分子克隆常用工具酶

關于分子克隆常用工具酶第一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日

每一單鏈具有5’-3’極性兩條單鏈間以氫鍵連接兩條單鏈，極性相反，反向平行以中心為軸，向右盤旋StructureandfeaturesDNA的基本結構植物基因工程第二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日Replication植物基因工程第四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日分子克隆操作過程：

克隆目的基因→將目的基因與載體用限制性內切酶切割和連接，制成重組DNA→導入宿主細胞→篩選、鑒定→擴增和表達。植物基因工程第五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉錄等有關的各種酶系統(tǒng)稱為工具酶。要把不同基因的DNA線形分子片段準確地切出來，需要各種限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease）；要把不同片段連接起來，需要DNA連接酶（ligase）；要合成基因或其中的一個片段，需要DNA聚合酶（polymerase）等。因此，酶是DNA重組技術中必不可少的工具。植物基因工程第六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA連接酶磷酸酶核苷酸激酶核苷酸轉移酶甲基化酶植物基因工程第七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日限制性核酸內切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶用于核酸操作的常用工具酶植物基因工程第八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日工具酶名稱

主要功能限制性內切核酸酶Restrictionendonucleases在DNA分子內部的特異性的堿基序列內部進行切割DNA連接酶DNAligase將兩條以上的線性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個整體DNA聚合酶IDNApolymeraseI通過向3‘端逐一增加核苷酸以填補雙鏈DNA分子上的單鏈裂口，即5’→3‘DNA聚合酶活性與3'→5'及5'→3'-外切酶活性多核苷酸激酶DNApolymerasekinease催化將把一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的5'-OH末端上反轉錄酶Reversetranscriptase以RNA分子為模板合成互補的cDNA鏈DNA末端轉移酶DNAterminaltransferase將同聚物尾巴加到線性雙鏈或單鏈DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末端標記dNTP降解酶S1nucleaseS1降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5'磷酸的單核苷酸或寡聚核苷酸，同時也可切割雙鏈核酸分子的單鏈TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase能在高溫（72℃）下的單鏈DNA為模板，從5'→3'方向合成新生的互補鏈常用的工具酶性質及功能植物基因工程第九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)分子克隆最常用兩個工具酶“分子剪刀”

⒈限制性核酸內切酶——在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈切開。如EcoRI,HpaI“分子膠”⒉DNA連接酶——促使具有互補粘性末端或平頭末端的載體和供體DNA片段連接，形成重組DNA分子。植物基因工程第十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日限制性內切酶

Restrictionenzymes“分子剪刀”

⒈限制性核酸內切酶——在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈切開。如EcoRI,HpaI植物基因工程第十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日限制性內切酶是一種能識別DNA上特定堿基組成的序列并在這些序列位點上切斷DNA分子水解磷酸二酯鍵的一種內切核酸酶。植物基因工程第十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日一、限制性核酸內切酶的分類植物基因工程第十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日二、限制性核酸內切酶的命名原則

名屬種株序菌株來源稱名名名號EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacoliR

HindⅢHindⅢHaemophilusinfluenzaed

HindⅡHindⅡHaemophilusinfluenzaed

HpaⅠHpa/ⅠHaemophilusparainfluenzaea

HindⅢ代表從流感噬血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中分離到的第3個限制酶。植物基因工程第十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日

一般分子量為60kd，單鏈多肽，最適pH為6～8 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巰基有保護作用 對熱不穩(wěn)定，通常貯存于–20℃環(huán)境。為避免反復凍溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用時添加相應的緩沖液稀釋，降低反應液中甘油的濃度。三、限制性核酸內切酶學特性植物基因工程第十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日每一種酶都有各自特異識別位點它對底物要求有特異的序列，通常的識別序列是4bp～6bp，有些則為7bp～8bp，甚或多于8bp。多數(shù)限制酶的識別序列為回文結構，在識別序列內或其附近水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵。植物基因工程第十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日不同限制性內切酶切割的三種結果植物基因工程第十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第二十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第二十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`BglIIBamHⅠ同尾酶植物基因工程第二十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第二十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日①溫度：一般37℃ ②鹽離子濃度：Na＋，Mg2＋ ③緩沖體系：具有穩(wěn)定pH環(huán)境的Tris-HCl緩沖體系DTT用于保持酶

穩(wěn)定性和活性 ④反應體積和甘油濃度：商品化的限制性內切核酸酶均加50％甘油作為保護劑，一般在-20℃保存。酶切反應時，加酶的體積一般不超過總反應的10％，否則甘油濃度過高，影響酶切反應⑤反應時間：通常為1h；進行大量DNA酶切反應時一般讓酶解過夜⑥DNA純度和結構DNA樣品中所含的蛋白質、有機溶劑、RNA等雜質會影響酶切反應的速度和完全程度酶切的底物一般為雙鏈DNA，DNA的甲基化位置會影響酶切反應。四、影響酶切反應的條件*植物基因工程第二十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日II型限制性核酸內切酶酶解反應體系植物基因工程第二十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日“星”活性Staractivity

“星”活性：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端ppH值等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性所謂的現(xiàn)象。

在名稱右上角加一個星號(*)表示,如EcoRⅠ*：AATT；EcoRⅠ：GAATTC必須采用規(guī)范的實驗步驟,應用推薦的反應條件。 植物基因工程第二十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日位點偏愛（sitepreference）某些限制性內切酶對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率。植物基因工程第二十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)DNA連接酶DNALigase植物基因工程第二十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日定義：催化DNA上裂口兩側(相鄰)核苷酸裸露的3＇羥基和5＇磷酸之間形成共價結合的磷酸二酯鍵，使斷開的DNA裂口連接起來功能：具有修復單鏈或雙鏈的能力,在DNA重組、復制和損傷后的修復中都起關鍵作用。一、DNA連接酶性質植物基因工程第二十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第三十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日T4DNAligaseE.coliDNAligase來源T4噬菌體大腸桿菌分子量6000075000輔助因子ATPNAD+底物雙鏈DNA分子的粘、平端RNA-DNA雜合體，RNA鏈缺口、雙鏈DNA分子中的單鏈缺口同源互補粘端雙鏈分子中的單鏈缺口應用范圍廣泛、效率高窄兩種DNA連接酶比較二、常用連接酶植物基因工程第三十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日連接反應的溫度是影響轉化效率的最重要參數(shù)。多數(shù)內切酶產(chǎn)生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持連接酶活性的最佳反應溫度卻是37℃ 但在該溫度下，粘性末端之間的氫鍵結合是不穩(wěn)定的，因此最適溫度是粘性末端的Tm值和連接酶最適溫度的折衷，所以連接反應一般采用16℃過夜。三、DNA連接酶的反應條件植物基因工程第三十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日DNA濃度：外源片段濃度比載體DNA濃度高5-10倍由于平末端的連接效率比粘性末端要低得多，故在平末端連接反應中，T4DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要求較高。防止環(huán)化：堿性磷酸酶預先處理質粒載體時間：過夜最好植物基因工程第三十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日1）粘性末端DNA片段的連接植物基因工程第三十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日直接用T4DNA連接酶連接：效率不高，較少采用。同聚物加尾連接平末端DNA片段：先用末端核苷酸轉移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA連接酶進行連接用銜接物連接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上構建限制性核酸內切酶酶切位點，經(jīng)酶切后產(chǎn)生特異的粘性末端，從而與具有互補末端的DNA連接2)平末端DNA片段的連接植物基因工程第三十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日應用互補同聚物加尾法連接DNA片段植物基因工程第三十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日用銜接物分子連接平末端的DNA片段銜接物：指用化學方法合成的一段由若干個核苷酸組成的、具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的寡核苷酸片段植物基因工程第三十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日四、重組DNA實驗的一般程序選用一種對載體DNA只具唯一限制識別位點的限制酶（如EcoRI）作位點特異的切割，形成全長的具粘性末端的線性DNA分子再將外源DNA片段也用同一種酶作相同的消化。混合，加入DNA連接酶。由于具有相同的（如EcoRI）粘性末端，能退火形成雙鏈結合體。其中單鏈缺口經(jīng)DNA連接酶封閉之后，便產(chǎn)生穩(wěn)定的雜種DNA分子。植物基因工程第三十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)其他分子克隆工具酶植物基因工程第三十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日一、DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶IK1enow片段T4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆轉錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶RNA聚合酶依賴于DNA的DNA聚合酶植物基因工程第四十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日用途：DNA缺口平移中標記DNA探針大腸桿菌DNA聚合酶I

以一條DNA為模板通過聚合作用把脫氧核苷酸加到雙鏈DNA分子的3’-OH端而合成新的DNA.植物基因工程第四十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日基本用途植物基因工程第四十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日

大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)

大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理,獲得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。植物基因工程第四十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第四十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第四十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性。在無dNTP時，可以從任何3’-OH端外切

T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)植物基因工程第四十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日基本用途植物基因工程第四十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第四十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日TaqDNA聚合酶是從棲熱水生菌(Thermusaquaticus)中分離純化的依賴DNA的DNA聚合酶，最適溫度75℃-80℃需要Mg2+(10mmol／L)，在低濃度Mn2+(2mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一價陽離子高至0.1moI／L對活性無影響，而最適濃度NaCl為40mmol/L，KCl為60mmol/L最適pH7.8(Tris-HCl)，與大腸桿菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高溫和無核酸酶活性TaqDNA聚合酶植物基因工程第四十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日催化RNA體外合成反應依賴DNA的RNA聚合酶不依賴DNA的RNA聚合酶

RNA聚合酶植物基因工程第五十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日反轉錄酶(reversetranscriptase)

反轉錄酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA為模板聚合cDNA鏈,同時又具有3′

→5′和5′

→3′的RNA外切核酸酶活性。AMV和MLV。主要用途：轉錄mRNA成為cDNA制備基因片段植物基因工程第五十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈植物基因工程第五十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日DNA和RNA的修飾酶核酸酶SI堿性磷酸酶磷酸激酶末端脫氧核苷酸轉移酶甲基化酶植物基因工程第五十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日1）單鏈核酸酶SI功能：

降解ssDNA或ssRNA形成5’-磷酸末端的單或寡核苷酸片段。植物基因工程第五十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日應用：分析DNA：RNA雜交體結構（S1mapping）。確定內含子部位。切除DNA片段上的單鏈末端，形成平末端.

切開cDNA合成過程中形成的發(fā)夾環(huán)在限制酶位點上產(chǎn)生小缺失植物基因工程第五十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第五十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日Rnase

和

DNaseRNase-FreeDNase是一種DNaseI（核酸內切酶），可以降解雙鏈或單鏈DNA。RNaseH：特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。RNaseA：廣泛應用的核酸內切酶。對RNA有水解作用，但對DNA則不起作用。Rnase酶非常穩(wěn)定，常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。DEPC處理。植物基因工程第五十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日堿性磷酸酶

功能：催化去除DNA、RNA上的5’端磷酸基團,從DNA片段上除去5’磷酸以防自身連接。用途：在DNA連接之前常用它處理克隆載體以防止載體自身連接。植物基因工程第五十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日CalfIntestinalAlkalinePhosphatase(CIAP)植物基因工程第五十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日磷酸激酶T4-多核苷酸磷酸激酶植物基因工程第六十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日植物基因工程第六十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日末端脫氧核苷酸轉移酶

功能：在一定條件下，催化將一個一個的脫氧核苷酸，沿著5’到3’加到DNA鏈的3’-OH末端。該過程不需要DNA模板，對雙鏈、單鏈DNA都適用。經(jīng)常用于人工粘性末端的構建。末端脫氧核苷酰轉移酶(TDT)植物基因工程第六十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日甲基化酶

原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護宿主DNA不被相應的限制酶所切割。Dam甲基化酶可在GAmTC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。受其影響的酶有BccllII、MbbooII等。Dcm甲基化酶識別CCmAGG或CCmTGG序列，在第二個胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。受其影響的酶有EccooRIIII等植物基因工程第六十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日基因工程中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段DNA聚合酶I大片段具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基植物基因工程第六十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日思考題：載體構建的工具酶主要有那些類型？限制性核酸內切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制與修飾。核酸內切酶命名原則、操作注意事項及產(chǎn)生星活性的原因、影響其酶活性的因素。T4DNA連接酶的性質及用途.Klenow酶的基本性質及用途。其他工具酶的用途。植物基因工程第六十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日練習題第六十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日1.一種DNA分子經(jīng)三種限制酶完全酶切后得如下結果：

EcoRI5kbEcoRI/HindIII1、2、3、4kb

HindIII3kb、7kbEcoRI/PstI2、3、5kb

PstI10kbHindIII/PstI1、3、6kb

將各限制酶位點繪制在DNA分子上。

2.

另一DNA分子經(jīng)相同處理后得如下結果，將各限制酶位點標在DNA分子上。

EcoRI1、3、6kbEcoRI/HindIII1、3kb

HindIII4、6kbEcoRI/PstI1、3、5kb

PstI2、8kbHindIII/PstI2、6kb

3.下圖中的一段DNA分子上有兩個限制酶PstI和EcoRI識別位點，兩位點相距10bp，現(xiàn)有一研究生要分析EcoRI右側500bp區(qū)域內的功能，他需要在這一區(qū)域內獲得各種缺失突變體以確定某功能區(qū)，他應如何設計此實驗？假定EcoRI—PstI間的10bp除去后并不影響任何結果分析，但PstI位點左側的DNA不能除去

第六十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日10bp500bp

PstIEcoRI4.假如PstI位點為另一限制酶HindIII，實驗又該如何設計？

5.現(xiàn)有一研究者打算將一EcoRIDNA片段克隆到一個DNA分子的BamHI位點以便DNA擴增，但擴增后的DNA分子又可用BamHI限制酶將插入的片段回收，如何設計此實驗。

6.一研究生要將一質粒（pI）上的BamHI-HindIII片段取代另一質粒（pII）上的BamHI-XbaI片段，所獲重組質粒（pIII）上的插入片段要求能用BamHI-HindIII進行回收，問如何設計此實驗？10bp500bp

HindIIIEcoRI第六十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期日

HXbH5kbpI1kb6kbpII.5kb6kbpIII1kb

BBB7.現(xiàn)有一重組質粒的限制酶譜和克隆到的基因轉錄方向入圖所示：已知HindIII克隆片段中的BamHI（3kb）片段含有一完整的基因編碼區(qū)，現(xiàn)要將此3kb的BamHI片段克隆到另一表達載體pB的BamHI位點，如何才能使插入片段與表達載體中的基因處于相同的閱讀框架？如何證明