免疫檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)-抗dsDNA抗體檢測(cè)

免疫檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)抗dsDNA抗體檢測(cè)1實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆眨篍LISA間接法原理、方法及結(jié)果判定熟悉：抗dsDNA抗體的臨床意義2實(shí)驗(yàn)原理ELISA間接法，若被檢樣品中有ds-DNA抗體，先與板條中包被的ds-DNA抗原結(jié)合，形成Ag-Ab復(fù)合物，再與酶標(biāo)抗體形成Ag-Ab-二抗復(fù)合物，加入底物出現(xiàn)藍(lán)色（TMB）。31、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無(wú)抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測(cè)抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+45實(shí)驗(yàn)材料外周血、吸管、離心管、微量加樣器、抗ds-DNA抗體檢測(cè)試劑盒、吸水紙、溫箱、濕盒6

上一頁(yè)返回下一頁(yè)酶聯(lián)試劑陽(yáng)性對(duì)照酶標(biāo)記物顯色液A終止液反應(yīng)板顯色液B濃縮洗滌液加樣槍與吸頭陰性對(duì)照ELISA試劑盒7方法1.靜脈采血，離心3000r/min,10min取上清。試驗(yàn)前20min從冰箱中拿出試劑盒，平衡至室溫。2.濃縮洗滌液1：40比例稀釋?zhuān)瑩u勻備用。83.滴加100μl標(biāo)本稀釋液于各標(biāo)本孔中，取5μl標(biāo)本血清加入反應(yīng)孔中臨界孔（2孔）、陽(yáng)性對(duì)照孔（1孔）各加50μl于孔中。

a、b、c、d為待測(cè)血清（每人做2孔）4.反應(yīng)板震蕩混勻（30s）37℃溫浴20minabcd臨界孔陽(yáng)陰95.洗板5次（洗滌液注孔2/3體積），每次注入洗滌液后停留1min,最后一次拍干6.每孔加入酶標(biāo)二抗50μl，37℃溫浴20min,洗板5次7.加入底物液A（50μl）B(30μl),37℃溫浴10min8.取出，加50μl終止液，混勻，酶標(biāo)儀測(cè)OD值10結(jié)果在450nm波長(zhǎng)處讀取OD值標(biāo)本孔OD值≥臨界孔OD值陽(yáng)性

＜臨界孔OD值陰性11操作的標(biāo)準(zhǔn)化試劑及標(biāo)本的準(zhǔn)備

加樣

保溫

洗滌

顯色

比色12（一）試劑準(zhǔn)備1.試劑盒在使用前從4℃冰箱中取出，放置在室溫下20-30分鐘后再用，使其與室溫平衡。2.洗滌液稀釋時(shí)保證蒸餾水或去離子水的質(zhì)量。13

1.微量加樣器：按規(guī)定的量加入板孔中。應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。2.滴加試劑：注意滴加角度，不可滴加太快

（二）加標(biāo)本及反應(yīng)試劑14（三）溫育

抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)。反應(yīng)板孔溫度從室溫升至37℃需要一定的時(shí)間。工作中經(jīng)常是將微孔板放入溫箱后即開(kāi)始計(jì)時(shí)，造成實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)不出來(lái)。

151、一般均采用水浴箱，使溫度迅速平衡。2、為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。3、若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度。4、反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。16

洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。目的：洗去反應(yīng)液中沒(méi)有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。

ELSIA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。

（四）洗滌17

洗滌方式

洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種。

洗滌液PBST

18（五）顯色ELISA測(cè)定中37℃30分鐘才可以使酶的底物催化反應(yīng)完全（弱陽(yáng)性標(biāo)本）加入底物前需檢查底物溶液的有效性為保證結(jié)果的穩(wěn)定性，不可隨意改變溫度和時(shí)間。19

比色

比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。用特定的波長(zhǎng)測(cè)讀吸光值。比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度(opticaldensity，OD),現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。以空白孔校零測(cè)