈為反義鏈精心設計一段寡核苷酸與正義鏈互補，一般由7到30個核苷酸組成，將會阻斷基因轉錄；或將含有反義序列的載體導入細胞內，干擾特定基因表達利用這一原理可以在基因位點、前體mRNA、mRNA及蛋白水平，通過干擾特定基因功能限制細胞增殖、分化和凋亡第五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義基因治療

DNADNA

RNARNA

反義RNA

阻斷表達利用人工合成的反義RNA或DNA導入靶細胞，控制細胞的中間階段使編碼蛋白的基因不能轉錄為mRNA或阻斷翻譯相應蛋白第六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日第七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義技術的兩種技術路線將表達與體內基因或mRNA互補序列的基因轉入體內，使細胞表達與目標基因互補的mRNA，從而阻斷目標基因的表達體外合成mRNA互補的核苷酸類似物，通過靜脈注射等途徑進入細胞，特異性地與目標mRNA作用以第二種為主來介紹第八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義核酸的種類反義RNA：一類能與特異mRNA互補的小分子質量的、可擴散的DNA轉錄物，能夠從翻譯、轉錄和核酸復制水平上高度特異地抑制靶基因表達反義DNA：人工合成一小段反義寡核苷酸，與DNA或mRNA序列互補結合，封閉靶基因表達（ASODN）

理論上認為寡核苷酸與其意義鏈互補，會象“封條”一樣，阻斷mRNA拼接、轉錄、翻譯，下調特定基因表達第九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義RNA的最初發(fā)現反義RNA最先發(fā)現于原核細胞，是由Tomizarna在1981年對質粒ColE1復制的研究過程中發(fā)現的第十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日c-myc基因——真核細胞中天然反義RNA調節(jié)c-myc基因是禽類髓細胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的細胞同源序列，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關Saito等研究發(fā)現，c-myc基因有3個外顯子，第一個外顯子不編碼蛋白質，它的序列與第二個外顯子互補，通過反義RNA與第二個外顯子mRNA的堿基配對而抑制基因表達在人Burkitt淋巴瘤中發(fā)現c-myc基因失去了第一個外顯子，從而使c-myc基因表達失控由此可見，反義RNA的負調節(jié)被解除是細胞惡性轉變的原因之一第十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日c-myc基因——真核細胞中天然反義RNA調節(jié)c-myc互補RNAC-MYC第十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義RNA的作用機制作用于外顯子和內含子的連接區(qū)，阻止mRNA前體的剪接反義RNA與DNA結合時能阻止轉錄因子與DNA的結合，從而阻止特定基因的轉錄互補于特定mRNA的非編碼區(qū)，如SD序列或核糖體結合位點及其上游區(qū)，影響核糖體結合，從而抑制翻譯互補于特定mRNA的編碼區(qū)，抑制翻譯或激活RNaseH使mRNA易被核酸酶降解作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子結構形成，影響mRNA的成熟作用于PoIyA形成位點，阻止靶mRNA成熟及向胞漿內的轉運第十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義RNA的作用機制DNApreRNARNAProteinm7G5'pppAA…AArRNA第十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義RNA的獲得途徑化學會成法：利用核酸合成儀直接合成反義RNA體外轉錄法：利用帶有噬菌體SP6或T7等啟動子序列的質粒，將特異基因的DNA片段反向插入其多克隆位點中，在RNA聚合酶的作用下體外合成特異性反義RNA細胞內轉錄法：利用基因重組技術，在適宜啟動子和轉錄終止子之間反向插人一段靶基因，人工構建反義RNA表達載體(病毒表達載體或質粒表達載體)，然后轉染細胞并使之在細胞中穩(wěn)定表達反義RNA第十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義RNA的臨床作用抗病毒：將特定的病毒基因反向插入到表達性載體中，以構建反義RNA表達載體再將重組體導入真核細胞(病毒宿主細胞)中表達特異性反義RNA從而抑制特異有害基因的表達或抑制病毒復制（皰疹病毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒）抗腫瘤：設計出針對腫瘤細胞的癌基因、突變基因、非正常表達基因及某些腫瘤相關病毒的癌基因反義RNA以阻斷這些有害基因的表達，達到治療腫瘤的目的第十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義DNA與靶基因結合形式寡核苷酸與雙股DNA結合，形成三股螺旋結構，競爭抑制激活轉錄蛋白與基因啟動子結合，發(fā)揮其生物活性寡核苷酸與mRNA雜交形成了核糖核苷酸酶H(RNaseH)底物，激活RNaseH識別雜交體特異性地剪切雜交分子中的mRNARNaseHASODNmRNATFO第十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日反義寡聚核苷酸與mRNA特異性結合，阻斷翻譯過程第十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日ANTISENSETECHNOLOGIESGENOMICSBASEDDRUGDISCOVERYPHARMACEUTICALSMOLECULARDIAGNOSTICSGENETHERAPYDRUGDELIVERYSYSTEMSRelationofantisensetechnologiestoothersegmentsofbiopharmaceuticalindustry反義技術與反義核酸的應用第十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日利用反義RNA的原癌基因失活療法：

阻止或抑制原癌基因的過度表達及抑制癌基因突變體mRNA成熟原癌基因調控細胞生長，增殖與分化正常情況下，表達受嚴格控制一旦調節(jié)失控，基因產物（生長因子，生長因子受體，胞內外傳遞信號等癌蛋白）分泌過剩，細胞惡性增生，致癌治療方法根據已知癌基因的核苷酸序列合成反義RNA相應的反義寡聚核苷酸與腫瘤癌基因活化表達的mRNA的起始翻譯位點結合成RNA/RNA雙鏈體雙鏈體阻止啟動子與核糖體結合，或核糖體沿mRNA上移，抑制翻譯反義RNA的應用（一）第二十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日

反義RNA的應用（二）第二十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日

反義RNA的應用（二）第二十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日

反義RNA的應用（二）抗HIV-l的作用：從翻譯水平封閉基因表達，并干擾mRNA的剪切、加工而實現抗病毒作用tat為HIV-l重要的調節(jié)基因，編碼反式激活因子Tat蛋白在逆轉錄病毒啟動子LTR之后連接反義tat與多聚TAR的構建物(LTR-25TAR-AS-TAT)，具有反義tat及TAR誘餌的雙重作用由于LTR啟動子受Tat蛋白反式激活，使tat在HIV-l感染的細胞中得以高表達將這種外源基因導入Molt-3T細胞系、CEM-SST細胞系及健康人外周血單個核細胞(PBMCs)，對實驗及臨床分離病毒株均有抑制作用gag是HIV-1的結構基因，編碼p24等病毒結構蛋白Veres等構建了逆轉錄病毒載體，在細胞內表達互補于gag區(qū)不同長度的反義RNA(225-1225nt)

在CEM-SST細胞及外周血CD4細胞均有抑制HIV-l復制的作用長片段反義RNA的抗HIV-l作用更好，可能由于它能與不同種的HIV-lRNA結合而限制了病毒的逃逸第二十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日部分反義藥物第二十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日針對腫瘤的反義藥物第二十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日針對其他疾病的反義藥物第二十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日第一個反義藥物——福米韋生Fomivirsen（ISIS2922）是FDA批準上市的第1個反義藥物商品名Vitravene美國ISISPharma公司研制瑞士CibaVisionOphthalmics公司申請1998年8月在美國首次上市核苷酸序列為5’-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’硫代磷酸化修飾主要用于治療艾滋病(AIDS)病人并發(fā)的巨細胞病毒(CMV)性視網膜炎第二十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日第一個反義藥物——福米韋生1藥效學1.1抗病毒作用機制主要依賴于反義作用，福米韋生與CMVmRNA特異序列互補結合，被RNA酶H識別，并使mRNA水解失活抑制CMV進入宿主細胞是序列非依賴性的非反義作用1.2抗病毒活性對人類CMV病毒株AD169的EC50為0.37μmoL此EC50為更昔洛韋（ganciclovir）的l30～1901.3耐藥性耐受高濃度福米韋生的病毒突變株與福米韋生互補的基因區(qū)并無改變，這表明耐藥性不是互補基因區(qū)發(fā)生改變而引起的第二十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日第一個反義藥物——福米韋生2藥動學2.1兔體內藥動學以14C標記的福米韋生單次66μg劑量，玻璃體液中消除t1/2為62h給藥10天后，仍對CMV復制有抑制作用，有22%的福米韋生存在，其余78%則降解為短鏈代謝物視網膜中消除t1/2約為79h2.2猴體內藥動學玻璃體液藥物濃度與劑量曲線幾乎為直線關系峰值濃度出現在給藥2～3天后，14天后基本檢測不到在每周或每2周玻璃體內注入11、57和115μg后，玻璃體液中未發(fā)現藥物累積現象但多次注射后，視網膜上出現藥物累積現象福米韋生115μg單次給藥，在視網膜中消除t1/2為78h第二十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日第一個反義藥物——福米韋生3臨床療效前3周每周福米韋生165μg玻璃體內注射，以后每2周給藥1次，用藥組和對照組病情進展時間中位數分別為71和14天福米韋生可以降低病人體內的CMV活性，呈劑量-效應關系病情發(fā)展到威脅視力的病人，使用福米韋生后癥狀有所好轉，病情進展明顯延緩4不良反應最常見不良反應是暫時性眼內壓升高和輕、中度眼前、后房炎癥反應所有研究對象均未發(fā)生視網膜剝脫和全身毒性反應高劑量可引起少數病人外周視網膜色素沉著及周邊視力下降與眼外科手術相比，玻璃體內注射發(fā)生出血、眼內炎和視網膜剝脫的風險要小得多第三十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日第一個反義藥物——福米韋生5適應證和禁忌證福米韋生為二線治療藥物，適用于對其他治療措施不能耐受或沒有效果或有禁忌的病人；禁用于2～4周內使用西多福韋（cidofovir）治療的病人，以免增加發(fā)生眼內炎的危險性6與治療CMV視網膜炎的其他藥物比較更昔洛韋、西多福韋和膦甲酸鈉是CMV抑制劑，而非殺死劑；具有交叉耐藥性；可產生腎毒性；插管給藥、植入制劑費用昂貴、重復手術以及視網膜剝脫發(fā)生率高（28%）使應用受限福米韋生具有阻止病毒復制，療效持久、用藥次數少，不良反應少而輕，局部玻璃體內注射給藥優(yōu)于其他上述提及的給藥方法7展望第三十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日受體介導的轉移技術受體介導DNA轉運技術的啟發(fā)實現DNA和RNA的轉運例：脫唾液酸血清類粘蛋白(ASGP)受體

唾液酸血清類粘蛋白—唾液酸→ASGP

ASGP

+PL（多聚賴氨酸）→

ASGP-PL復合物反義RNA

+ASGP-PL復合物→

ASGP-PL-反義RNA復合物

ASGP-PL-反義RNA復合物→

肝細胞表面ASGP受體識別→吞噬→

釋放→發(fā)揮作用優(yōu)點：專一性強，抗降解能力強第三十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日以聚合物微球為載體的輸送系統目前研究最多的聚合物微球是聚丙交酯及乳酸一羥乙酸（LA-GA）以丙交酯和乙交酯為單體形成的共聚物，降解屬于水解反應產物均為人體正常代謝物，降解時間取決于兩種單體的配比和聚合物的分子量構成的結合復合體具有潛在的轉運反義核苷酸和核酶的作用第三十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日核酶技術及其應用核酶(Ribozyme)——一種具有核酸內切酶活性的RNA分子，可特異性地切割靶RNA序列，具有解離后重復切割相同靶分子的能力第三十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日核酶發(fā)展簡史1968年，FrancisCrick在他的論文“基因密碼的起源”一文中提到：“可能第一個酶是具有復制能力的RNA”，沒有人予以注意1987年，第52屆冷泉港定量生物學國際討論會上，AlanWeiner做會議總結時重復了20年前FrancisCrick的話，會議注意力已集中到最近發(fā)現的具有酶活性RNA分子上1989年，諾貝爾化學獎授予了分別獨立地發(fā)現具有酶活性的RNA分子的Thomas.R.Cech（ColoradoUniversity）SidneyAltman（YaleUniversity）第三十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日ThomasR.Cech切赫，美國人因發(fā)現RNA生物催化作用與S.Altman同獲1989年諾貝爾化學獎獨立發(fā)現RNA不僅被動地傳遞遺傳信息，還能催化細胞內生命所必需的化學反應，1982年公布其研究結果，1983年證實RNA的酶活動此前，人們認為僅蛋白質才能起酶的作用第三十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日核酶的發(fā)現研究目的：rRNA中一些無意義的序列，或內含子(intron)，如何從RNA分子中剪切下來？研究對象：原生動物四膜蟲(TetrahymenaThermophila)，只含一種RNA，除rRNA外還有一個由413個核苷酸組成的插入序列(interveningsequenc，IVS)研究發(fā)現：轉錄產物rRNA前體很不穩(wěn)定，在鳥苷和Mg2+存在下切除自身的IVS，使兩個外顯子拼接起來，變成成熟的rRNA分子。催化反應是在無任何蛋白質酶存在下發(fā)生的，稱為自我剪接研究結論：

IVS具有類似蛋白酶的功能，能夠打斷及重建磷酸二脂鍵rRNA前體能靠自己完成剪接過程，在一定條件下按一定方式盤繞，進而切割自己，以后再把保留部分連接起來?？梢源呋杂傻孜锏木哂忻富钚缘腞NARNA分子具有自身斷裂的催化作用，以及酶活性的另一個重要方面即催化其他分子的反應第三十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日SidneyAltman奧爾特曼（1939—）美國人因發(fā)現RNA的生物催化作用而獲1989年諾貝爾化學獎1978年奧爾特曼發(fā)現了核糖核酸(RNA)自身具有的生物催化作用不僅為探索RNA的復制能力提供了線索，而且說明了最早的生命物質是同時具有生物催化功能和遺傳功能的RNA，打破了蛋白質是生物起源的定論第三十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日S.Altman的研究工作研究目的：t-RNA分子的剪接過程研究發(fā)現：在較高濃度的鎂離子和適量精氨酸參與下，核酸酶P（ribonucleaseP，RNaseP）中RNA能夠切割tRNA前體5’端研究結論：過去都認為RNase

P的催化作用由RNA和蛋白質共同完成的，而該實驗證明，RNase

P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白質在細胞內僅僅起穩(wěn)定構象的作用由于這類酶具有類似核糖核酸功能，而化學本質為核酸，因此被切赫稱之為核酶第三十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日核酶的作用機制第四十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日核酶的分類剪切型核酶：這類核酶催化自身或者異體RNA的切割，相當于核酸內切酶剪接型核酶：這類核酶具有核酸內切酶和連接酶兩種活性剪切型核酶剪接型核酶根據催化反應錘頭核酶I型內含子II型內含子發(fā)夾核酶丁型肝炎病毒(HDV)核酶RNaseP鏈孢霉線粒體(VS)核酶自體催化異體催化第四十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日自體剪切型核酶-錘頭型核酶錘頭核酶是從類病毒中分離出來的本來是一個順式切割的酶，將其分為酶鏈和底物鏈兩部分后就轉變?yōu)榘袠颂禺愋缘姆词角懈畹拿冈诜乐褂泻虻谋磉_上具有很大的應用價值形狀：長約30個核苷酸，呈球狀構象，可粗略看成性折疊二級結構：3個超螺旋結構域和13個保守核苷酸殘基構成：催化區(qū)和底物結合區(qū)性質：需要二價金屬離子(Mg2+)作為它的輔因子，核酶的活性形式是一種RNA鍵合金屬氫氧化物第四十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日3個雙螺旋區(qū)13個核苷酸殘基保守序列剪切反應在右上方GUX序列的3‘端自動發(fā)生第四十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日發(fā)夾結構核酶1989年漢普（Hample）研究煙草環(huán)斑病毒（sTRSV）的負鏈RNA的自我剪切反應，提出發(fā)夾結構（hairpinstructure）模型發(fā)夾核酶催化機制：金屬離子在催化反應中起結構作用，其剪切活性比錘頭結構核酶高第四十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日5‘3‘剪切位點自體剪切型核酶-發(fā)夾結構3個環(huán)和4個螺旋形成兩個結構域剪切反應發(fā)生在底物識別序列GUC的5‘端兩個內部環(huán)中的堿基及在螺旋區(qū)II的G11和底物中的G+1都是酶發(fā)揮作用所必需的第四十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日肝炎病毒（HDV）核酶目前唯一一種哺乳動物細胞內具有天然核酶活性的動物病毒來源于肝炎病毒的反義RNA和基因組RNA，為單股環(huán)狀負鏈RNA病毒結構特點：有3個由堿基配對形成的莖，剪切時需要二價陽離子參與，結果產生5‘-OH和2’,3’-環(huán)磷酸第四十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日剪切部位剪切部位自體剪切型核酶-斧頭結構三個堿基對的莖需要二價陽離子產生5’-OH和2’,3’-環(huán)磷酸第四十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日鏈孢霉線粒體（VS）核酶VS核酶球狀，由5個螺旋結構組成，這些螺旋結構通過兩個連接域連接起來，連接域對于催化反應很重要第四十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日異體剪切型核酶－RNasePRNaseP是內切核酸酶，是核糖核蛋白體復合物，能剪切所有tRNA前體的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH

和5’-磷酸末端RNaseP由M1RNA和蛋白質亞基組成體外：M1RNA具催化作用，蛋白質作為輔助因子體內：M1RNA和蛋白質對酶活性都是必需的RNaseP可剪切前體5’端41nt,5’端成熟不同tRNA的5’端沒有順序共同性，剪切的準確性與剪切部位周圍的核苷酸順序無關，表明在RNaseP的組分內沒有引導序列，RNaseP所識別的是底物的高級結構第四十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日剪切位點第五十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日G結合位點保守序列剪接部位引導序列G結合位點

I類內含子二級結構通式第五十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日第五十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日型內含子核酶一類具有酶催化功能的內含子，轉錄成RNA后，可以自剪接其轉錄后可形成9個堿基配對形成的特定二級結構，分別命名為P1至P9在剪接反應中，需要游離的鳥苷作輔助因子可以用來修復體內的有害突變基因第五十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日I型內含子催化其他RNA分子反應的幾種類型轉核苷酸作用

2CpCpCpCpC

→CpCpCpCpCpC+CpCpCpC

水解作用

CpCpCpCpC

→CpCpCpC+pC

轉磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU→CpCpCpCpCpC+UpCpUp

去磷酸作用

CpCpCpCpCp

→CpCpCpCpC+Pi限制性內切酶作用?CpUpCpUpN?

+G→CpUpCpU+GpN?第五十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日II型內含子核酶由6個螺旋組成，分成3個部分：邊界序列5’GUGCG···YnAG，（Y代表嘧啶，n代表任意核苷酸）3’莖環(huán)結構分支點順序

A處于未配對狀態(tài)，有一游離的2’-OH剪接機制：不需要鳥苷或鳥苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg2+)第五十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日II型內含子核酶II型內含子有一個保守的二級結構結構域V：高度保守，催化活性必需結構域VI：未配對的A提供2‘-OH第五十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日II型內含子核酶第五十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日II型內含子核酶剪接機制第五十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日第五十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日脫氧核酶指具有催化功能的DNA分子稱為脫氧核酶(DNAzyme)，又稱酶性DNA在一定條件下可切割RNA分子特定位點內部的磷酸二酯鍵脫氧核酶的發(fā)現進一步延伸了酶的概念具有水解酶活性的脫氧核酶以RNA為底物的脫氧核酶：包括“10-23”DRz和“8-17”DRz

以DNA為底物的脫氧核酶：手槍型脫氧核酶具有N-糖基化酶活性的脫氧核酶具有連接酶活性的脫氧核酶具有激酶活性的脫氧核酶第六十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日10-23型脫氧核酶作用機理第六十一頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日手槍型脫氧核酶自我剪切作用機理第六十二頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日核酶與RNA修復核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特異性地催化RNA剪接經過基因工程改造的核酶，可以位點特異性地切割任意給定的RNA分子剪接有兩種形式：一是分子內不同部分間的剪接，稱為順式剪接；一是不同分子間的剪接，稱為反式剪接反式剪接是修復RNA外顯子突變的重要方法可以把正?；蚧蚓哂蓄愃乒δ艿幕蛳鄳?，剪接到異常RNA上去，換下突變的部分第六十三頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日修復RNA結構缺陷利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修復已有的基因缺陷N.Lan等對鐮形細胞貧血突變的β珠蛋白mRNA進行了修復鐮刀形細胞貧血是由于β珠蛋白基因第6密碼子中的一個A→T突變引起的將來源于四膜蟲組I內含子的核酶改造，使之能專一性識別β珠蛋白mRNA突變位點上游的特定序列將γ珠蛋白cDNA下游包括外顯子在內的對應片段連接到這一核酶的3’端轉染培養(yǎng)到病人外周血和臍帶血干細胞后，均檢測到β珠蛋白mRNA被剪接成β珠蛋白γ融合RNA分子，說明引入的功能基因得到表達第六十四頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日第六十五頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日胎兒型血紅蛋白(HbF，α2γ2)與成人型血紅蛋白(HbA，α2β2)功能相近，所以γ珠蛋白的引入，可以代償βS珠蛋白所喪失的功能，起到治療鐮形細胞貧血的作用Tγγββ第六十六頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日恢復正常剪接途徑基因突變有時會在內含子中生成新的剪接點，當然也是異常的剪接點。它們與左鄰右舍原來不起作用的隱匿的剪接點搭配起來，就會形成錯誤剪接由于原有的正常剪接點并未喪失功能，只是作用被異常剪接抑制，所以用反義核酸通過堿基互補，封閉異常剪接點或其他剪接元件，就可堵住異常剪接途徑，迫使剪接系統選擇正確的途徑，形成正常RNA。這就間接地對RNA缺陷作了“修復”剪接缺陷型突變往往使mRNA失活，影響嚴重β地中海貧血是由于患者β珠蛋白基因突變，導致正常β鏈減少，紅細胞內α和β鏈不平衡，締合形成的成人型血紅蛋白（α2β2）少了或者完全沒有引起的已發(fā)現的190多種β地中海貧血突變型中，有一部分屬于剪接缺陷型第六十七頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日CCC—CCC—CCCC反義RNA第六十八頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日β地中海貧血我國常見的內含子2第654位C→T突變（β654），就是在653位形成了一個新的剪接點，同時又激活了其上游579位一個潛在的剪接點，導致一段長度為73個堿基的內含子2序列插入到外顯子2和3之間，形成異常mRNA，引起地中海貧血表型由于突變基因原有的正常剪接點并未遭到破壞，仍然可以發(fā)揮作用，所以用反義核酸封閉異常的653或579位點，就能迫使人體剪接系統回到正常剪接途徑，減少異常mRNA的形成反義封閉雖沒有對β珠蛋白基因的突變作任何修正，但是對突變RNA的錯誤剪接方式作了糾正，所產生的成熟mRNA可以指導合成正常珠蛋白鏈。第六十九頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日調整蛋白質肽鏈比例

突變基因的異常表達，往往擾亂體內蛋白質肽鏈之間的平衡，引起疾病反義封閉技術也可用來糾正基因表達的紊亂。常見的血紅蛋白H病（慢性溶血性貧血）的研究，就是一個比較理想的范例正常人每個細胞有4個α珠蛋白基因，2個β珠蛋白基因，合成的α和β鏈正好締合成四聚體α2β2第七十頁，共七十八頁，編輯于2023年，星期日血紅蛋白H病如果在4個α珠蛋白基因中只有1個正常，其余3個丟失或有缺陷，則紅細胞中α鏈合成不足，β鏈相對過剩。多余的β鏈自行聚合為四聚體β4，即血紅蛋白H血紅蛋白H不穩(wěn)定，容易解體生成游離的β鏈，游離鏈在紅細胞內沉淀形成H包涵體，附著在紅細胞膜上，使膜受損失去柔韌性。這種紅細胞易被脾臟破壞，導致血紅蛋白H病血紅蛋白H病的