蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)

實驗二

蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)當前1頁，總共62頁。一、免疫學研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；免疫應答產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能；抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應答的規(guī)律。當前2頁，總共62頁。免疫學的研究范圍很廣，與很多相關(guān)學科交織在一起，并且發(fā)展成了很多學科，如免疫生物學、免疫遺傳學、血液免疫學、腫瘤免疫學等。隨著免疫生物學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在高等動物體內(nèi)存在著具有免疫功能的組織結(jié)構(gòu)（即免疫系統(tǒng)）。當前3頁，總共62頁。

淋巴組織免疫活性細胞免疫活性介質(zhì)當前4頁，總共62頁。免疫系統(tǒng)功能的生理和病理表現(xiàn)功能名稱生理功能病理表現(xiàn)免疫防御清除病原微生物及其它抗原性異物超敏反應（強）免疫缺陷病（弱）免疫自穩(wěn)清除損傷或衰老細胞自身免疫性疾病免疫監(jiān)視清除突變或畸變細胞防止腫瘤發(fā)生腫瘤或病毒持續(xù)性殺傷病毒感染細胞感染當前5頁，總共62頁。當外源異體物質(zhì)，如細菌、病毒、蛋白質(zhì)、多糖等進入動物機體后，可以激活機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生對外源物質(zhì)的排除作用，從而保護機體免受外源物質(zhì)的侵害。機體的這一特異免疫應答功能的細胞基礎是淋巴細胞。當前6頁，總共62頁。

免疫應答的類型（一）固有性免疫應答（innateimmuneresponse)

又稱先天性免疫應答，非特異性免疫應答：是機體在種系發(fā)育和進化過程中形成的免疫防御功能。（二）適應性免疫應答（adaptiveimmuneresponse）又稱獲得性免疫應答，特異性免疫應答，是機體出生后通過與抗原物質(zhì)接觸后所產(chǎn)生的一系列防御功能。（具有特異性、多樣性、記憶性、耐受性、自限性）

當前7頁，總共62頁。抗原和免疫原性抗原（antigens，Ag）是指能夠刺激機體免疫活性細胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞，并在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應的物質(zhì)。常見的抗原有蛋白質(zhì)、多糖、磷脂、脂多糖、結(jié)合蛋白質(zhì)、核酸、激素等有機物?？乖哂袃煞矫娴奶匦裕好庖咴裕╥mmunogenicity）和免疫反應性（immunoreactivity）。免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激機體引起免疫應答的能力。免疫反應性（immunoreactivity）是指抗原與相應免疫應答產(chǎn)物(即抗體)在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應的能力。

當前8頁，總共62頁。抗原的分類抗原可以分為完全抗原和半抗原。完全抗原：具有免疫原性和免疫反應性的抗原稱為完全抗原（completeantigen）半抗原：只具有免疫反應性而無免疫原性的抗原稱為半抗原（hapten），也稱為不完全抗原(incompleteantigen)。與蛋白質(zhì)結(jié)合后成為完全抗原。半抗原能與相應的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合反應。絕大多數(shù)多糖和所有類脂都屬于半抗原。當前9頁，總共62頁?？贵w的種類抗體（antibodies，Ab)是專門對抗抗原特異結(jié)構(gòu)的球蛋白，故也稱為免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig)。存在于血清、體液中，是構(gòu)成機體免疫作用的主要物質(zhì)。免疫球蛋白依據(jù)其理化性質(zhì)及生化性質(zhì)的不同，分為五種類型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。人體血清中IgG含量最多，IgA次之，IgM較少，IgD和IgE微量。當前10頁，總共62頁。當前11頁，總共62頁?？乖贵w反應（antigen-antibodyreaction）是指抗原與相應抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應。可發(fā)生于體內(nèi)（invivo），也可發(fā)生于體外（invitro）。體內(nèi)反應可介導吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應：可出現(xiàn)凝集反應、沉淀反應、補體參與的反應及中和反應等各種不同的反應類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多采用血清作試驗，所以體外抗原抗體反應亦稱為血清學反應（serologicreaction）。當前12頁，總共62頁。二、印跡法（blotting）印跡法是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法當前13頁，總共62頁。三、蛋白免疫印跡的應用免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)，亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(enzymelinkedimmunoelectrotransferblot,EITB是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優(yōu)點。是檢測蛋白質(zhì)特性、表達與分布的一種最常用的方法。當前14頁，總共62頁。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測技術(shù)一、實驗目的二、實驗原理三、實驗儀器四、操作步驟五、實驗結(jié)果與分析六、思考題

當前15頁，總共62頁。一、實驗目的學習掌握動物抗血清的制備原理及技術(shù)通過實際操作學會動物抗血清的制備掌握Western－blotting的基本原理

熟悉Western－blotting的實驗操作

當前16頁，總共62頁。二、實驗原理第一部分動物的常規(guī)免疫及抗血清的制備第二部分Western－blotting檢測抗血清當前17頁，總共62頁。將適當?shù)目乖镔|(zhì)注入動物體內(nèi)，經(jīng)過一定時間，動物血清中可出現(xiàn)大量特異性抗體，這種含抗體的血清稱為免疫血清。優(yōu)質(zhì)免疫血清的產(chǎn)生，主要取決于抗原的純度和免疫原性，以及動物應答的能力。此外，尚需考慮免疫途徑、抗原劑量、注射次數(shù)、時間間隔、有無佐劑等因素。第一部分動物的常規(guī)免疫及抗血清的制備當前18頁，總共62頁。（一）多克隆抗體的概念抗原通常是由多個抗原決定簇組成的。由一種抗原決定簇刺激機體，由一個B淋巴細胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（Monocloneantibody）。由多個抗原決定簇刺激機體，相應地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體。機體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體。當前19頁，總共62頁?？贵w的結(jié)構(gòu)當前20頁，總共62頁。（二）用于免疫的動物由于動物的遺傳性不同，同一抗原對不同動物或同種不同品系動物、或不同個體，產(chǎn)生特異免疫應答的強弱是不同的。因此，進行動物免疫時，必須選擇對該抗原敏感的、年輕的健康動物。常用的實驗動物為羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般為6個月大小的動物。當前21頁，總共62頁。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學特性和所要獲得抗血清數(shù)量。如要獲得大量的抗體，多采用大動物；如要是獲得直接標記診斷的抗體，則直接采用本動物；如要獲得間接的標記診斷用抗體，則必須用異源動物制備抗體；如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備。一般實驗室采用的抗體，多用兔和羊制備，因動物反應良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清。當前22頁，總共62頁。當前23頁，總共62頁。（三）抗原抗原是多種多樣的，就其化學成分而言，有蛋白質(zhì)抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等。為了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質(zhì)抗原。不同的抗原，其免疫原性的強弱均不相同，這種免疫原性的強弱取決于抗原的分子量、化學活性基團、立體結(jié)構(gòu)等。當前24頁，總共62頁。（四）免疫途徑免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等。一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射，每點注射0.1mL左右。實驗中0.2mL，3－4點注射。當前25頁，總共62頁。皮下注射當前26頁，總共62頁。（五）佐劑應用佐劑的目的是為了提高抗原對機體的免疫原性，從而提高抗體的效價。當前27頁，總共62頁。佐劑主要可分為兩種：一種本身具有免疫原性，如百日咳桿菌、抗酸桿菌（結(jié)核分枝桿菌）以及革蘭陰性桿菌等；另一種本身無免疫原性，如氫氧化鋁、磷酸鈣、礦物油乳劑、表面活性劑等。目前實踐中常應用的佐劑福氏佐劑。當前28頁，總共62頁。福氏佐劑（Freund

adjuvant）,通常是由羊毛脂1份、石臘油5份。這是不完全福氏佐劑。在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。當前29頁，總共62頁。（六）免疫方法抗原劑量，首次劑量為10～50μg，加強免疫的劑量約為首次劑量的1/4。首次免疫時抗原與完全佐劑等體積混合。加強免疫時用不完全佐劑。每2～3周加強免疫一次。在第2次加強免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3mL血，制備血清，檢測抗體效價。如未達到預期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止。當抗體效價達到預期水平時，即可放血制備抗血清。當前30頁，總共62頁?？贵w的產(chǎn)生順序與豐度當前31頁，總共62頁。（七）抗血清的采集與保存取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈放血，也可心臟采血。小鼠取血。收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.05～0.2mL），貯于-80℃以下冰箱，或凍干后貯存于4℃冰箱保存。

當前32頁，總共62頁。（八）抗血清質(zhì)量的評價在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。當前33頁，總共62頁。效價

抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是單向擴散免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴散等方法測定。當前34頁，總共62頁。單向擴射免疫法：

以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標記抗原混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000,則該血清的效價就是1：15000

制備含有一定濃度抗血清的瓊脂凝膠板（抗體固定不變）。打孔，加入不同稀釋度的抗原量，進行免疫擴散?？乖c相應抗體在濃度合適時，則形成清晰的沉淀環(huán)，其直徑大小與所加抗原量成正比。將已知參考抗原形成的沉淀環(huán)繪成曲線，然后以待測標本的沉淀環(huán)直徑查標準曲線，計算出待測抗原的含量。當前35頁，總共62頁。當前36頁，總共62頁。雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。雙向免疫擴散當前37頁，總共62頁。

免疫擴散試驗

1－抗原；2－7為不同稀釋倍數(shù)的抗體當前38頁，總共62頁。分子雜交原理及流程圖樣品制備電泳雜交轉(zhuǎn)膜結(jié)果顯示探針制備第二部分Western－blotting檢測抗血清

當前39頁，總共62頁。WesternBlot原理將通過PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上；然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進行反應；洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后；加入標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標記抗體；加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)。當前40頁，總共62頁。當前41頁，總共62頁。免疫印跡的實驗包括五個步驟：⑴固定：蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。⑵封閉：保持膜上沒有抗體的結(jié)合場所，使場所處于飽和狀態(tài)，用以避免特殊性抗體單獨結(jié)合到膜上。當前42頁，總共62頁。⑶一抗雜交：初級抗體（第一抗體）是特異性的。⑷二抗雜交：第二抗體或配體試劑對于初級抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。⑸底物顯色：被適當保溫后的酶標記蛋白質(zhì)區(qū)帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應。當前43頁，總共62頁。三、實驗儀器動物的常規(guī)免疫

Western－blotting檢測抗血清當前44頁，總共62頁。動物的常規(guī)免疫注射器蝸旋混合器當前45頁，總共62頁。四、操作步驟動物的常規(guī)免疫

Western－blotting檢測抗血清當前46頁，總共62頁?？乖奶崛∨c制備

1）0.5mg/mL菠蘿蛋白酶以0.9%生理鹽水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五上）。

2）純化的雞卵類粘蛋白（周四上午）。

3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理鹽水溶解配置（加少量NaOH促溶）（周四下午）。

動物的常規(guī)免疫當前47頁，總共62頁。苦味酸（以75%乙醇配置）標記小鼠標記部位組號頭1左前肢2左后肢3背4右前肢5右后肢6左耳朵7右耳朵8當前48頁，總共62頁。初級免疫：小鼠背部多點皮下注射，0.2mL/只小鼠（1）抗原與佐劑的混合：取1.5mL蛋白與1.5mL完全佐劑混合，震蕩混勻，制成油包水的形態(tài)（2）用酒精棉球消毒待注射部位（3）皮下多點注射，每點注射量應小于0.1mL

初級免疫后仔細觀察小鼠對外源抗原的反應，兩周后進行加強免疫當前49頁，總共62頁。加強免疫：初級免疫后兩周進行。取1.5mL蛋白與1.5mL不完全佐劑混合震蕩混勻，制成油包水的形態(tài)。加強免疫：小鼠背部多點皮下注射，0.15mL/只小鼠（1）用酒精棉球消毒待注射部位（2）皮下多點注射，每點注射量應小于0.1mL。第二次加強免疫：加強免疫一周后進行。操作相同。第二次加強免疫后一周，即可采血，收集抗血清。小鼠取血。收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，析出血清，離心，3000rpm,10min。吸出血清，分裝（0.05～0.2mL），貯于-20℃以下冰箱保存。當前50頁，總共62頁。WesternBlot一般流程蛋白樣品的制備SDS－PAGE轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色當前51頁，總共62頁。轉(zhuǎn)移電泳設備Western－blotting檢測抗血清當前52頁，總共62頁。當前53頁，總共62頁。轉(zhuǎn)膜膜的選擇尼龍膜硝酸纖維素膜封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價格昂貴價格便宜特殊要求下的選擇需要更高的蛋白結(jié)合率（尼龍膜：480μg/cm2

；硝酸纖維素膜：80μg/cm2

）目的蛋白與硝酸纖維膜