微生物菌種高通量篩選技術(shù)與裝置演示文稿

微生物菌種高通量篩選技術(shù)與裝置演示文稿當(dāng)前1頁，總共64頁。內(nèi)容提綱高通量篩選在微生物育種中的重要意義

菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范當(dāng)前2頁，總共64頁。高通量篩選在微生物育種中的重要意義

1、菌種是發(fā)酵技術(shù)的源頭2、菌種是發(fā)酵技術(shù)的核心之核心3、菌種提高不增加設(shè)備材料投入

菌種發(fā)酵水平是企業(yè)產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的體現(xiàn)當(dāng)前3頁，總共64頁。青霉素：5萬——12萬u/ml（國(guó)內(nèi)）

8萬——20萬u/ml（國(guó)外）紅霉素：5000——8000/10000u/ml（國(guó)內(nèi)）

10000——15000u/ml（國(guó)外）阿維菌素：4000——8400u/ml（國(guó)內(nèi)）

10000u/ml以上（國(guó)外）案例當(dāng)前4頁，總共64頁。

育種工作中兩大任務(wù)：突變與篩選

高通量篩選在微生物育種中的重要意義變異菌種庫篩選目標(biāo)株自然選育人工誘變推理選育雜交育種基因工程代謝工程各種組學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)合成生物學(xué)特異性模型篩選量當(dāng)前5頁，總共64頁。突變僅是前提篩選才是關(guān)鍵當(dāng)前6頁，總共64頁。

我國(guó)現(xiàn)有菌種篩選儀器裝備與技術(shù)國(guó)際相比存在巨大差距我國(guó)：傳統(tǒng)方法，篩選方式半個(gè)世紀(jì)沒有明顯改進(jìn)國(guó)際：高通量篩選技術(shù)(Highthroughputscreening,HTS)

高通量篩選在微生物育種中的重要意義

TraditionalscreeningHighthroughputscreeningFlask/tube(single)Microtiterplate(12、24、48、96、384、1536)Volume(10-50ml)Volume(10-500μl)Screen20-50/week/labScreen1000-10000/week/labManualAutomaticLaboriousLaborsavingSeriesParallel當(dāng)前7頁，總共64頁。內(nèi)容提綱

高通量篩選在微生物育種中的重要意義菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范當(dāng)前8頁，總共64頁。1929，1940s-1950sPfizer公司：土霉素的發(fā)現(xiàn)56名科學(xué)家、10萬份土樣、歷時(shí)1年25%市場(chǎng)1984年，Pfizer提出AutomationProject.1990年，在Nagoya,Japan實(shí)施1萬株份/周高通量篩選技術(shù)的起源當(dāng)前9頁，總共64頁。微生物菌種篩選一般流程概率事件菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展通量限制步驟誘變等10倍稀釋涂平板單菌落初篩復(fù)篩驗(yàn)證工業(yè)應(yīng)用接種到多孔板倒平板培養(yǎng)基保藏活化前處理檢測(cè)出發(fā)菌株當(dāng)前10頁，總共64頁。微生物菌種篩選儀器裝備發(fā)展趨勢(shì)：自動(dòng)化、微型化、高通量培養(yǎng)基滅菌、分裝；倒平板；挑取單菌落、接種；培養(yǎng)；目的產(chǎn)物抽提；測(cè)定；數(shù)據(jù)收集處理等過程單元自動(dòng)化與系統(tǒng)集成自動(dòng)化（通量匹配）菌種高通量篩選技術(shù)與裝備國(guó)際進(jìn)展當(dāng)前11頁，總共64頁。FillingUnit分裝速率：400-1200dishes/h分裝量：4-45ml/0.5-0.6sec平動(dòng)規(guī)格：直徑92-98mm可調(diào)高度15-21mm可調(diào)滅菌方式：253.7nm紫外線滅菌尺寸重量：45cm(L)*30cm(D)*61cm(H),15kg

★StackingUnit堆疊速率：可調(diào)，與輸送機(jī)自動(dòng)配合。堆疊高度：2-15板平皿，可調(diào)堆疊桌面：500′500mm可擴(kuò)充尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg誘變等10倍稀釋涂平板單菌落初篩復(fù)篩驗(yàn)證工業(yè)應(yīng)用接種到多孔板倒平板培養(yǎng)基保藏活化前處理檢測(cè)出發(fā)菌株當(dāng)前12頁，總共64頁。全自動(dòng)培養(yǎng)基分裝系統(tǒng)750皿/小時(shí)自動(dòng)滅菌培養(yǎng)基制備機(jī)當(dāng)前13頁，總共64頁。出發(fā)株誘變等10倍稀釋涂平板單菌落初篩復(fù)篩工藝放大接種倒平板培養(yǎng)基保藏活化前處理檢測(cè)自動(dòng)細(xì)菌平板稀釋儀當(dāng)前14頁，總共64頁。4600個(gè)克隆/小時(shí)誘變等10倍稀釋涂平板單菌落初篩復(fù)篩驗(yàn)證工業(yè)應(yīng)用接種到多孔板倒平板培養(yǎng)基保藏活化前處理檢測(cè)出發(fā)菌株當(dāng)前15頁，總共64頁。培養(yǎng)出發(fā)株誘變等10倍稀釋涂平板單菌落初篩復(fù)篩工藝放大接種倒平板培養(yǎng)基保藏活化前處理檢測(cè)當(dāng)前16頁，總共64頁。出發(fā)株誘變等10倍稀釋涂平板單菌落初篩復(fù)篩工藝放大接種倒平板培養(yǎng)基保藏活化前處理檢測(cè)培養(yǎng)基分裝傳統(tǒng)方法當(dāng)前17頁，總共64頁。誘變等10倍稀釋涂平板單菌落初篩復(fù)篩驗(yàn)證工業(yè)應(yīng)用接種到多孔板倒平板培養(yǎng)基保藏活化前處理檢測(cè)出發(fā)菌株高通量方法：96、384、1536/min傳統(tǒng)方法：1-2/min（分光光度計(jì)）1/15-30min（HPLC）傳統(tǒng)方法當(dāng)前18頁，總共64頁。出發(fā)株誘變等10倍稀釋涂平板單菌落初篩復(fù)篩驗(yàn)證放大接種倒平板培養(yǎng)基保藏活化前處理檢測(cè)培養(yǎng)基分裝當(dāng)前19頁，總共64頁。1微孔板式反應(yīng)器2微流控式芯片實(shí)驗(yàn)室3搖瓶形式的微型反應(yīng)器123當(dāng)前20頁，總共64頁。2056valves,256compartmentscontainingbacterialexpressinganenzyme24個(gè)，5ml12個(gè)，30ml24個(gè)，1ml多通道多參數(shù)微型反應(yīng)器當(dāng)前21頁，總共64頁。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用微型反應(yīng)器當(dāng)前22頁，總共64頁。當(dāng)前23頁，總共64頁。當(dāng)前24頁，總共64頁。當(dāng)前25頁，總共64頁。左圖4.9×2.3×2.2m，整個(gè)箱體有溫濕度控制，箱體內(nèi)，條形碼閱讀器、蓋板站、封板器、液體處理裝置、搖床、光度計(jì)、離心機(jī)、冷藏室等。平行地實(shí)現(xiàn)樣品準(zhǔn)備、運(yùn)行、監(jiān)控768個(gè)（16個(gè)48孔板）。系統(tǒng)集成自動(dòng)化：四個(gè)層次當(dāng)前26頁，總共64頁。Orbitor工作站重量輕only55lbs.只有25公斤高可靠性Collisiondetection&recovery沖突檢測(cè)與恢復(fù)Platesensinginthegripper微孔板傳感器Servogripper–doesnotdropaplatewhenthepowergoesout!伺服抓板手-即使停電也不會(huì)讓一個(gè)板子掉落運(yùn)送一塊板子只需4秒鐘Bi-directionaltelescopingarm雙向伸縮手Unlimited3600rotation無限360度轉(zhuǎn)動(dòng)Nohardstops無急停死角Motionblending運(yùn)動(dòng)混合smoothmovements平穩(wěn)移動(dòng)當(dāng)前27頁，總共64頁。Orbitor結(jié)構(gòu)剖解Bi-directionaltelescopingarm雙向伸縮抓板手

Rotatingbase旋轉(zhuǎn)平臺(tái)

Internalre-grip內(nèi)部固定裝置

Hotelmountx4板子堆棧*41.4.3.2.當(dāng)前28頁，總共64頁。操作靈活性PCdriven微機(jī)控制Nocontrollerrequired無需其它控制裝置Add-onstoragecapability可搭配存儲(chǔ)能力Smallfootprint小的占地空間和軌跡Feedupto4instrumentswithease可連接4臺(tái)儀器Fitswithinawidevarietyofbiosafetycabinets適應(yīng)多種型號(hào)的生物安全柜當(dāng)前29頁，總共64頁。內(nèi)容提綱高通量篩選在微生物育種中的重要意義菌種高通量篩選技術(shù)國(guó)際進(jìn)展

高通量篩選技術(shù)應(yīng)用示范當(dāng)前30頁，總共64頁。高通量篩選技術(shù)ScaleupScaledown微型化高通量標(biāo)準(zhǔn)化當(dāng)前31頁，總共64頁。對(duì)高通量篩選技術(shù)存在認(rèn)識(shí)上的誤區(qū)認(rèn)為微型化只要按比例縮小即可，忽略參數(shù)相關(guān)性問題；對(duì)操作條件的平行性沒有足夠的認(rèn)識(shí)僅注重培養(yǎng)環(huán)節(jié)高通量，忽略其他步驟匹配和瓶頸的轉(zhuǎn)移問題對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化重于最優(yōu)化的認(rèn)識(shí)不足高通量篩選是提高成功幾率的一種技術(shù)手段當(dāng)前32頁，總共64頁。菌種高通量篩選技術(shù)組成高通量前處理技術(shù)高通量培養(yǎng)技術(shù)高通量液體處理技術(shù)高通量轉(zhuǎn)接種技術(shù)高通量克隆制備技術(shù)菌種庫管理技術(shù)高通量數(shù)據(jù)管理技術(shù)高通量分析檢測(cè)技術(shù)菌種高通量篩選技術(shù)當(dāng)前33頁，總共64頁。分析測(cè)試高通量培養(yǎng)菌種資源菌種高通量篩選技術(shù)通量匹配限制瓶頸在不斷克服和轉(zhuǎn)移當(dāng)前34頁，總共64頁。菌種高通量篩選技術(shù)菌種高通量篩選技術(shù)是一整套高通量技術(shù)的有機(jī)整合和合理匹配當(dāng)前35頁，總共64頁。紅霉素生產(chǎn)菌株的微型化培養(yǎng)及分析菌落庫孔板培養(yǎng)離心移液檢測(cè)高通量當(dāng)前36頁，總共64頁。微型化培養(yǎng)就搖瓶與微孔板之間的生理發(fā)酵參數(shù)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了研究，以證實(shí)微型化培養(yǎng)方法的可行性，為紅霉素產(chǎn)生菌高通量篩選奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)前37頁，總共64頁。微型化培養(yǎng)--動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較t1t2t3t4t5t6搖瓶30〞31〞2829〞2034〞2237〞28〞3012孔板(2.5ml)8〞978〞618〞599〞119〞328〞87搖瓶12孔微孔板kLa（h-1）105．288．42.1氧氣傳遞系數(shù)2.2物料混合當(dāng)前38頁，總共64頁。流場(chǎng)特性當(dāng)前39頁，總共64頁。OTR與混合三、國(guó)家生化工程中心的高通量篩選工作基礎(chǔ)當(dāng)前40頁，總共64頁。微型化培養(yǎng)--發(fā)酵參數(shù)比較

2.3生物效價(jià)2.4

總糖的對(duì)應(yīng)性實(shí)驗(yàn)當(dāng)前41頁，總共64頁。微型化培養(yǎng)--發(fā)酵參數(shù)比較

2.5還原糖的對(duì)應(yīng)性實(shí)驗(yàn)2.6生物量當(dāng)前42頁，總共64頁。微型化培養(yǎng)--裝置圖種子（挖塊）發(fā)酵（孔徑2cm）

當(dāng)前43頁，總共64頁。微型化分析建立與微型化發(fā)酵培養(yǎng)配套的檢測(cè)方法，才能真正意義上實(shí)現(xiàn)篩選的高通量。生物檢測(cè)法化學(xué)檢測(cè)法當(dāng)前44頁，總共64頁。生物檢測(cè)法生物檢定法又分管碟法和比濁法兩種，管碟法是最常用的生物檢定法，也是我國(guó)2005版之前藥典收錄的唯一一種微生物檢定法。與管碟法比較，比濁法具有快速(檢驗(yàn)僅需3～4h)、易于操作、采用液體培養(yǎng)法、無擴(kuò)散因素影響、靈敏度高和精密度較好等優(yōu)點(diǎn)，適用于絕大部分抗生素和含抗生素樣品的含量測(cè)定?；瘜W(xué)檢測(cè)法紅霉素分子在酸性條件下水解生成黃色絡(luò)合物，此顏色與含量成正比，符合朗格爾比色定律。紅霉素檢測(cè)方法當(dāng)前45頁，總共64頁。微型化分析--生物檢測(cè)法微量比濁法測(cè)定紅霉素生物效價(jià)的可行性

當(dāng)前46頁，總共64頁。微型化分析--生物檢測(cè)法當(dāng)前47頁，總共64頁。微型化分析--生物檢測(cè)法123456789101112A0.3300.3310.3310.3300.3310.3300.3310.3320.3310.3310.3310.330B0.3320.3330.3330.3320.3320.3330.3330.3330.3330.3330.3320.332C0.3310.3320.3320.3320.3320.3320.3330.3330.3320.3320.3320.331D0.3320.3330.3340.3330.3330.3330.3340.3340.3330.3330.3330.332E0.3320.3330.3330.3330.3330.3330.3340.3330.3330.3340.3330.332F0.3330.3340.3340.3340.3330.3330.3340.3360.3340.3330.3330.333G0.3330.3330.3340.3340.3330.3330.3340.3340.3340.3340.3340.333H0.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.333準(zhǔn)確度：1.5%精密度：0.005相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)：1.48%檢驗(yàn)96孔板的準(zhǔn)確度與精密度

當(dāng)前48頁，總共64頁。微型化分析--化學(xué)檢測(cè)法紅霉素化學(xué)效價(jià)測(cè)定結(jié)果比較當(dāng)前49頁，總共64頁。微型化分析--化學(xué)檢測(cè)法樣品前處理對(duì)紅霉素效價(jià)檢測(cè)的影響分析當(dāng)前50頁，總共64頁。微型化分析--化學(xué)檢測(cè)法高通量化學(xué)檢測(cè)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品加入法是在樣品溶液中加入一系列梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行顯色測(cè)定，然后按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測(cè)定吸光度,繪制吸光度-加入濃度曲線,用外推法求得樣品溶液的濃度。兩條直線切入橫座標(biāo)上所間的距離，即是樣品中紅霉素的化學(xué)效價(jià)，為47.8μ/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定的結(jié)果為48.02μ/ml，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.00324Y1=0.0046X-0.0164Y2=0.0046X+0.2202當(dāng)前51頁，總共64頁。高通量（微型化）抗生素效價(jià)分析方法生物效價(jià)高通量分析方法：

基于比濁法原理設(shè)計(jì)生物效價(jià)高通量分析方法，使分析時(shí)間從20多小時(shí)縮短到4小時(shí)，分析樣品量從1ml降到10ul，鑒定菌培養(yǎng)基從30ml降到90ul，一次檢測(cè)樣品數(shù)量可達(dá)到成百上千份，而且僅需1人操作，傳統(tǒng)生物效價(jià)分析，每天每人分析樣品數(shù)量50份左右。化學(xué)效價(jià)高通量分析方法：

開發(fā)了可以與自動(dòng)化液體處理工作站相匹配的微量化化學(xué)分析路線，篩選通量更高，樣品檢測(cè)體積更小，反應(yīng)體積從20ml降到500ul，檢測(cè)體積從5ml降到100ul，分析時(shí)間更短，1小時(shí)之內(nèi)完成上千份樣品分析。當(dāng)前52頁，總共64頁。微型化平臺(tái)應(yīng)用單菌落培養(yǎng)當(dāng)前53頁，總共64頁。高通量培養(yǎng)技術(shù)裝液量：500—2000ul24孔48孔96孔固體培養(yǎng)和菌種保藏當(dāng)前54頁，總共64頁。可滅菌、重復(fù)使用壽命長(zhǎng)、成本低、易清洗、能統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、防交叉污染、透氣性好、防