基因操作中大分子的分離和分析

基因操作中大分子的分離和分析第一頁，共九十四頁，2022年，8月28日第一節(jié)DNA的分離、檢測和純化

一、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離和純化二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳四、脈沖場凝膠電泳五、DNA片段的純化第二頁，共九十四頁，2022年，8月28日天然DNA來源:

①染色體DNA。

②病毒和噬菌體DNA。

③質(zhì)粒DNA。

④線粒體和葉綠體DNA。第三頁，共九十四頁，2022年，8月28日一、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離和純化分離質(zhì)粒DNA的方法眾多，其依據(jù)是利用分子大小不同、堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來進(jìn)行分離。目前常用的有堿裂解法、煮沸法、去污劑(如Triton或SDS)裂解法、羧基磷灰石柱層析法、質(zhì)粒DNA釋放法、酸酚法等。第四頁，共九十四頁，2022年，8月28日1堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA原理

◆堿裂解法由Birnboim和Doly設(shè)計并于1979年發(fā)表，基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。◆在pH高達(dá)12.5的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離。第五頁，共九十四頁，2022年，8月28日◆當(dāng)以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?！敉ㄟ^離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。第六頁，共九十四頁，2022年，8月28日大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取步驟第七頁，共九十四頁，2022年，8月28日pET28c(+)電泳結(jié)果第八頁，共九十四頁，2022年，8月28日堿抽提法所用試劑的生化作用

提取過程中所用的材料有LB培養(yǎng)基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris?HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA)、TE緩沖液、3mol/L乙酸鉀溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、異丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。

第九頁，共九十四頁，2022年，8月28日①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。

葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。

EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用,同時有利于溶菌酶的作用。

第十頁，共九十四頁，2022年，8月28日②NaOH-SDS液:NaOH濃度為0.2mol/L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS是離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-S03-…R+一蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來。第十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日③KAc:

pH4.8的KAc溶液是為了把pHl2.6的抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。高鹽3mol/LKAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物的凝聚而沉淀。染色體DNA因為中和了核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

第十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日④無水乙醇:沉淀DNA，它的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。

第十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日⑤酚-氯仿:酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。第十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日⑥異戊醇:異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生。同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

第十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程162通過試劑盒分離純化大腸桿菌質(zhì)粒DNA

第十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1、凝膠電泳的基本原理一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。它與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說，電場強(qiáng)度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳遷移率。第十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日2、影響電泳遷移速率的因素：1）分子篩效應(yīng)DNA分子在凝膠介質(zhì)中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖一磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。

第十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日2）相對分子質(zhì)量具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。DNA樣品與已知相對分子質(zhì)量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行電泳對照，觀察其遷移距離，就可獲知該樣品的相對分子質(zhì)量大小。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以鑒別相對分子質(zhì)量相同但構(gòu)型不同的DNA分子。第十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日3）構(gòu)型在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋(SC)的共價閉合環(huán)狀(CCC)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA的一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀(OC)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀(L)分子。這3種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開環(huán)狀分子。當(dāng)提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA時，在凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可分析樣品的純度。

第二十頁，共九十四頁，2022年，8月28日

第二十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日3、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1）DNA的顯示原理：制備瓊脂糖凝膠時加入溴化乙錠指示劑，溴化乙錠(EB)在紫外光照射下能發(fā)射桔紅色的熒光。當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍。熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作瓊脂糖凝膠電泳對照，就可比較出待測樣品的濃度。若用薄層分析掃描儀檢測，只需要5～lOngDNA，就可以從照片上比較鑒別。如用肉眼觀察，可檢測到0.01～0.1μg的DNA。第二十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日2）影響電泳遷移的主要因素：◆DNA的大小◆DNA的構(gòu)象◆瓊脂糖濃度◆緩沖液：乙酸鹽緩沖液(TAE)、硼酸鹽緩沖液(TBE)、磷酸鹽緩沖液(TPE)。第二十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日不同構(gòu)像質(zhì)粒第二十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日瓊脂糖含（%）DNA片段的有效分離范圍(kb)0.35-600.51-300.61-200.70.8-121.00.5-101.20.4-61.50.2-42.00.1-3分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度第二十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日3）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程A、緩沖液制備B、EB母液配制：10mg/ml，在4℃下保存C、將點(diǎn)樣梳洗凈干燥放入膠板中D、瓊脂糖膠板的制備：稱量加入三角瓶一定的瓊脂糖粉末，按所需凝膠濃度加入適量體積的緩沖液，將三角瓶塞口，微波爐中融化。融化好后冷卻到60℃左右，加入EB溶液，至最終濃度為0.5ug/ml。搖勻倒入放置好的點(diǎn)樣梳的膠板中，排走氣泡。室溫放置30-45min。第二十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日3）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程E、加樣和電泳：將膠板放入電泳槽，注入緩沖液，使液面高于膠面1-2mm，排出加樣孔內(nèi)的氣泡，用微量移液槍加入DNA樣品。接通電源，調(diào)好電壓和電泳時間。可根據(jù)溴酚蘭的位置結(jié)束電泳，關(guān)閉電源。F、取出凝膠，置于紫外投射儀上，調(diào)好相機(jī)焦距拍照第二十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日3）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程第三十頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日紫外線光源靈敏度:302nm>254nm>366nm第三十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日三、聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)：分辨率高適于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp載樣量大回收DNA純度高第三十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日四、脈沖場凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresisPFGE)與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，這項技術(shù)采用定時改變電場方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1秒到5分鐘左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場。+++-----2第三十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日五、DNA片段的純化

根據(jù)實驗要求不同，有時需要高純度的DNA，對提取的DNA樣品須進(jìn)一步純化并除去溴化乙錠(EB)。常用的DNA純化方法有：低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法、透析袋電洗脫法、氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心法、離子交換層析法、“基因純”試劑純化等。第三十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日透析袋電洗脫法

適用于小劑量DNA純化和酶切DNA片段回收。DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳分帶。切取含待純化DNA帶的瓊脂糖凝膠塊，裝入透析袋，進(jìn)行電泳1-2h后，再反向電泳1-2min。吸取透析袋中的洗脫液于離心管中離心。轉(zhuǎn)移上清液到另一離心管中，加入2倍體積無水乙醇混勻，于-20℃放置過夜沉淀后，離心后上清液，最后把沉淀物溶于TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第三十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日

通過凝膠電泳回收的DNA樣品和氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心制備的DNA樣品，因檢測需要而含有溴化乙錠(EB)，會影響限制性核酸內(nèi)切酶的切割，因此有必要去掉插入到DNA中的EB，常采用的方法有：正丁醇(或異戊醇)抽提或Dowex樹脂層析法等。第四十頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程41韓國MEGAquick-spin?PCR產(chǎn)物與膠回收試劑盒第四十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日DNA的濃縮

當(dāng)提取的DNA溶液的濃度達(dá)不到實驗要求時，必須進(jìn)行DNA溶液的濃縮。實驗室常用的方法有：

乙醇沉淀法、正丁醇抽提法和聚乙二醇濃縮法等。

第四十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日（四）DNA的定量和純度測定

DNA樣品的濃度的測定，一般采用紫外光譜分析、EB熒光分析、水平式瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法和脈沖電泳法等。

第四十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日紫外光譜分析法

紫外光譜分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在260nmm處有特異的紫外吸收峰且吸收強(qiáng)度與系統(tǒng)中DNA或RNA的濃度成正比。分子形狀、雙鏈與單鏈之間的轉(zhuǎn)換也會導(dǎo)致吸收水平的改變，但是這種偏差可以用特定的公式來校正。該法的特點(diǎn)是準(zhǔn)確、簡便，但所需儀器較昂貴。第四十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日衡量所提取DNA的純度可用OD260與OD280的比值,OD260/OD280對DNA而言其值大約為1.8。當(dāng)OD260/OD280大于1.8則可能有RNA污染。當(dāng)OD260/OD280小于1.8時則有蛋白質(zhì)污染。雙鏈DNA的OD260為1時相當(dāng)于濃度為50μg/mL。單鏈DNA的OD260為1時相當(dāng)于濃度為40μg/mL。寡核酸的OD260為1時相當(dāng)于濃度為20-40μg/mL。第四十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日EB熒光分析法

EB熒光染料能插入DNA或RNA的堿基對平面之間并結(jié)合在上面，在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生桔黃色熒光。由于結(jié)合于DNA分子之上的EB的量與DNA分子長度和數(shù)量成正比，則熒光強(qiáng)度可以表示DNA量的多少。第四十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日將標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液按濃度由低到高分別與同樣體積的EB溶液混勻在一塊黑色的點(diǎn)樣板上形成一個濃度梯度，然后將待測DNA也與同樣體積的溴化乙錠混勻，最后將待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在紫外燈下發(fā)出的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，就能測出該樣品總DNA濃度。EB是嫌疑性的致突變物質(zhì)。第四十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日第二節(jié)RNA的分離、檢測和純化細(xì)胞中的核酸：DNA和RNA。RNA：rRNA、tRNA、mRNA。一個典型哺乳動物細(xì)胞約含10-5μgRNA。

－80%～85%rRNA(28S、18S、5SrRNA)。

－15%～20%低分子量RNA(如tRNA、核內(nèi)小分子RNA等）。

－1%～5%mRNA，一般按2%計算。第四十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日第四十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日實驗成敗關(guān)鍵：創(chuàng)造一個無RNase的環(huán)境去除外源性RNase的污染：DEPC(焦碳酸二乙脂)抑制內(nèi)源性RNase的活性RＮase阻抑蛋白（RＮasin，非競爭性抑制劑）氧銅核糖核苷復(fù)合物硅藻土第五十頁，共九十四頁，2022年，8月28日RNA的抽提與純化總RNA的制備真核生物mRNA的純化從總RNA中，用寡聚(dT)親和層析柱分離mRNA?？蓱?yīng)用PromegaPolyATtractmRNA分離系統(tǒng)分離多聚(A)mRNA。將用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強(qiáng)力微磁球相連的mRNA。第五十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日第五十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日RNA的電泳檢測RNA的濃度和純度可通過測試其OD260來判斷，OD260為1時相當(dāng)于濃度為40μg/mL。檢測：瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法。28S18S總RNA電泳條帶第五十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日第三節(jié)分子雜交

一、Southern雜交二、Northern雜交三、菌落原位雜交四、Western雜交第五十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程55分子雜交

(moleculehybridization)分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用已知標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子，以及其相對分子量大小。根據(jù)其檢測對象的不同可分為Southern雜交、Northern雜交和Western雜交

，及由此簡化的斑點(diǎn)雜交、狹線雜交和菌落雜交。

第五十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程56分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行，也可能在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行。核酸分子雜交是指核酸分子(DNA或RNA)在變性以后，在復(fù)性的過程中兩個不同來源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過程。通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。

第五十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程57第五十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程58一、Southern雜交

這種方法是E.M.Southern1975年建立,是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。第五十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程59（一）Southern雜交的操作步驟1.預(yù)處理：

（1）用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行酶切。（2）將酶切后的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（3）將電流出來的那塊凝膠泡在強(qiáng)堿溶液中，此時雙鏈的DNA樣品變性成單鏈DNA結(jié)構(gòu)。（4）用酸中和，使單鏈DNA維持其單鏈狀態(tài)2.原位轉(zhuǎn)移：將凝膠上的單鏈DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。第五十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程603.固定：在真空烤箱里，80℃下烤1-3h。將核酸樣品進(jìn)一步固定在濾膜上4.雜交：雜交之前須有一個預(yù)雜交，封阻膜的背景，避免雜交時背景吸附探針。將濾膜移在含有放射性同位素標(biāo)記的探針分子溶液中，溶液上的單鏈DNA分子與探針分子通過互補(bǔ)配對進(jìn)行雜交，形成雜種分子。

第六十頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程615.漂洗：

將濾膜上沒有和單鏈DNA樣品結(jié)合的游離的探針分子漂洗下來，此后濾膜上只有雜交分子。6.放射自顯影：

在X光曝射下進(jìn)行放射自顯影形成自顯影圖片。7.比較鑒定：

將放射自顯影圖片上的譜帶與凝膠上的譜帶進(jìn)行比較。確定與探針分子結(jié)合的DNA分子是凝膠上DNA鏈的那個片段。第六十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程62放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交－＋第六十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程63SouthernBlotting的過程1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過電泳液的移動轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固定膠中的DNA4.預(yù)雜交和雜交(放射性和熒光檢測)5.結(jié)果檢測第六十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程64Southern印跡雜交方法操作簡單，結(jié)果十分靈敏，在理想的條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即使每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。第六十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程65

1.硝酸纖維素濾膜在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，但它存在一些不足之處:

（1）硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用結(jié)合DNA的，這種結(jié)合并不十分牢固，隨著雜交及洗膜進(jìn)程，DNA會慢慢脫離硝酸纖維素濾膜，從而使雜交效率下降。（二）Southern雜交的雜交濾膜第六十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程66（2）硝酸纖維素濾膜質(zhì)地較脆弱，容易碎裂，因此操作須小心謹(jǐn)慎(特別是經(jīng)烘烤后)。（3）硝酸纖維素濾膜與核酸的結(jié)合有賴于高鹽濃度，在低鹽濃度時結(jié)合DNA效果不佳，不適宜于電轉(zhuǎn)印跡法。（4）硝酸纖維素濾膜對于小分子質(zhì)量的DNA片段(特別是小于200bp的DNA片段)結(jié)合能力不強(qiáng)。第六十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程672.尼龍膜優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合DNA和RNA的能力強(qiáng)于硝酸纖維素濾膜，對小分子質(zhì)量的核酸也能較好地結(jié)合。尼龍膜韌性強(qiáng)，操作較方便，對離子濃度要求不高，可重復(fù)用于雜交。缺點(diǎn)：雜交信號本底較硝酸纖維素濾膜高。第六十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程68

將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實驗方法。二Northern雜交第六十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程69Northern雜交的過程①提取總RNA。②分離mRNA。利用親和層析的原理純化mRNA。③制備RNA探針。根據(jù)mRNA序列合成同源DNA探針，或以cDNA為探針。④Northern雜交。Northern雜交的方法包括點(diǎn)雜交和印跡雜交，兩者都能鑒定外源基因是否得到轉(zhuǎn)錄，但后者還能確定mRNA分子質(zhì)量大小及豐度。第六十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程70三菌落原位雜交

（colonyinsituhybridization）●1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根據(jù)檢測重組子DNA分子的核酸雜交技術(shù)原理,對Southern印跡技術(shù)作了一些修改,提出了菌落原位雜交技術(shù)。該項技術(shù)是直接把菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結(jié)合,再與特異性DNA探針雜交,篩選出含有插入序列的菌落。第七十頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程71菌落原位雜交的操作步驟

第七十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程72第七十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程73四Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡和免疫測定結(jié)合在一起的檢測方法，具有很高的靈敏度，可從總蛋白中檢測出50ng的特異性表達(dá)蛋白。第七十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程74Step1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigenStep2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopmentWestern雜交的操作步驟

第七十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程75WesternBlot檢測HIV第七十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程76◆Southern印跡法(DNA印跡法,Southernblotting)：是一種把DNA電泳分離區(qū)帶轉(zhuǎn)移到支持膜上的技術(shù)。因這一技術(shù)是英國科學(xué)家E.M.Southern首先創(chuàng)建的，而且這一轉(zhuǎn)移過程與墨跡被吸印到吸墨紙上的過程相似，所以用他的姓氏命名為Southern印跡法。

◆

Northern印跡法(RNA印跡法,Northernblotting)：Alwine等人將Southern印跡法應(yīng)用于RNA，原理與Southern印跡法相似。Alwine等人根據(jù)命名Southern印跡法的姓氏中含有“南部”之意，風(fēng)趣地把他們的RNA印跡法稱為“北部”印跡法（Northernblotting）。

第七十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程77◆Western印跡法（蛋白質(zhì)印跡法，Westernblotting）：是一種從混合蛋白質(zhì)中檢出微量特定蛋白質(zhì)的方法。人們把這種以電驅(qū)動為轉(zhuǎn)移方式的蛋白質(zhì)印跡法詼諧地稱為“西部”印跡法（Westernblotting）。

◆Eastern印跡法（Easternblotting）：也是一種蛋白質(zhì)印跡法，與Western印跡法不同之處是：先用等電聚焦-聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF）分離蛋白質(zhì)，然后也是將蛋白質(zhì)的分離區(qū)帶、以電驅(qū)動轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行了印跡。這一方法又被稱為Easternblotting。第七十七頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程78一、RNA的S1核酸酶作圖：分析原mRNA加工剪接為成熟mRNA中的剪切區(qū)段和邊界。二、S1核酸酶作圖分析mRNA端點(diǎn)：5’和3’端均可分析。三、引物延伸法分析mRNA的端點(diǎn)：只能用于5’末端的作圖。第四節(jié)RNA作圖和端點(diǎn)分析第七十八頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程79第七十九頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程80第八十頁，共九十四頁，2022年，8月28日第五節(jié)重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞一

選擇受體細(xì)胞的基本原則二

重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌第八十一頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程82●受體細(xì)胞(receptorcell)

又稱為宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞(hostcell)等，從實驗技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞;從實驗?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細(xì)胞。

●

感受態(tài)(competence)

細(xì)胞處于能夠吸收DNA的狀態(tài)，稱為感受態(tài)?！窀惺軕B(tài)細(xì)胞(competentcell)

處于能夠吸收DNA狀態(tài)的細(xì)胞。第八十二頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程83●細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。●轉(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。第八十三頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程84●

轉(zhuǎn)化(transformation):指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中的過程?！?/p>

轉(zhuǎn)染(transfection):指病毒及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程?！?/p>

轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指噬菌體及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。第八十四頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程85一選擇受體細(xì)胞的基本原則1、便于重組DNA分子的導(dǎo)入。2、便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達(dá)載體所含的選擇性標(biāo)記與受體細(xì)胞基因是否相匹配，從而易于對重組體進(jìn)行篩選。3、遺傳穩(wěn)定性高，易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或易于進(jìn)行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達(dá)效率。對動物細(xì)胞而言，所選用的受體細(xì)胞具有對培養(yǎng)的適應(yīng)性強(qiáng)，可以進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

第八十五頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程864、受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累，可促進(jìn)外源基因高效分泌表達(dá)。5、安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細(xì)胞或營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞。第八十六頁，共九十四頁，2022年，8月28日2023/3/14西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè)基因工程876、能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。從受體細(xì)胞的角度出發(fā)，通常的做法是是對其作適當(dāng)?shù)男揎椄脑欤邕x用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受體細(xì)胞就可以避免其