第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合詳解演示文稿

第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合詳解演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共45頁(yè)。優(yōu)選第七章細(xì)胞重組與細(xì)胞融合當(dāng)前2頁(yè)，總共45頁(yè)。核體與胞質(zhì)體核體：與細(xì)胞質(zhì)分離后得到的帶有少量細(xì)胞質(zhì)并包有質(zhì)膜的細(xì)胞核，也成為小型細(xì)胞。核體能夠重生其胞質(zhì)部分，繼續(xù)生長(zhǎng)分裂。胞質(zhì)體：除去細(xì)胞核后由質(zhì)膜包裹的無(wú)核細(xì)胞。細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞能誘發(fā)細(xì)胞排核反應(yīng)，此時(shí)通過離心的方法可以將核體與胞質(zhì)體分離。當(dāng)前3頁(yè)，總共45頁(yè)。微細(xì)胞微細(xì)胞：又稱微核體，含有一條或幾條染色體，外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。秋水仙素和長(zhǎng)春新堿等有絲分離阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期染色體產(chǎn)生發(fā)散運(yùn)動(dòng)，發(fā)散開的染色體各自裝配出自己的核膜，形成微細(xì)胞。秋水仙胺細(xì)胞松弛素B細(xì)胞松弛素B離心當(dāng)前4頁(yè)，總共45頁(yè)。胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的重組形成胞質(zhì)雜種；微細(xì)胞與完整細(xì)胞的重組形成微細(xì)胞核異體；胞質(zhì)體與核體重新組合形成重組細(xì)胞。細(xì)胞重組的方式當(dāng)前5頁(yè)，總共45頁(yè)。細(xì)胞重組技術(shù)將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)建不同類型的雜種細(xì)胞提供可能；細(xì)胞重組技術(shù)可以人為的將染色體或者基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移，使重組細(xì)胞產(chǎn)生新的性狀和新的特性。細(xì)胞重組的意義當(dāng)前6頁(yè)，總共45頁(yè)。細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞質(zhì)工程：是研究真核細(xì)胞的核-質(zhì)關(guān)系以及細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)。細(xì)胞質(zhì)工程是進(jìn)行細(xì)胞重組的重要基礎(chǔ)。細(xì)胞質(zhì)工程涉及的技術(shù)有：1、細(xì)胞破碎2、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離3、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移4、胞質(zhì)雜種當(dāng)前7頁(yè)，總共45頁(yè)。一、細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)的技術(shù)。細(xì)胞破碎方法包含：1、超聲波破碎法2、反復(fù)凍融法3、高速組織搗碎法4、化學(xué)裂解法5、生物酶解法當(dāng)前8頁(yè)，總共45頁(yè)。超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液，由發(fā)生器和換能器組成。反復(fù)凍融法將細(xì)胞放在低溫下冷凍，然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。當(dāng)前9頁(yè)，總共45頁(yè)。高速組織搗碎法借助高速組織搗碎機(jī)使細(xì)胞被高速旋轉(zhuǎn)的葉片打碎?；瘜W(xué)裂解法通過化學(xué)藥品改變細(xì)胞膜的通透性，使其裂解。生物酶解法利用溶解細(xì)胞壁的酶處理細(xì)胞，破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含組分釋放。當(dāng)前10頁(yè)，總共45頁(yè)。二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離細(xì)胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不同，因此，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法將細(xì)胞內(nèi)各種組份分級(jí)分離出來(lái)。細(xì)胞器及細(xì)胞組份分離過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步。細(xì)胞勻漿要在低溫條件、等滲緩沖液（等滲勻漿介質(zhì)，如0.25mol/L的蔗糖）中進(jìn)行。細(xì)胞器及細(xì)胞組份分離方法包含：1、差速離心法2、密度梯度分離法當(dāng)前11頁(yè)，總共45頁(yè)。當(dāng)前12頁(yè)，總共45頁(yè)。沉降系數(shù)：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。沉降系數(shù)是以時(shí)間表示的。蛋白質(zhì)，核酸等生物大分子的S實(shí)際上時(shí)常在10的-13次方秒左右，故把沉降系數(shù)10的-13次方秒稱為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫S，即10的-13方秒=1S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。當(dāng)前13頁(yè)，總共45頁(yè)。離心方式離心運(yùn)動(dòng)是指物體有遠(yuǎn)離中心運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。根據(jù)離心機(jī)的類型分為水平離心、角離心（偏水平）和垂直離心三種。根據(jù)離心方式分為差速離心和密度梯度離心兩種。當(dāng)前14頁(yè)，總共45頁(yè)。差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉降當(dāng)前15頁(yè)，總共45頁(yè)。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：細(xì)胞核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)2～3次效果會(huì)好一些。差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。對(duì)于精細(xì)的分離，則是密度梯度離心效果更好。當(dāng)前16頁(yè)，總共45頁(yè)。密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。當(dāng)前17頁(yè)，總共45頁(yè)。密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種1、速度沉降主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)胞器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。2、等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。這種方法適于分離細(xì)胞器，而不太適于分離和純化細(xì)胞。當(dāng)前18頁(yè)，總共45頁(yè)。速度沉降等密度沉降當(dāng)前19頁(yè)，總共45頁(yè)。三、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移細(xì)胞器轉(zhuǎn)移是將一個(gè)物種的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種細(xì)胞中的技術(shù)。細(xì)胞器轉(zhuǎn)移類似細(xì)胞核移植技術(shù)。不同的是操作對(duì)象為細(xì)胞器，不是細(xì)胞核。最常見的是線粒體和葉綠體的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移。細(xì)胞器轉(zhuǎn)移方法有微注射、載體轉(zhuǎn)移、胞吞胞飲等方式。當(dāng)前20頁(yè)，總共45頁(yè)。四、胞質(zhì)雜種概念一：將兩種不同來(lái)源的核外遺傳物質(zhì)（線粒體和葉綠體）與一個(gè)特定的細(xì)胞核組合在一起得到的細(xì)胞稱為胞質(zhì)雜種。概念二：來(lái)自兩個(gè)原生質(zhì)體融合產(chǎn)生的細(xì)胞，其中一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核消失后，兩個(gè)親代原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)雜交得到的個(gè)體成為胞質(zhì)雜種。核心概念是細(xì)胞質(zhì)的雜交，不是細(xì)胞核，其中細(xì)胞質(zhì)中存在不同來(lái)源的細(xì)胞器，尤其是線粒體和葉綠體。當(dāng)前21頁(yè)，總共45頁(yè)。細(xì)胞融合細(xì)胞融合(Cellfusion)：又稱體細(xì)胞雜交，是指使用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的體細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞，使之分化再生，形成新物種或新品種的技術(shù)。細(xì)胞融合方法包含人工方法和無(wú)性方法1、人工方法：是指在外力使用誘導(dǎo)劑或促融劑、電場(chǎng)、磁場(chǎng)、超聲波、重力、激光等因素的作用。2、無(wú)性方式：是區(qū)別于有性方式而言的，有自然條件下，生殖細(xì)胞卵子和精子相互接觸會(huì)發(fā)生細(xì)胞融合的現(xiàn)象。當(dāng)前22頁(yè)，總共45頁(yè)。1838-1875年：在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細(xì)胞；20世紀(jì)50年代：日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒可以引起細(xì)胞的融合；1965年：英國(guó)的科學(xué)家海利斯成功得到了融合細(xì)胞；1964年：HAT（次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)）選擇培養(yǎng)基應(yīng)用于融合細(xì)胞的選擇；1974年：加拿大華裔科學(xué)家高國(guó)楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）能夠促使植物的原生質(zhì)體融合；1982年：出現(xiàn)了電融合技術(shù)；近20年：從細(xì)胞融合的理論和實(shí)踐兩個(gè)方面進(jìn)行了大量研究，細(xì)胞融合的方法不斷更新和完善，融合率逐步提高。細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展史當(dāng)前23頁(yè)，總共45頁(yè)。生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯人——小鼠葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原生質(zhì)體葉——根尖纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞197219721972197319741974197419741974197419751976197619761976197619781978幾種細(xì)胞融合成功的例子當(dāng)前24頁(yè)，總共45頁(yè)。細(xì)胞融合的類型異核體：來(lái)自兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。同核體：基因型相同的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。細(xì)胞融合包括對(duì)稱融合和不對(duì)稱融合。1、對(duì)稱融合：兩個(gè)完整的細(xì)胞間的融合。2、不對(duì)稱融合：其中一個(gè)細(xì)胞通過物理、化學(xué)或者生物的方法使該細(xì)胞的細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)失活后再與另一個(gè)完整的細(xì)胞進(jìn)行的融合。當(dāng)前25頁(yè)，總共45頁(yè)。細(xì)胞融合的過程1、兩原生質(zhì)體或者細(xì)胞彼此靠近；2、質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋；3、胞質(zhì)滲透；4、細(xì)胞核融合。當(dāng)前26頁(yè)，總共45頁(yè)。細(xì)胞橋的形成過程當(dāng)前27頁(yè)，總共45頁(yè)。植物細(xì)胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖當(dāng)前28頁(yè)，總共45頁(yè)。細(xì)胞融合的意義改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)生產(chǎn)抗腫瘤疫苗生產(chǎn)單克隆抗體用于基因定位用于動(dòng)物育種有利于基礎(chǔ)理論研究當(dāng)前29頁(yè)，總共45頁(yè)。細(xì)胞融合基本原理1、細(xì)胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)—糖蛋白細(xì)胞融合的關(guān)鍵是要脂雙層的接觸，就是要去除糖蛋白，露出無(wú)糖蛋白覆蓋的區(qū)域，使兩個(gè)細(xì)胞的脂雙層能緊密結(jié)合。當(dāng)前30頁(yè)，總共45頁(yè)。2、病毒促進(jìn)細(xì)胞融合很多病毒都具有凝集細(xì)胞的能力，其原理大致如下：病毒的一邊黏接在一個(gè)細(xì)胞表面，病毒的另一邊黏接在另一個(gè)細(xì)胞表面，從而使兩個(gè)細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。仙臺(tái)病毒促進(jìn)細(xì)胞融合的有效部位在于它的膜，病毒被膜上的兩種糖蛋白（HA、NA和F蛋白）可和細(xì)胞膜表面的糖蛋白發(fā)生作用，相互結(jié)合，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細(xì)胞表面之間產(chǎn)生一些微小的細(xì)胞質(zhì)橋。當(dāng)前31頁(yè)，總共45頁(yè)。3、化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞融合（聚乙二醇PEG）PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的兩種方式：PEG含有醚鍵、帶負(fù)電性可與細(xì)胞表面正的極性集團(tuán)相連，引起細(xì)胞膜表面的蛋白起作用，使細(xì)胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開質(zhì)膜，細(xì)胞融合。PEG和水之間的氫鍵相結(jié)合，使溶液中的自由水消失，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生膜結(jié)構(gòu)的變化，使細(xì)胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開質(zhì)膜，細(xì)胞融合。當(dāng)前32頁(yè)，總共45頁(yè)。4、電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合低壓交流電場(chǎng)中，細(xì)胞聚集成串珠狀緊密排列，相互接觸的細(xì)胞膜之間會(huì)出現(xiàn)無(wú)蛋白顆粒的脂質(zhì)區(qū)，當(dāng)受到電擊時(shí)，這個(gè)區(qū)域就會(huì)被擊穿，產(chǎn)生脂雙層膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)連通，發(fā)生細(xì)胞融合。細(xì)胞置于非常高的電場(chǎng)中，細(xì)胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。當(dāng)前33頁(yè)，總共45頁(yè)。動(dòng)物細(xì)胞融合1、細(xì)胞種類和性質(zhì)細(xì)胞表面性質(zhì)細(xì)胞種類2、環(huán)境條件的影響溫度：

pH：最適為

氧氣含量：耗氧量較大，一般大于20%3、離子強(qiáng)度及離子種類細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2＋，最適為0.1mol/L細(xì)胞融合的影響因素當(dāng)前34頁(yè)，總共45頁(yè)。植物或微生物細(xì)胞融合1、PEG誘導(dǎo)融合的時(shí)間2、PEG純度3、融合密度一般為2x104－8x104個(gè)/ml4、融合液中加入少量的CaCI25、其他添加組份當(dāng)前35頁(yè)，總共45頁(yè)?；パa(bǔ)作用：親本細(xì)胞的性狀同時(shí)在雜種細(xì)胞中表現(xiàn)。激活作用：親本細(xì)胞的不活動(dòng)基因在雜種細(xì)胞表達(dá)。如只能合成RNA而不能合成DNA的小鼠巨噬細(xì)胞，與Hela細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞則可以合成兩種核酸。消失作用：親本細(xì)胞的性狀在雜種細(xì)胞中消失。如金黃倉(cāng)鼠的黑色素瘤細(xì)胞可產(chǎn)生黑色素，小鼠的成纖維細(xì)胞不能產(chǎn)生黑色素，它們的雜種細(xì)胞不能產(chǎn)生黑色素。同時(shí)具有激活和消失作用如小鼠的胸腺細(xì)胞具有t12抗原基因和h2抗原基因，在胚胎發(fā)育早期t12基因表達(dá)，h2基因不表達(dá)，在成年小鼠中h2基因表達(dá)，t12基因不表達(dá)，而在成年小鼠的胸腺細(xì)胞與小鼠胚胎性瘤細(xì)胞融合的雜種細(xì)胞中，h2基因不表達(dá)，卻激活了t12基因，使其表達(dá)。融合細(xì)胞特性的表現(xiàn)形式當(dāng)前36頁(yè)，總共45頁(yè)。融合細(xì)胞篩選有兩大類：一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補(bǔ)選擇法；一類是根據(jù)可見標(biāo)記形狀的機(jī)械選擇法?？顾幮院Y選系統(tǒng)如親本A對(duì)氨芐青霉素敏感，對(duì)卡那霉素不敏感，親本B對(duì)氨芐青霉素不敏感，對(duì)卡那霉素敏感，融合后的細(xì)胞對(duì)兩種抗生素都不敏感。營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)親本A為色氨酸缺陷型，親本B為蘇氨酸缺陷型，融合細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)。溫度敏感突變型融合細(xì)胞篩選親本A具有卡那霉素抗性但只能在37度生長(zhǎng)，親本B為高溫敏感突變型，不具備卡那霉素抗性，融合細(xì)胞能在高溫和卡那霉素抗性平板生長(zhǎng)。融合細(xì)胞的篩選當(dāng)前37頁(yè)，總共45頁(yè)。物理特性篩選利用細(xì)胞在形態(tài)、大小、顏色上的差別可以在顯微鏡下用微管將融合細(xì)胞吸取挑選出來(lái)，也可以用離心的方式。熒光表記法

利用發(fā)綠色熒光的異硫氰酸熒光素和發(fā)紅色熒光的堿性芯香紅熒光素分別標(biāo)記兩個(gè)親本細(xì)胞，融合后的細(xì)胞內(nèi)存在兩種熒光標(biāo)記物，利用流式細(xì)胞儀可進(jìn)行分選。當(dāng)前38頁(yè)，總共45頁(yè)。細(xì)胞融合的材料---原生質(zhì)體原生質(zhì)體（protoplast）：去除細(xì)胞壁后裸露的球型細(xì)胞。原生質(zhì)體主要是植物細(xì)胞，植物細(xì)胞壁主要成份為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)。原生質(zhì)體雖然沒有細(xì)胞壁，但仍能進(jìn)行基本的生命活動(dòng)，在離體培養(yǎng)下可再生細(xì)胞壁。當(dāng)前39頁(yè)，總共45頁(yè)。植物原生質(zhì)體的特點(diǎn)：1、吸收能力增強(qiáng)：易于攝取外來(lái)遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分；2、具有全能性：具有全套的遺傳物質(zhì)，具有細(xì)胞壁再生并能進(jìn)行人工培養(yǎng)分化發(fā)育成完整植株的能力；3、在一定條件下可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，形成雜種細(xì)胞。4、分泌能力提高：去除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙，使細(xì)胞膜的透過性增強(qiáng)，