儀器分析課程

儀器分析課程第一頁，共三十七頁，2022年，8月28日§12.1分子發(fā)光的基本原理第一次記錄熒光現(xiàn)象的是16世紀西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學家N.Monardes，1575年他提到在含有一種稱為“LignumNephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛的天藍色。直到1852年，Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光光度計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍微長些，才判斷這種現(xiàn)象是這些物質在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而導入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦石“螢石”推演而提出“熒光”這一術語。1867年，Goppelsroder進行了歷史上首次的熒光分析工作，應用鋁—桑色素配合物的熒光進行鋁的測定。19世紀以前，熒光的觀察是靠肉眼進行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一臺熒光計。第二頁，共三十七頁，2022年，8月28日一.分子熒光與磷光的產(chǎn)生1.單重態(tài)與三重態(tài)2.分子的活化與去活化3.分子發(fā)光的類型按激發(fā)的模式分類：按分子激發(fā)態(tài)的類型分類：光致發(fā)光化學發(fā)光/生物發(fā)光熱致發(fā)光場致發(fā)光摩擦發(fā)光

分子發(fā)光分子發(fā)光熒光磷光瞬時熒光遲滯熒光按光子能量分類：斯托克斯熒光(Stokes)：λex<λem反斯托克斯熒光(Antistokes)：λex>λem共振熒光(Resonance)：λex=λem熒光

第三頁，共三十七頁，2022年，8月28日分子的活化與去活化S0S1T1S2紫外可見吸收光譜外轉移紫外可見共振熒光光譜內(nèi)轉移熒光系間竄躍磷光反系間竄躍遲滯熒光振動弛豫２.無輻射躍遷的類型振動弛豫:Vr10-12sec外轉移:無輻射躍遷回到基態(tài)內(nèi)轉移:S2~S1能級之間有重疊系間竄躍:

S2~T1能級之間有重疊反系間竄躍:由外部獲取能量后T1~

S2１.輻射躍遷的類型共振熒光：10-12sec熒光：10-8sec磷光：1~10-4sec遲滯熒光:102~10-4sec第四頁，共三十七頁，2022年，8月28日二.分子熒光(磷光)光譜1.熒光(磷光)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜熒光(磷光)均為光致發(fā)光，在光輻射的作用下，熒光物質發(fā)射出不同波長的熒光。A.激發(fā)光譜固定em=620nm(MAX)ex=290nm(MAX)固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長熒光激發(fā)光譜與紫外-可見吸收光譜類似第五頁，共三十七頁，2022年，8月28日ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)B.發(fā)射光譜(熒光光譜)固定激發(fā)波長掃描發(fā)射波長C.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關系S04321S14321發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關：分子的激發(fā)光譜可能含有幾個激發(fā)帶，但發(fā)射光譜只含一個發(fā)射帶；即使分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)，由于經(jīng)過極快的內(nèi)轉換和振動弛豫降到S1電子態(tài)的最低振動、轉動能級，然后以輻射形式釋放能量回到基態(tài)。1→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1第六頁，共三十七頁，2022年，8月28日D.磷光光譜與發(fā)射光譜相同條件下的磷光光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜第七頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.三維熒光光譜IF

∝f(λex

、λem)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長、掃描激發(fā)波長第八頁，共三十七頁，2022年，8月28日IF

∝f(λex

、λem)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長、掃描發(fā)射波長第九頁，共三十七頁，2022年，8月28日蒽的三維等高線光譜圖第十頁，共三十七頁，2022年，8月28日蒽的三維等熒光強度光譜第十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日VB1和VB2的三維熒光光譜第十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日RLSDSTSATSADS散射片三維共振光散射光譜3.三維共振光散射光譜ADSATSTSRLSDS散射片三維共振光散射等高線光譜圖共振光散射瑞利散射固定ex=270nm拉曼光二級共振光散射三級共振光散射熒光光譜有用區(qū)間第十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日三.分子熒光(磷光)強度與熒光物質濃度的關系1.熒光強度(磷光)與濃度的關系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相應的吸光分數(shù)為：熒光強度（IF）與相應的吸光分數(shù)成正比：按照級數(shù)展開式：第十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日對于稀溶液，當bc<0.05（磷光bc<0.01）時：IF----熒光強度F-----熒光量子產(chǎn)率k--與儀器靈敏度有關的參數(shù)I0--入射光強度。IP----磷光強度P-----磷光量子產(chǎn)率b--吸收光程--摩爾吸光系數(shù)C--熒光物質濃度2.熒光(磷光)的平均壽命分子在激發(fā)態(tài)的平均時間或者說處于激發(fā)態(tài)的分子數(shù)目衰減到原來的1/2所經(jīng)歷的時間。對于處于S1(T1)電子態(tài)的熒光體來說，其平均壽命()可以左式表示：

第十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日3.熒光(磷光)的量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率的定義：kF、kp主要取決與熒光物質的分子結構；st系間竄躍效率。ki主要取決化學環(huán)境，同時也與熒光物質的分子結構有關。大多數(shù)的熒光物質的量子產(chǎn)率在0.1~1之間；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F(xiàn)=0.55；

熒光素F=1化合物F0.110.290.460.600.52第十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日1.躍遷的類型二.熒光與有機化合物的結構對于有機熒光物質:π*

→π

n→π*εmax＜

100平均壽命10-5~10-7secπ→π*

εmax≥104平均壽命10-7~10-9seckS→T小π*→nπ*→π是有機化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。強熒光的有機化合物具備下特征:①具有大的共軛π鍵結構；②具有剛性的平面結構；③具有最低的單重電子激發(fā)態(tài)為S1為π*

→π型；④取代基團為給電子取代基?！?2.2分子熒光與磷光強度的影響因素一.熒光的量子產(chǎn)率第十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日2.共軛效應產(chǎn)生熒光的有機物質，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，離域大π鍵的電子越容易激發(fā)，熒光與磷光越容易產(chǎn)生?；衔锉捷凛於∈∥焓ˇ薳xmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52熒光物質的剛性和平面性增加，有利于熒光發(fā)射。3.剛性平面結構芴聯(lián)苯F=1F=0.2第十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日不產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光F=0.92萘VAF(萘)=5F(VA)

熒光黃酚酞偶氮菲偶氮苯第十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日1）給電子取代劑加強熒光4.取代基效應—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN產(chǎn)生p→π共軛二苯甲酮：弱熒光、強磷光S1→T1的系間竄躍產(chǎn)率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相對熒光強度10182020202）得電子取代基減弱熒光、加強磷光—C=0，—COOH，—NO2不產(chǎn)生p→π共軛硝基苯：不產(chǎn)生熒光、弱磷光第二十頁，共三十七頁，2022年，8月28日空間位阻對熒光發(fā)射的影響3）取代基的位置反式二苯乙烯強熒光物質F=0.75F=0.03立體異構體對熒光發(fā)射的影響順式二苯乙烯非熒光物質電離效應對熒光發(fā)射的影響OH-H+OH-H+pH=1,有熒光pH=13,無熒光無熒光有熒光第二十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日含有重原子的溶劑，由于重原子效應熒光減弱、磷光增強。5.重原子取代基效應—Cl，—Br，—IS1→T1的系間竄躍由于重原子的存在增強化合物萘1-甲基萘1-氟萘1-氯萘1-溴萘1-碘萘λFmax(nm)315318316319320~λPmax(nm)470476473483484488P/F0.0930.0530.0685.26.4>1000τ

p(s)2.62.51.40.230.0140.00236.溶劑效應藍移:△

En→π*

＜△

En→π*紅移:△

Eπ→π*

＞△

Eπ→π*在極性溶劑中：無溶劑化作用有溶劑化作用第二十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日三.金屬螯合物的熒光1.螯合物中配位體的發(fā)光2.螯合物中金屬離子的發(fā)光8-羥基喹啉弱熒光8-羥基喹啉-Zn螯合物黃綠色強熒光2,2`-二羥基偶氮苯無熒光2,2`-二羥基偶氮苯-Al螯合物強熒光T1系間竄躍S0S1d*、f*

d*→

df*→

f熒光分子內(nèi)能量轉移第二十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日四.熒光的熄滅1.碰撞熄滅熒光熄滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質分子相互作用引起熒光強度降低或消失的現(xiàn)象。熒光熄滅劑：這些溶劑分子或其它溶質分子稱為熒光熄滅劑。相對速率

1K1[M*]K2[M*][Q]與分子的直徑、粘度、溫度等因素有關。2.能量轉移熄滅再吸收過程：共振能量轉移：分子內(nèi)能量轉移：hv激發(fā)發(fā)射熄滅第二十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日3.氧的熄滅作用氧分子是熒光、磷光的熄滅劑，4.自熄滅與自吸收當熒光物質的濃度大于1g/L時，常發(fā)生熒光的自熄滅(濃度熄滅)自吸收：沒有除氧，溶液中難以觀察到磷光由于F<1，使熒光強度減弱或消失.形成二聚體：由于二聚體不發(fā)熒光，或發(fā)射熒光的能量有改變，造成自熄滅現(xiàn)象。第二十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日§12.3熒光(磷光)分光光度計一.主要組成及部件的功能熒光分光光度計工作原理基及儀器結構框圖光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器問題：熒光分光光度計與紫外-可見分光光度計有何異同點？第二十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日二.光源1.光源的要求：發(fā)射強度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強度隨波長的變化小有足夠長的使用壽命2.氙燈光源常用氣體放電燈類型：

氙燈光源高壓汞光源波長范圍：200~1000nm工作壓力：5~20atm啟動電壓：20~40KV使用壽命：1000~2000h最廣泛應用的連續(xù)光源：發(fā)射波長范圍寬發(fā)射光強度大第二十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日3.高壓汞燈光源應用廣泛的線光源：253.7296.5302.2312.6313.2365.0365.5366.3404.7435.8546.1557.0579.0(nm)光源樣品池激發(fā)濾光片檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器光源樣品池激發(fā)濾光片檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射濾光片第二十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日玻璃濾光片的透射率干涉濾光片的透射率截止涉濾光片的透射率第二十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日三.單色器平面衍射光柵線色散率聚光本領分辨率四.檢測器光電倍增管放大倍數(shù)：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109五.樣品池：液池、熒光池1.樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計的吸收池一樣2.吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計的吸收池兩面透光熒光分光光度計的樣品池四面透光波長范圍3.使用注意事項容易破碎問題：紫外-可見分光光度計的吸收池與熒光分光光度計的樣品池有什么區(qū)別？沾污問題閃躍特性第三十頁，共三十七頁，2022年，8月28日六.磷光分光光度計1.光學系統(tǒng)與熒光分光光度計的區(qū)別光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器切光器（斬波器）共振熒光：10-12sec熒光：10-8sec磷光：1~10-4sec遲滯熒光：100~10-4sec2.樣品池與熒光分光光度計的區(qū)別通常情況下，樣品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，來測定低溫磷光。第三十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日§12.４熒光分析法的應用一.工作曲線法熒光分析的靈敏度比紫外－可見分光光度法高103～104.熒光熄滅工作曲線法FxFCsCx直接熒光標準曲線法FCsFxCx二.熒光分析法的靈敏度第三十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日在紫外光照射下會發(fā)生熒光的無機化合物很少，主要依賴于有機試劑形成的螯合物。三.熒光分析的應用1.無機化合物直接熒光測定法其中，較常測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd與某些稀土元素；測定的靈敏度有些可以達到10-10;某些元素雖然不與有機試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會與發(fā)熒光的配合物爭奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光熄滅，由熒光熄滅的強度此該元素的含量。較常測定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W熒光熄滅測定法自從1867年Goppelsroder進行了歷史上首次的熒光分析工作，應用鋁—桑色素配合物的熒光進行鋁的測定以來，采用有機試劑可以測定70多種元素。第三十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日催化熒光測定法較常測定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb某些元素雖然與有機試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是反應速度慢，在某些微量元素的催化下，反應速度會加快，在特定的時間內(nèi)可用來測定微量元素。低溫熒光測定法常測定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN某些微量