蛋白質(zhì)的提取、分離純化及定量

-.z.實(shí)驗(yàn)一氨基酸的別離鑒定——紙層析法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)氨基酸紙層析的根本原理。掌握氨基酸紙層析的操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。層析溶劑由有機(jī)溶劑和水組成，濾紙和水的親和力強(qiáng)，與有機(jī)溶劑的親和和弱，因此在展層時(shí)，水是固定相，有機(jī)溶劑是流動相。將樣品點(diǎn)在濾紙上〔原點(diǎn)〕，進(jìn)展展層，樣品中的各種AA在兩相溶劑中不斷進(jìn)展分配，由于它們的分配系數(shù)不同，不同AA隨流動相移動速率就不同，于是將這些AA別離開來，形成距原點(diǎn)距離不等的層析點(diǎn)。溶質(zhì)在濾紙上的移動速率用比移〔rateofflow,Rf〕來表示Rf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離〔*〕/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離(Y)只要條件〔如溫度、展層劑的組成〕不變，*種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)?？筛鶕?jù)Rf作為定性依據(jù)。Rf值的大小與物質(zhì)的構(gòu)造、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。樣品中如有多種AA，其中有些AA的Rf值一樣或相近，此時(shí)只用一種溶劑展層，就不能將它們分開，為此，當(dāng)用一種溶劑展層后，將濾紙轉(zhuǎn)90度再用另一種溶劑展層，從而到達(dá)別離的目的，這種方法叫雙向?qū)游?。儀器、試劑1、擴(kuò)展劑：是水飽和的正丁醇和醋酸以體積比4：1進(jìn)展混合得混合液。將20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中，與15ml水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層，漏斗內(nèi)即為擴(kuò)展劑。取漏斗內(nèi)的擴(kuò)展劑約5ml置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒入培養(yǎng)皿中備用。2、氨基酸溶液⑴.單一氨基酸：5%賴氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5ml混合。3、顯色劑：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。4、層析缸、濾紙〔14*17〕、噴霧器、電吹風(fēng)實(shí)驗(yàn)步驟1.放置平衡溶劑：用量筒量取約5ml平衡溶劑，放入培養(yǎng)皿中，然后置于密閉的層析缸中。2.準(zhǔn)備濾紙：取層析濾紙〔長17㎝、寬14㎝〕一*。在紙的一端距邊緣2㎝處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔1.5㎝作一記號——點(diǎn)樣線。3.點(diǎn)樣：用毛細(xì)管將各氨基酸樣品分別點(diǎn)在這8個(gè)位置上，干后再點(diǎn)一次。每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過3mm。4.擴(kuò)展：用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛有約20ml擴(kuò)展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中〔點(diǎn)樣的一端在下，擴(kuò)展劑的液面需低于點(diǎn)樣線1㎝〕。待溶劑上升12㎝時(shí)即取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界限，自然枯燥或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干。5.顯色：用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分鐘〔100℃〕或用熱風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點(diǎn)。6.計(jì)算：計(jì)算各種氨基酸的比移〔Rf〕值。精講點(diǎn)播1.利用逆流分溶或逆流分配的方法作為分配層析原理的說明：32323216168844161616161212888812121212224488224816124310.750.2536121866.752.252.250.7527920.256.7510.13.40.190，0620.256.7520.26.815.25.42.物質(zhì)的構(gòu)造與極性對Rf值的影響物質(zhì)的構(gòu)造不同，其分子的極性不一樣，物質(zhì)在水和有機(jī)溶劑兩相中的溶解度就不同，分配系數(shù)的不同可通過Rf值反響出來，極性較強(qiáng)的物質(zhì)，在水中的溶解度較大，其Rf值就較小，相反極性較弱的物質(zhì)，在有機(jī)溶劑中的溶解度就較大Rf值就大些，如中性AA的極性弱于酸堿性AA，故中性AA的Rf值較大?？记绊氈?、出現(xiàn)的問題及解決方法1.取濾紙前，要將手洗凈，并盡可能少接觸濾紙，不得已時(shí)只能拿濾紙的一角，平放在干凈的紙上。2.點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑不能大于0.5㎝，否則別離效果不好，樣品用量大會造成"拖尾巴〞現(xiàn)象。3.別離時(shí)間短使有些氨基酸的Rf值非常相似，分析時(shí)可以輔顏色不同加以區(qū)分。4.樣品在原點(diǎn)未移動，是因?yàn)檎箤觿┏鰡栴}，在展層劑中混入了平衡溶液，因?yàn)槠胶馊芤菏欠胖脮r(shí)間長了的展層劑，展層劑出現(xiàn)脂化現(xiàn)象，使分配系數(shù)發(fā)生變化。思考題1.何謂紙層析法？2.何謂Rf值？影響Rf值的主要因素是什么？3.怎樣制備擴(kuò)展劑？4.層析缸中平衡溶劑的作用是什么？實(shí)驗(yàn)二.酶的特異性〔專一性〕及影響酶活性的因素實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諜z查酶特異性的方法和原理。了解溫度對酶活性的影響。了解激活劑、抑制劑對酶活力的影響。實(shí)驗(yàn)原理1.酶的專一性酶是生物體中一種具有催化功能的特殊蛋白質(zhì)〔傳統(tǒng)酶的概念〕，也常稱為生物催化劑。它與一般催化劑的最主要區(qū)別就是具有高度的特異性，即專一性。根據(jù)各種酶對底物的選擇程度不同，可分為絕對專一性、相對專一性、立體異構(gòu)專一性，。例如唾液淀粉酶屬于相對專一性酶，它只能隨機(jī)作用于淀粉鏈內(nèi)部的a——1，4糖苷鍵，使其分子迅速斷裂成較短的鏈，稱為糊精，糊精分子量遞減，淀粉——大分子糊精——中分子糊精——小分子糊精——簡單分子糊精——麥芽糖和a——糊精〔含a——1，6糖苷鍵的短鏈聚糖，平均分子量為8個(gè)殘基〕。由于淀粉酶催化所形成的產(chǎn)物都是復(fù)原糖，故可用靈敏度較高的Benedict試劑檢測和觀察。2.溫度對酶促反響速度的影響酶的催化作用受溫度的影響很大，與一般化學(xué)反響一樣，提高溫度可以增加酶促反響的速度，通常溫度每升高10℃，反響速度加快一倍左右。另一方面酶是一種蛋白質(zhì)，溫度過高可引起蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致酶的失活。因此，反響速度到達(dá)最大值以后，隨著溫度的升高，反響速度反而逐漸下降，以至完全停頓反響。反響速度到達(dá)最大值時(shí)的溫度稱為酶作用的最適溫度。大多數(shù)動物酶的最適溫度為37—40℃，植物酶的最適溫度為50—60℃。但一種酶的最適溫度不是完全固定的，它與作用的時(shí)間稱短有關(guān)，反響時(shí)間增長時(shí)，最適溫度向數(shù)值較低的方向移動。最適溫度不是酶的特征性物理常數(shù)。酶對溫度的穩(wěn)定性與其存在形式有關(guān)。大多數(shù)酶在枯燥的固體狀態(tài)與比擬穩(wěn)定，能在室溫下保存數(shù)月至一年，溶液中的酶，易被微生物污染，常難長期保存，在高溫的情況與，如100℃即可失活。低溫降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。3.激活劑和抑制劑對酶活力的影響酶的活性常受*些物質(zhì)的影響，有些物質(zhì)能增加酶的活性，稱為酶的激活劑；另一些物質(zhì)則會降低酶的活性，稱為酶的抑制劑。例如氯離子為唾液淀粉酶的激活劑，銅離子則為該酶的抑制劑。通常情況下，很少量的激活劑或抑制劑就會影響酶的活性，而且常具有特異性，但是激活劑和抑制劑不是絕對的，有些物質(zhì)對不同的酶所起的作用不同，如鎂是脫羧酶烯醇化酶的激活劑，但是肌球蛋白ATP酶的抑制劑，同一種酶也可因激活劑的濃度不同而作用不同，如CL-在低濃度時(shí)是激活劑，達(dá)三分之一飽和度時(shí)則變?yōu)橐种苿?。器材和試?.配制的溶于0.3％氯化鈉的0.5％淀粉溶液：2.新配制的溶于0.3％氯化鈉的0.1％淀粉溶液：3.新配制的溶于0.3％氯化鈉的0.2％淀粉溶液：4.新配制的溶于0.3％氯化鈉的1%淀粉溶液：5.稀釋的新鮮唾液。漱口后將唾液吐入量筒內(nèi)收集約10ml加水至200ml，取0.2%的淀粉2ml，唾液2ml混勻，每間隔1分鐘取1-2滴于白磁反響板內(nèi)，加KI-I檢測，控制酶的濃度使反響剛好在4-5分鐘內(nèi)完成。6.碘化鉀－碘溶液:將碘化鉀20克及碘10克溶于100毫升水中。使用前稀釋10倍。7.本尼迪克特〔Benedict〕試劑:取86.5克檸檬酸鈉〔Na3C6O7·2H2O〕和50克無水碳酸鈉溶于450毫升蒸餾水中；再取硫酸銅〔CuSO4·5H2O〕8.7克溶于50毫升蒸餾水中；然后將硫酸銅溶液慢慢到入前液，邊加邊搖動；最后加蒸餾水稀釋至500毫升〔本試劑可長期保存〕。8.1％氯化鈉溶液：10、銅溶液：11、%硫酸鈉溶液12恒溫水浴鍋、沸水浴、移液管、電子天平操作步驟淀粉→分子糊精-→中分子糊精→小分子糊精→麥芽糖和α-糊精KI-I藍(lán)藍(lán)紫褐紅不呈色不呈色一、酶的專一性取5支試管，編號并按下表操作：管號12341%淀粉溶液4滴—4滴—2%蔗糖溶液—4滴—4滴稀釋唾液1毫升—1毫升—蒸餾水—1毫升—1毫升37℃恒溫水浴15minBenedict試劑1毫升1毫升1毫升1毫升沸水浴5min現(xiàn)象二.溫度對酶活力的影響〔一〕淀粉和可溶性淀粉遇碘呈藍(lán)色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈藍(lán)色、紫色、暗褐色或紅色。最簡單的糊精遇碘不呈顏色，麥芽糖遇碘也不呈色。在不同溫度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色來判斷。〔二〕取三支試管，編號后按下表參加試劑：管號123淀粉溶液(ml)1.51.51.5稀釋唾液(ml)11-煮沸過的稀釋唾液(ml)--1(三)搖勻后，將1、3號兩支試管放入37℃恒溫水浴鍋中，2號試管放入冰水中。10分鐘后取出〔將2號管內(nèi)液體分為兩半〕，用碘化鉀－碘溶液來檢驗(yàn)1、2、3號管內(nèi)淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。記錄并解釋結(jié)果，將2號管剩下的一半溶液放入37℃水浴中繼續(xù)保溫10分鐘，再用碘液檢驗(yàn)，結(jié)果如何？三.酶的激活與抑制〔一〕取三支試管，按下表編號參加相應(yīng)試劑：試劑管號0.1％淀粉1％NaCI1%CuSO4H2O1:20唾液12ml1ml－－1ml22ml－1ml－1ml32ml－－1ml1ml〔二〕加畢，搖勻，同時(shí)置37℃水浴鍋中保溫，每隔2分鐘取液體1滴置白瓷板上用碘液試之，觀察那支試管內(nèi)液體最先不呈藍(lán)色反響，那一管次之，說明原因。考前須知1.所用唾液，應(yīng)在收集前用蒸餾水漱口，以去除食物殘?jiān)?，再含一口蒸餾水，約半分鐘后將其流入量筒并稀釋。由于不同人或同一個(gè)人不同時(shí)間采收的唾液內(nèi)淀粉酶的活性并不一樣，有時(shí)差異很大。所以稀釋倍數(shù)可根據(jù)各人的唾液淀粉酶活性進(jìn)展調(diào)整〔一般在50~300倍〕。另外，稀釋好的新鮮唾液假設(shè)泡沫多，可進(jìn)展過濾后再用。2.實(shí)驗(yàn)中所用的淀粉溶液必須新鮮配制，并且在配制時(shí)必須將其煮沸至透明為止。且下次實(shí)驗(yàn)假設(shè)再用，必須重新煮至透明，否則將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.蔗糖是典型的非復(fù)原糖，假設(shè)其中的非復(fù)原糖超過一定標(biāo)準(zhǔn)，則呈現(xiàn)復(fù)原性，這種蔗糖不能使用。一般在實(shí)驗(yàn)之前要對所用蔗糖進(jìn)展檢查，不能呈現(xiàn)陽性反響，至少要用分析純試劑。4.唾液中除了含有淀粉酶以外，還含有少量的麥芽糖酶，該酶可使麥芽糖分解為葡萄糖。思考題1．什么是酶的特異性？本實(shí)驗(yàn)如何驗(yàn)證了酶的特異性？2．蔗糖的純度對該實(shí)驗(yàn)的成功與否有什么要求？3．假設(shè)將唾液酶和蔗糖酶液煮沸15分鐘，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果會發(fā)生什么樣的變化？4．酶反響的最適溫度是酶的特征性物理常數(shù)嗎？它與哪些因素有關(guān)？參考內(nèi)容1.絕對專一性：只作用于一種底物，僅催化一種反響，如脲酶就是其中最典型的例子，只催化尿素水解而對尿素的任何衍生物均無催化水解作用。2.相對專一性：可以催化*一類的底物或*一類的化學(xué)鍵，如蛋白水解酶脂酶。3.立體異構(gòu)專一性：只作用于底物的立體異構(gòu)物中的一種，而且反響生成物也都是異構(gòu)物中的一種。此種現(xiàn)象普遍存在。實(shí)驗(yàn)三小麥萌發(fā)前后淀粉酶活性的比擬實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)用分光光度法測定酶活力的原理和方法。了解小麥萌發(fā)前后淀粉酶酶活力的變化。實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶是水解淀粉的糖苷鍵的一類酶的總稱。按照其水解淀粉的作用方式，可以分成α—淀粉酶、β—淀粉酶等.實(shí)驗(yàn)證明，在小麥、大麥、黑麥的休眠種子中只含有β—淀粉酶，α—淀粉酶是在發(fā)芽過程中形成的，所以在禾谷類萌發(fā)的種子和幼苗中，這兩類淀粉酶都存在。其活性隨萌發(fā)時(shí)間的延長而增高。α—淀粉酶是工業(yè)上使用最廣泛的酶之一，它在PH3.6下短時(shí)間內(nèi)即可鈍化，β—淀粉酶不耐熱，加熱至70℃以上即可鈍化。利用此原理可以滅活其中一種酶，測定另一種酶的活性。本實(shí)驗(yàn)以淀粉酶催化淀粉生成復(fù)原的性糖的速度來測定酶的活力，淀粉水解成復(fù)原性糖，復(fù)原性糖能使3，5—二硝基水楊酸復(fù)原成棕色的3—氨基5—硝基水楊酸?？捎梅止夤舛扔?jì)法測定，2(C6H10O5)n+nH2→nC12H22O11器材、材料、試劑1.小麥種子2.0.1％標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖：準(zhǔn)確稱量0.1g麥芽糖，用少量水溶解后，移入100ml3.PH6.9，0.02mol/L磷酸緩沖液：0.2mol/L磷酸二氫鉀：稱取磷酸二氫鉀溶于水定溶至100ml0.2mol/L磷酸氫二鉀：稱取磷酸氫二鉀溶于水定溶至100ml取0.2mol/L磷酸二氫鉀67.5ml與0.2mol/L磷酸氫二鉀82.5ml混合，定溶至1000ml。4.0.5％0.5g淀粉溶于0.02mol/L磷酸緩沖液中，參加0.0389gNaCI,用緩沖液定溶至100ml。5.3，5—二硝基水楊酸溶液：1g3，5—二硝基水楊酸溶于2mol/L的NaOH溶液20ml和20ml水中，溶解后移入100ml容量瓶中；30g酒石酸鉀鈉溶于30ml水中，溶解后移入上容量瓶中，〔此時(shí)溶液會出現(xiàn)粘稠〕，繼續(xù)攪拌，至溶解，定溶至100ml，過濾備用。6.1％氯化鈉溶液：7.石英砂8.研缽、恒溫水浴、沸水浴、752分光光度計(jì)、離心機(jī)、電子天平等實(shí)驗(yàn)步驟一.酶液的提取1.小麥種子萌發(fā)小麥種子浸泡24小時(shí)后，放入25℃恒溫箱內(nèi)或在室溫下發(fā)芽。2.酶液的提?。孩庞酌缑傅奶崛。喝“l(fā)芽4—5天的幼苗10株，放入乳缽內(nèi)，加石英砂0.2g，加1％氯化鈉10ml，用力研磨成勻漿，在0----4℃下放置20分鐘。將提取液移入離心管中，以2000r/min離心10分鐘。將上清液倒入量筒中，測定酶提取液的總體積。取1ml酶液用PH6.9的磷酸緩沖液稀釋10倍，進(jìn)展酶活力測定。⑵種子酶的提?。喝】菰锓N子15粒作對照，操作方法同上。二.酶活力測定：⑴取25ml刻度試管4支，編號，按下表要求參加試劑〔淀粉參加后預(yù)熱5分鐘〕管號試劑1種子酶稀釋液2幼苗酶稀釋液3標(biāo)準(zhǔn)管4空白管0.2％淀粉溶液〔ml〕1111標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液〔ml〕0.5蒸餾水〔ml〕0.5酶液〔ml〕0.50.5各管混勻后45℃水浴中水解3分鐘，立即向各管中參加1％3，5---二硝基水楊酸溶液2ml。⑵各管混勻后，放入沸水浴中準(zhǔn)確加熱5分鐘，冷至室溫，加水稀釋至25ml。將各管充分混勻。⑶用空白管作為對照：在A500nm處測定各管的光吸收值〔A值或OD值〕填入下表。試管號1〔種子酶管〕2〔幼苗酶管〕3〔標(biāo)準(zhǔn)管〕4〔空白管〕光吸收值〔4〕標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)液00.10.30.50.70.913，5-二硝基水楊酸2222222A50000.3310.5370.8021.0011.2451.508A=0.086+0.236C〔r=0.9883〕〔5〕計(jì)算酶活力單位：根據(jù)溶液的濃度與光吸收值成正比的關(guān)系，A標(biāo)準(zhǔn)/A未知=C標(biāo)準(zhǔn)/C未知?jiǎng)tC〔酶管中麥芽糖的濃度〕=A酶×C標(biāo)準(zhǔn)/A標(biāo)準(zhǔn)設(shè)在45℃時(shí)3分鐘內(nèi)水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個(gè)活力單位。則15粒種子或15株幼苗的總活力單位=C酶×n酶×V酶式中C標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖的濃度C酶為種子酶或幼苗酶分解淀粉產(chǎn)生的麥芽糖的濃度N酶為酶液稀釋的倍數(shù)V酶為提取酶液的總體積相關(guān)內(nèi)容1.酶的活力：是指酶催化*一化學(xué)反響的能力，酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的*一化學(xué)反響的反響速率來表示，兩者呈線性直線關(guān)系。酶催化的反響速率越大，酶的活力越強(qiáng)。所以測定酶的活力就是測定反響速率。酶催化的反響速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示，在酶活力測定實(shí)驗(yàn)中底物往往過量，而產(chǎn)物從無到有，所以實(shí)際酶活力測定時(shí)一般以測定產(chǎn)物的增加量為準(zhǔn)。2.酶的活力單位：〔U，activityunit〕在一定條件下，一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為酶單位。酶的含量可以用每g酶制劑或與每ml酶制劑含有多少酶單位來表示〔U/g或U/ml〕2.在小麥、大麥、黑麥的休眠種子中只含有β—淀粉酶，α—淀粉酶是在發(fā)芽過程中形成的，所以在禾谷類萌發(fā)的種子和幼苗中，這兩類淀粉酶都存在。其活性隨萌發(fā)時(shí)間的延長而增高。3.α—淀粉酶是工業(yè)上使用最廣泛的酶之一，它在PH3.6下短時(shí)間內(nèi)即可鈍化，β—淀粉酶不耐熱，加熱至70度以上即可鈍化。利用此原理可以滅活其中一種酶，測定另一種酶的活性。考前須知1.實(shí)驗(yàn)小麥種子萌發(fā)前需充分浸泡24小時(shí)，然后均勻的放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿或解剖盤中，開場兩三天內(nèi)要需保證水分供給充足，之后根系興旺后澆水不可過多。2.萌發(fā)情況不同，酶活力也不同：剛萌發(fā)出胚的小麥，酶活力增加迅速，之后隨發(fā)芽天數(shù)增加繼續(xù)增加，但幅度減慢，當(dāng)幼苗生長超過半個(gè)月后，酶活力不但不增長，反而下降。同一天發(fā)芽的幼苗高株比矮株的酶活力略高。3.酶的提取溫度在0---4℃時(shí)比在25℃時(shí)酶活力略高，這是因?yàn)榈蜏貤l件下提取易于保持酶的活力。思考題1.為什么提取酶的過程在0---4℃條件下進(jìn)展？測定酶活性時(shí)要在45℃條件下水解淀粉？2.本實(shí)驗(yàn)比擬淀粉酶活性時(shí)，采用的4支試管各說明什么問題？3.小麥萌發(fā)過程中淀粉酶活性升高的原因和意義是什么？實(shí)驗(yàn)四維生素C的定量測定—2，6-二氯酚靛酚滴定法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)定量維生素C的原理和方法掌握微量滴定技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理維生素C是人類營養(yǎng)中最重要的維生素之一，缺乏時(shí)會產(chǎn)生壞血病，因此，又稱為抗壞血酸。它對物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用，近年來發(fā)現(xiàn)它還能增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的抵抗力，并具有對化學(xué)致癌物的阻斷作用。維生素C是具有L-系糖構(gòu)型的不飽和多羥基化合物，屬于水溶性維生素。它分布很廣，植物的綠色局部及許多水果〔桔類、草莓、山楂、辣椒等〕的含量都很豐富。維生素C具有很強(qiáng)的復(fù)原性，在堿性溶液中加熱并有氧化劑存在時(shí)，維生素C易被氧化而破壞。在中性和微酸性環(huán)境中，維生素C能將染料2，6—二氯酚靛酚復(fù)原成無色的復(fù)原型的2，6—二氯酚靛酚，同時(shí)將維生素C氧化成脫氫維生素C。氧化型的2，6—二氯酚靛酚在酸性溶液中呈現(xiàn)紅色，在中性或堿性溶液中呈蘭色。當(dāng)用2，6—二氯酚靛酚滴定含有維生素C的酸性溶液時(shí)，在維生素C尚未全被氧化時(shí)，滴下的2，6—二氯酚靛酚立即被復(fù)原成無色。但當(dāng)溶液中的維生素C剛好全部被氧化時(shí)，滴下的2，6—二氯酚靛酚立即時(shí)溶液呈紅色。所以，當(dāng)溶液由無色變?yōu)槲⒓t色時(shí)即表示溶液中的維生素C剛好全部被氧化，此時(shí)即為滴定終點(diǎn)，從滴定時(shí)2，6—二氯酚靛酚溶液的消耗量，可以計(jì)算出被檢物質(zhì)中復(fù)原型維生素C的含量。其化學(xué)反響式如下：儀器、試劑〔一〕儀器：研缽、天平、容量瓶〔100ml〕、量筒、移液管、錐形瓶〔50ml〕、微量滴定管、漏斗〔二〕材料、試劑1、新鮮蔬菜或新鮮水果2、1%草酸溶液1g草酸溶于100ml蒸餾水中3、2%草酸溶液2g草酸溶于100ml蒸餾水中4、標(biāo)準(zhǔn)維生素C溶液準(zhǔn)確稱取20mg純維生素C粉狀結(jié)晶于1%草酸溶液中，稀釋至100ml，再取其中10ml稀釋至100ml，即得0.02mg/ml的維生素C溶液。在使用前臨時(shí)配制。5、0.02%2，6—二氯酚靛酚溶液溶解50mg2，6—二氯酚靛酚于約200ml含有52mg的NaHCO3的熱水中，冷后稀釋至250ml，過濾，裝于棕色瓶中，放入冰箱中保存。使用時(shí)用維生素C標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)定其濃度。實(shí)驗(yàn)步驟〔一〕2，6—二氯酚靛酚溶液的標(biāo)定：取5ml維生素C標(biāo)準(zhǔn)液及5ml1%草酸溶液于50ml的錐形瓶中，用配制好的2，6—二氯酚靛酚溶液于微量滴定管中滴定至粉紅色出現(xiàn)，并保持15s不褪色，即滴定終點(diǎn)，此時(shí)所用染料的體積相當(dāng)于0.1mg維生素C，由此可求出每ml2，6—二氯酚靛酚溶液相當(dāng)于維生素C的mg數(shù)?！捕撤Q取新鮮蔬菜或水果〔要有大、中、小各局部的代表，洗凈，除去不可食局部，切碎，混勻〕約10克，于研缽中，參加等體積的2%草酸溶液研磨成漿狀，得勻漿液。將勻漿液移入100ml容量瓶中，可用1%草酸溶液幫助轉(zhuǎn)移，參加30%Zn〔AC〕2和15%K4Fe〔〕6溶液各5ml，脫色，然后用1%的草酸稀釋至刻度，充分搖勻，靜止幾分鐘后過濾?！矖壢プ畛趿鞒龅膸缀辽芤骸场踩秤靡埔汗芪V液5或10ml于50ml的錐形瓶中，立即用標(biāo)定過的2，6—二氯酚靛酚溶液滴定，直至溶液呈淺粉紅色15s不褪色為止。記錄所用染料的ml數(shù)。為了防止其它物質(zhì)的干擾，滴定過程不得超過2min?！泊瞬襟E平行作2—3次〕計(jì)算維生素C含量〔mg/100g樣品〕=〔VT/W〕×100式中：V為滴定樣品所耗用的染料的平均ml數(shù)T為1ml染料相當(dāng)于維生素C的mg數(shù)W為滴定時(shí)所用樣品稀釋液中含樣品的g數(shù)考前須知1.整個(gè)滴定過程要迅速，防止復(fù)原型的維生素C被氧化。滴定過程一般不超過2min。滴定所用的染料不應(yīng)少于1ml或多于4ml，假設(shè)滴定結(jié)果不在此范圍，則必須增減樣品量或?qū)⑻崛∫合♂專?.本實(shí)驗(yàn)必須在酸性條件下進(jìn)展，在此條件下，干擾物反響進(jìn)展很慢；3.提取液**含有其它復(fù)原性的物質(zhì)，均可與2，6—二氯酚靛酚反響，但反響速度均較維生素C慢，因而，滴定開場時(shí)，染料要迅速參加，而后盡可能一滴一滴地參加，并要不斷地?fù)u動錐形瓶直至呈粉紅色15s不褪色為終點(diǎn)；4.假設(shè)提取液中色素很多時(shí)，滴定不易看出顏色變化，需脫色，可用白陶土、30%Zn〔AC〕2和15%K4Fe〔〕6溶液等，本實(shí)驗(yàn)用30%Zn〔AC〕2和15%K4Fe〔〕6溶液脫色，假設(shè)色素不多，可不脫色，直接滴定。5.在生物組織和組織提取液中，維生素C還能以脫氫維生素C及結(jié)合維生素C的形式存在，它們同樣具有維生素C的生理作用，但不能將2，6—二氯酚靛酚復(fù)原脫色.6.2%草酸有抑制抗壞血酸酶的作用，而1%的草酸無此作用思考題1.指出3—4種維生素C含量豐富的物質(zhì)。2.為了準(zhǔn)確測定維生素C的含量，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意哪些操作步驟？為什么？實(shí)驗(yàn)五蛋白質(zhì)的提取、別離純化及定量實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)的提取方法。2.掌握凝膠過濾法使蛋白質(zhì)脫鹽。3.掌握紫外分光光度法或考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的含量。實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的提?。蝴}析法或等電點(diǎn)法。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在蛋白質(zhì)溶液中存在以下平衡：蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)與解離程度受溶液的酸堿度影響，當(dāng)溶液的pH到達(dá)一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場中既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時(shí)溶液的pH值稱此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同蛋白質(zhì)各有其特異的等電點(diǎn)，在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最低，可用于提取蛋白質(zhì)。在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于外表生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋?。無機(jī)鹽〔硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等〕濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨中析出。由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類濃度時(shí)，又能再溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆沉淀反響，可用于提取蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的別離純化蛋白質(zhì)溶液中如含有無機(jī)鹽離子，用葡聚糖凝膠過濾法可使蛋白質(zhì)與無機(jī)鹽別離，效果理想。葡聚糖凝膠〔商品名SepHade*〕，又稱右旋糖苷，它是葡萄糖通過α－1,6－糖苷鍵形成的長鏈，與交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)生成〔見圖〕。在合成凝膠時(shí)，控制交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷的用量，可以制成網(wǎng)孔大小不同的葡聚糖凝膠〔見圖〕，即不同規(guī)格凝膠。葡聚糖凝膠從G-10到G-200有多種類型，G后的數(shù)字由每克干膠充分溶脹后吸水的克數(shù)乘以十所得，同時(shí)也代表網(wǎng)孔大小，G后的數(shù)字越小，其溶脹后的網(wǎng)孔越小，一般G-10到G-50適用于蛋白質(zhì)與小分子或無機(jī)鹽的別離，G-75到G-200適用于分子量大于一萬的蛋白質(zhì)的別離。本實(shí)驗(yàn)用G-25使蛋白質(zhì)與硫酸銨別離，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的鹽溶液進(jìn)入葡聚糖凝膠時(shí)，小分子的硫酸銨擴(kuò)散進(jìn)入G-25的網(wǎng)孔中，而大分子的蛋白質(zhì)因顆粒直徑大，不能進(jìn)入網(wǎng)孔中，被排阻在凝膠顆?！补潭ㄏ唷车耐饷?，參加洗脫液〔流動相〕洗脫，因大分子蛋白質(zhì)從凝膠顆粒的縫隙向下洗脫，阻滯力小，可首先被洗脫下來，故洗脫體積小。而小分子的硫酸銨因擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔中，阻滯力大，需要較大的洗脫體積才能從柱中洗出，這樣可使蛋白質(zhì)與硫酸銨很容易別離開?！踩车鞍踪|(zhì)的定量----考馬斯亮藍(lán)法〔Bradford法〕測定蛋白質(zhì)含量考馬斯亮藍(lán)G-250是一種能使蛋白質(zhì)染色的染料，在酸性溶液中，考馬斯亮藍(lán)本身呈紅褐色，在465nm處有最大光吸收。參加蛋白質(zhì)后，該染料能與蛋白質(zhì)快速結(jié)合，生成染料－蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物的最大光吸收峰移向595nm處，消光系數(shù)更大。蛋白質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)〔1——1000ul/ml〕與考馬斯亮藍(lán)反響的復(fù)合物在595nm處的吸光度與蛋白質(zhì)的濃度呈直線關(guān)系，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G250的結(jié)合十分迅速，約2min即反響完全，其復(fù)合物在1h內(nèi)保持穩(wěn)定，儀器、試劑1.過硫酸銨2.納氏試劑：500ml將HgI211.5g溶于無離子水中，稀釋至50ml，參加6mol/LnaOH50ml,靜止后取清液儲存于棕色瓶中。3.無離子水〔洗脫液〕、4.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液5.考馬斯亮藍(lán)試劑稱取考馬斯亮藍(lán)G-250100mg，加95％乙醇〔AR〕50ml，溶解后參加85％H3PO4〔W/V〕100ml，加水稀釋至1000ml，保存于棕色瓶中。6.SepHade*G-257.紫外可見分光