蛋白質(zhì)的定性定量分析及保存

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法

蛋白質(zhì)相對(duì)分子量測(cè)定

純化蛋白質(zhì)的濃縮、干燥和保存

蛋白質(zhì)的免疫印跡分析

(westernblotting)蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究常見(jiàn)方法當(dāng)前1頁(yè)，總共64頁(yè)。第一節(jié)蛋白質(zhì)的含量測(cè)定當(dāng)前2頁(yè)，總共64頁(yè)。目前蛋白質(zhì)的直接定量分析技術(shù)只能測(cè)定樣品的總蛋白含量；目前沒(méi)有任何方法能直接分析樣品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考馬斯亮藍(lán)）、BCA法、紫外分光光度法等。當(dāng)前3頁(yè)，總共64頁(yè)。蛋白質(zhì)的比色法含量測(cè)定基于蛋白質(zhì)的元素組成特點(diǎn)基于蛋白質(zhì)的化學(xué)顯色反應(yīng)基于蛋白質(zhì)的光吸收特性當(dāng)前4頁(yè)，總共64頁(yè)。一、基于蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)

凱氏定氮法各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此只要測(cè)定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16當(dāng)前5頁(yè)，總共64頁(yè)。凱氏定氮法1883年，丹麥化學(xué)家Kjeldahl建立，基于蛋白質(zhì)的含氮量在16%左右。蛋白質(zhì)+硫酸→CO2+H2O+NH3→硫酸銨+強(qiáng)堿→氨優(yōu)點(diǎn)：適用樣品廣泛，結(jié)果可靠缺點(diǎn)：樣品中非蛋白態(tài)氨影響測(cè)定值；蛋白質(zhì)氨基酸有偏差時(shí)（大量堿性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）誤差較大；操作繁瑣。當(dāng)前6頁(yè)，總共64頁(yè)。二、基于蛋白質(zhì)的光吸收特性

紫外光譜(A280)吸收法

這一方法可用來(lái)快速檢測(cè)溶液中是否含有蛋白質(zhì)成分。通常用于柱層析過(guò)程中檢測(cè)蛋白質(zhì)的洗脫峰。當(dāng)前7頁(yè)，總共64頁(yè)。原理芳香族氨基酸的紫外吸收蛋白質(zhì)中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽鍵在215nm附近有特異吸收?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定該波長(zhǎng)的光吸收度，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。C＝A/KL，其中A為吸光度，K為摩爾消光系數(shù)，L為光程。K值可通過(guò)各種方法得到（包括軟件分析等）。當(dāng)前8頁(yè)，總共64頁(yè)。所需時(shí)間

幾分鐘優(yōu)點(diǎn)

快速缺點(diǎn)

核酸可引起強(qiáng)干擾作用靈敏度0.2mg/ml～2mg/ml

對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)破壞性

不是嚴(yán)格的定量，適用于測(cè)定蛋白質(zhì)粗提液當(dāng)前9頁(yè)，總共64頁(yè)。計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事項(xiàng)

石英比色杯

調(diào)零所用溶液

配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白所用溶液

光密度范圍當(dāng)前10頁(yè)，總共64頁(yè)。二、Bradford檢測(cè)法由Bradford等人于1976年建立

這是一種迅速、可靠的通過(guò)染色法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)含量的方法目前絕大多數(shù)公司都提供基于此原理的蛋白質(zhì)定量試劑盒基于蛋白質(zhì)的化學(xué)顯色反應(yīng)當(dāng)前11頁(yè)，總共64頁(yè)。原理

該法是基于考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)。藍(lán)色復(fù)合物在595mn波長(zhǎng)處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測(cè)595mn的光吸收值大小計(jì)算蛋白的含量當(dāng)前12頁(yè)，總共64頁(yè)。所需時(shí)間10min優(yōu)點(diǎn)

快速（反應(yīng)時(shí)間僅需2min）

敏感，幾乎沒(méi)有蛋白質(zhì)損失缺點(diǎn)

用這種測(cè)定方法對(duì)蛋白質(zhì)引起不可逆的變性靈敏度25ug/ml～200ug/ml

對(duì)各種純化蛋白質(zhì)反應(yīng)不同當(dāng)前13頁(yè)，總共64頁(yè)。計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法注意事項(xiàng)

標(biāo)準(zhǔn)曲線在2.5ug～15ugBSA濃度范圍內(nèi)保持線性關(guān)系

反應(yīng)10～15min后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質(zhì)溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀

若選用目的蛋白來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線或用另一種方法來(lái)校正，所測(cè)蛋白濃度較準(zhǔn)確當(dāng)前14頁(yè)，總共64頁(yè)。三、Lowry檢測(cè)法

1951年Lowry在Folin酚試劑法和雙縮脲法的基礎(chǔ)上建立這一標(biāo)準(zhǔn)、快速的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法已得到廣泛應(yīng)用，在檢測(cè)之前可通過(guò)蛋白質(zhì)沉淀將干擾物質(zhì)去除基于蛋白質(zhì)的化學(xué)顯色反應(yīng)當(dāng)前15頁(yè)，總共64頁(yè)。原理

首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產(chǎn)生鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物的深藍(lán)色，這種深藍(lán)色的復(fù)合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計(jì)算蛋白質(zhì)的含量當(dāng)前16頁(yè)，總共64頁(yè)。所需時(shí)間40min優(yōu)點(diǎn)

一種可靠的蛋白質(zhì)定量方法

不同蛋白質(zhì)之間差別很小缺點(diǎn)

某些試劑不穩(wěn)定靈敏度5ug/ml～100ug/ml

干擾物質(zhì)多

反應(yīng)速度慢

使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性當(dāng)前17頁(yè)，總共64頁(yè)。計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法注意事項(xiàng)

在加入試劑30min后呈色達(dá)到飽和，時(shí)間延長(zhǎng)顏色信號(hào)減弱

許多干擾物質(zhì)降低顏色反應(yīng)

高鹽濃度可引起沉淀當(dāng)前18頁(yè)，總共64頁(yè)。四、BCA(二喹啉甲酸)檢測(cè)法

這是近年來(lái)新研制的一種改進(jìn)的Lowry測(cè)定法，反應(yīng)簡(jiǎn)單而且?guī)缀鯖](méi)有干擾物質(zhì)的影響，有試劑盒出售。基于蛋白質(zhì)的化學(xué)顯色反應(yīng)當(dāng)前19頁(yè)，總共64頁(yè)。原理

在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2＋還原成Cu＋。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。當(dāng)前20頁(yè)，總共64頁(yè)。優(yōu)點(diǎn)

與Lowry法相比幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響缺點(diǎn)

蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變性靈敏度

標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)：10～1200ug/ml

單一試劑

終產(chǎn)物穩(wěn)定

反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)

微量檢測(cè)：0.5～10ug/ml當(dāng)前21頁(yè)，總共64頁(yè)。計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線法注意事項(xiàng)

與Lowry相比，采用BCA法時(shí)，如果樣品中含有脂類物質(zhì)將明顯提高光吸收值

為促進(jìn)BCA法的反應(yīng)進(jìn)程，可將樣品適當(dāng)加熱當(dāng)前22頁(yè)，總共64頁(yè)。其它蛋白質(zhì)的定性定量方法1.蛋白質(zhì)的染色定量2.ELISA測(cè)定3.放射免疫測(cè)定當(dāng)前23頁(yè)，總共64頁(yè)。第二節(jié)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量測(cè)定分子量測(cè)定(molecularweight,MW)排阻層析沉降平衡超速離心動(dòng)態(tài)彈性光散射孔徑梯度電泳質(zhì)譜(ESI-MS)當(dāng)前24頁(yè)，總共64頁(yè)。1.SDS測(cè)定分子量基本原理：SDS可以破壞蛋白質(zhì)中的疏水鍵和氫鍵，并按一定比例（1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS）和蛋白質(zhì)組成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶的負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其本身的電荷量，并與蛋白質(zhì)的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質(zhì)二硫鍵，使蛋白質(zhì)呈橢圓棒形，其軸長(zhǎng)與分子量成正比。＝q/f＝q/6r，所有蛋白質(zhì)的遷移率都相同。當(dāng)前25頁(yè)，總共64頁(yè)。在SDS中遷移的蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率的關(guān)系符合下述公式：lgMr＝lgK－bm＝K1－bm其中Mr為蛋白質(zhì)相對(duì)分子量，K、K1為常數(shù)，b為斜率，m為遷移率。注意：此公式也適用于核酸在瓊脂糖凝膠中的遷移當(dāng)前26頁(yè)，總共64頁(yè)。當(dāng)前27頁(yè)，總共64頁(yè)。當(dāng)前28頁(yè)，總共64頁(yè)。在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上做出標(biāo)準(zhǔn)曲線注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率會(huì)根據(jù)所用凝膠濃度而發(fā)生微小的改變。當(dāng)前29頁(yè)，總共64頁(yè)。2.凝膠過(guò)濾層析法測(cè)定分子量蛋白質(zhì)在凝膠過(guò)濾層析柱中的洗脫體積Ve，與其分子量的關(guān)系如下式所示：

lgMr＝K1－K2

Ve在實(shí)驗(yàn)中，只要測(cè)得幾種蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物的Ve，并以它們的lgMr對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出樣品的Ve，即可從圖中得到樣品的分子量。當(dāng)前30頁(yè)，總共64頁(yè)。SDS與凝膠過(guò)濾法是互補(bǔ)的凝膠過(guò)濾法測(cè)得的是蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)（如果它有的話）的分子量；SDS測(cè)得的是蛋白質(zhì)亞基的分子量；在有2-巰基乙醇（或DTT）存在時(shí)，SDS可測(cè)得蛋白質(zhì)每條多肽鏈的分子量。綜合應(yīng)用這兩種方法，可得到待測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的許多信息。當(dāng)前31頁(yè)，總共64頁(yè)。例如：凝膠過(guò)濾法得到的蛋白質(zhì)分子量：180kDSDS（不加還原劑）結(jié)果：45kDSDS（加還原劑）結(jié)果：兩條蛋白帶（15kD和30kD）則結(jié)論是：該蛋白質(zhì)由4個(gè)相同的亞基組成，每個(gè)亞基由兩條多肽鏈經(jīng)二硫鍵連接而成，兩條多肽鏈的分子量分別為15kD和30kD。當(dāng)前32頁(yè)，總共64頁(yè)。3.質(zhì)譜法是最精確的分子量測(cè)定方法質(zhì)譜（MassSpectrometry，MS）是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比（m/z）的大小順序排列的圖譜。由于ESI和MALDI兩大電離技術(shù)的出現(xiàn)，質(zhì)譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域，包括蛋白質(zhì)分子量測(cè)定。精確度0.01～0.1％。當(dāng)前33頁(yè)，總共64頁(yè)。當(dāng)前34頁(yè)，總共64頁(yè)。第三節(jié)純化蛋白質(zhì)的濃縮、干燥和保存當(dāng)前35頁(yè)，總共64頁(yè)。一、蛋白質(zhì)的濃縮超濾法使用特制薄膜對(duì)溶液中的溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過(guò)濾的技術(shù)。常用離心力使蛋白質(zhì)透過(guò)濾膜，而使蛋白質(zhì)截留在膜內(nèi)。當(dāng)前36頁(yè)，總共64頁(yè)。冷凍干燥法在冷凍狀態(tài)下使樣品中水分升華而濃縮蛋白質(zhì)的技術(shù)，保持蛋白質(zhì)構(gòu)象的最好方法。注意：必須保證蛋白質(zhì)始終處于冷凍狀態(tài)（在－70℃冰箱預(yù)冷），為提高溶解度可加賦形劑（右旋糖酐、甘露醇等）。當(dāng)前37頁(yè)，總共64頁(yè)。吸收法采用吸水劑直接吸去蛋白質(zhì)溶液中的水。PEG、蔗糖、凝膠干粉等。沉淀法硫酸銨、PEG、有機(jī)溶劑沉淀；免疫沉淀。當(dāng)前38頁(yè)，總共64頁(yè)。5.其它方法濃縮膠濃縮法離子交換法吸附法蒸發(fā)法當(dāng)前39頁(yè)，總共64頁(yè)。二、蛋白質(zhì)的干燥常壓吸收干燥真空干燥冷凍干燥噴霧干燥氣流干燥當(dāng)前40頁(yè)，總共64頁(yè)。三、蛋白質(zhì)的保存影響蛋白質(zhì)成品保存的因素：

1）空氣

2）濕度

3）水分

4）光線

5）pH值

6）時(shí)間當(dāng)前41頁(yè)，總共64頁(yè)。2.蛋白質(zhì)的保存方法低溫下保存制成干粉或結(jié)晶保存在保護(hù)劑下保存

a.惰性的生化或有機(jī)物

b.中性鹽

c.巰基試劑當(dāng)前42頁(yè)，總共64頁(yè)。第四節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究常見(jiàn)方法當(dāng)前43頁(yè)，總共64頁(yè)。蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究常見(jiàn)方法1：常規(guī)雙向電泳2：DIGE3：15N等同位素標(biāo)記4：ICAT5：iTRAQ6：SILAC當(dāng)前44頁(yè)，總共64頁(yè)。1：雙向電泳

基于2D的經(jīng)典定量分析方法。

1、樣品準(zhǔn)備和定量：抽提對(duì)照組和各種不同實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì)。

2、蛋白質(zhì)分離：蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)2D分離后染色（銀染、考染等）。

3、蛋白質(zhì)的定性與定量分析：通過(guò)與對(duì)照組相ImageMaster7.0分析出實(shí)驗(yàn)組中差異點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定差異點(diǎn)蛋白質(zhì),同時(shí)應(yīng)用軟件分析出其表達(dá)量的變化。當(dāng)前45頁(yè)，總共64頁(yè)。2：DIGE簡(jiǎn)介：

DIGE—

雙向熒光差異凝膠電泳，利用熒光染料（Cy2,Cy3,Cy5）能與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基反應(yīng)而使蛋白質(zhì)被標(biāo)記，標(biāo)記后蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量基本不受影響，等量混合標(biāo)記好的蛋白質(zhì)后進(jìn)行雙向電泳，蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化則通過(guò)不同熒光的強(qiáng)度來(lái)體現(xiàn)。技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1：高效性，同一塊凝膠上可以電泳兩個(gè)樣品，減輕了工作量；

2：與常規(guī)銀染相比靈敏度更高；

3：檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍更大；

4：定量精確,采用內(nèi)標(biāo)而消除了膠與膠之間的實(shí)驗(yàn)誤差；

5：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ImageMaster7.0（DIGE）軟件可以得到統(tǒng)計(jì)學(xué)可信的結(jié)果，降低了操作者之間的偏差。當(dāng)前46頁(yè)，總共64頁(yè)。2：DIGE

DIGE熒光定量方法流程圖.1、樣品準(zhǔn)備：提取對(duì)照組和不同實(shí)驗(yàn)組的蛋白質(zhì),定量,cy3和cy5交叉標(biāo)記，同時(shí)將所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的樣品等量混合后cy2標(biāo)記，作為內(nèi)標(biāo)。

2、蛋白質(zhì)分離：等量混合三種熒光素標(biāo)記后的蛋白質(zhì)，2D電泳分離，熒光顯色。

3、蛋白質(zhì)定量分析：ImageMaster7.0（DIGE)分析同一蛋白質(zhì)不同處理后的表達(dá)量變化。當(dāng)前47頁(yè)，總共64頁(yè)。3：代謝標(biāo)記法—15N標(biāo)記法簡(jiǎn)介：在培養(yǎng)基中添加15N，細(xì)胞經(jīng)過(guò)若干代培養(yǎng)后，蛋白質(zhì)將完全被同位素標(biāo)記，等量混合標(biāo)記與沒(méi)有標(biāo)記同位素的樣本、液相色譜和SDS分離，質(zhì)譜鑒定和定量。根據(jù)質(zhì)譜譜圖中成對(duì)峰的面積之比可判斷出同一肽段在不同樣品中的含量變化，根據(jù)二級(jí)譜圖對(duì)肽段進(jìn)行序列測(cè)定從而鑒定蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：高效性：15N標(biāo)記法是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)95%；重現(xiàn)性：降低由于樣品制備不同而造成的實(shí)驗(yàn)內(nèi)差異；靈活性：在培養(yǎng)基中添加同位素標(biāo)記15N，操作方便。缺點(diǎn)：

（1）只有已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，才可以對(duì)14N/15N標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽段的相應(yīng)質(zhì)量位移進(jìn)行預(yù)測(cè)。（2）由于使用的15N培養(yǎng)基純度>96%，無(wú)法完全置換14N,所以15N標(biāo)記的肽段在質(zhì)譜中會(huì)有額外的同位素峰。當(dāng)前48頁(yè)，總共64頁(yè)。4：化學(xué)標(biāo)記法—ICATA:ICAT試劑結(jié)構(gòu)，包括3個(gè)部分，SH反應(yīng)集團(tuán)，biotin標(biāo)簽，同位素臂，試劑具有兩種形式：重型（含8個(gè)氘）和輕型（不含氘）B:ICAT標(biāo)記定量技術(shù)流程，來(lái)源不同處理的蛋白質(zhì)分別用重型ICAT試劑和輕型ICAT試劑標(biāo)記，標(biāo)記后等量混合，胰蛋白酶酶切，親和純化得到ICAT標(biāo)記的多肽，質(zhì)譜分析，依據(jù)MS質(zhì)譜峰圖強(qiáng)度進(jìn)行定量，MS/MS鑒定肽段。當(dāng)前49頁(yè)，總共64頁(yè)。4：化學(xué)標(biāo)記法—ICATICAT法的缺點(diǎn)：（1）它不能用于標(biāo)記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質(zhì)。（2）ICAT分子量相對(duì)較大（約500Da），與蛋白質(zhì)連接后可能會(huì)造成分子的空間位阻（3）ICAT分子量相對(duì)較大（約500Da），由于在MS分析中標(biāo)簽仍保留在每個(gè)肽上，使得在碰撞誘導(dǎo)解吸（CID)條件下，很容易被片段化，那么標(biāo)簽特異化的片段離子就會(huì)使串聯(lián)質(zhì)譜分析標(biāo)記肽段的過(guò)程復(fù)雜化，（4）ICAT分子量相對(duì)較大（約500Da），這對(duì)小肽而言是一個(gè)較大的修飾物，會(huì)增加數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的復(fù)雜性（5）標(biāo)記時(shí)通常需要延長(zhǎng)時(shí)間來(lái)保證ICAT與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，這可能會(huì)造成賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸發(fā)生氨基酸局部衍化。（6）與原子結(jié)合的硫醚鍵化學(xué)穩(wěn)定性較低，可能會(huì)自發(fā)發(fā)生β-消除反應(yīng)使部分標(biāo)簽斷裂。當(dāng)前50頁(yè)，總共64頁(yè)。5:化學(xué)標(biāo)記法—iTRAQ簡(jiǎn)介：

iTRAQ試劑是可與氨基酸末端氨基及賴氨酸側(cè)鏈氨基連接的胺標(biāo)記同重元素。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在串聯(lián)質(zhì)譜中，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(113-119，121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以鑒定出蛋白質(zhì)和分析出同一蛋白質(zhì)不同處理的定量信息。iTRAQ結(jié)構(gòu)

iTRAQ包括三部分：報(bào)告部分、肽反應(yīng)部分、平衡部分。

1、報(bào)告部分：有八種，因此iTRAQ可同時(shí)標(biāo)記8組樣品。

2、肽反應(yīng)部分：能與肽N端及賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價(jià)連接而標(biāo)記上肽段，幾乎可以標(biāo)記所有蛋白質(zhì)。

3、平衡部分：保證iTRAQ標(biāo)記的同一肽段的質(zhì)荷比相同。當(dāng)前51頁(yè)，總共64頁(yè)。5:化學(xué)標(biāo)記法—iTRAQ與傳統(tǒng)基于雙向電泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：1：靈敏度高，檢測(cè)限低，可檢測(cè)出低豐度蛋白；2：分離能力強(qiáng),分析范圍廣,iTRAQ可以對(duì)任何類型的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，包括高分子量蛋白質(zhì)、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。3:高通量：同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行分析，提高了實(shí)驗(yàn)通量，可同時(shí)對(duì)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)或不同處理的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析；4：結(jié)果可靠：定性與定量分析結(jié)果更加可靠；5：自動(dòng)化程度高：液相與質(zhì)譜連用，自動(dòng)化操作，分析速度快，分離效果好。當(dāng)前52頁(yè)，總共64頁(yè)。5:化學(xué)標(biāo)記法—iTRAQiTRAQ法。

1：樣本經(jīng)過(guò)不同處理后，提取蛋白質(zhì);2：蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)還原，封閉后胰蛋白酶酶切;3：肽段混合物分別用不同的iTRAQ標(biāo)記;4：等量混合各種iTRAQ試劑標(biāo)記的肽段;5：MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)及分析。當(dāng)前53頁(yè)，總共64頁(yè)。6:SILACSILAC即細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture，SILAC)，其基本原理是在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用于SILAC主要的穩(wěn)定同位素氨基酸是Lys和Arg,細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過(guò)程中同位素氨基酸將被細(xì)胞用于合成蛋白質(zhì)，細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)5-6代后，細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)將被同位素標(biāo)記，等量混合標(biāo)記的蛋白質(zhì)后經(jīng)過(guò)SDS分離和質(zhì)譜分析，通過(guò)比較一級(jí)質(zhì)譜圖中三個(gè)同位素型肽段的面積大小進(jìn)行相對(duì)定量，同時(shí)二級(jí)譜圖對(duì)肽段進(jìn)行序列測(cè)定從而鑒定蛋白質(zhì)。由于SILAC標(biāo)記技術(shù)是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，幾乎不影響細(xì)胞的功能，同時(shí)靈敏度高，因此其在蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，如比較蛋白質(zhì)組學(xué)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)與DNA相互作用，蛋白質(zhì)與RNA相互作用等領(lǐng)域。當(dāng)前54頁(yè)，總共64頁(yè)。6:SILAC

技術(shù)優(yōu)勢(shì)——目前比較蛋白質(zhì)組學(xué)最先進(jìn)方法

（1）高效性：SILAC是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)100%；（2）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實(shí)驗(yàn)內(nèi)差異；（3）高通量、靈敏度高：可同時(shí)鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質(zhì)，且檢可測(cè)測(cè)到納克級(jí)水平；（4）相容性：可以對(duì)多種在DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)的蛋白進(jìn)行標(biāo)記；（5）靈活性：在缺乏L-賴氨酸和L-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同位素標(biāo)記的這兩種氨基酸，操作方便。當(dāng)前55頁(yè)，總共64頁(yè)。6：SILACSILAC法。

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