凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)

凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)第一頁(yè)，共十二頁(yè)，2022年，8月28日【目的要求】1、熟悉凝膠色譜分離的基本原理；2、掌握凝膠柱色譜填充物的裝柱、平衡、加樣、洗脫等基本操作技術(shù)。第二頁(yè)，共十二頁(yè)，2022年，8月28日【實(shí)驗(yàn)原理】凝膠色譜是利用某些凝膠對(duì)于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異而進(jìn)行分離的技術(shù)。當(dāng)溶液在色譜柱內(nèi)流過(guò)時(shí)，各種物質(zhì)分子在柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行向下的移動(dòng)和不定向的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)由于分子直徑大，難于進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，只能在凝膠顆粒的間隙中隨流動(dòng)相快速向下移動(dòng)；而小分子物質(zhì)能夠擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，因此在流動(dòng)過(guò)程中不斷地進(jìn)出于膠粒的微孔，這樣就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度落后于大分子物質(zhì)，從而使溶液中的各組分按分子量從大到小的順序先后流出色譜柱，達(dá)到分離純化的目的。第三頁(yè)，共十二頁(yè)，2022年，8月28日【實(shí)驗(yàn)用品】1、材料葡聚糖凝膠SephadexG-100、藍(lán)色葡聚糖2000、溶菌酶2、試劑（1）藍(lán)色葡聚糖-2000（2mg/mL）和溶菌酶（6mg/mL）組成的混合液（2）乙酸緩沖液3、器具色譜柱、鐵架臺(tái)、試管、紫外分光光度計(jì)或紫外檢測(cè)儀、電爐、容量瓶、燒杯、三角瓶、滴管、移液管、玻棒。第四頁(yè)，共十二頁(yè)，2022年，8月28日【實(shí)驗(yàn)過(guò)程】凝膠溶脹：根據(jù)預(yù)計(jì)的總床體積和所用干膠的床體積，稱出所需干凝膠放入大三角瓶或燒杯中，加入過(guò)量的緩沖溶液或去離子水，浸泡24h以上或沸水浴中煮沸溶脹2~3h，冷卻至室溫。用傾瀉法將不易沉下的較細(xì)的顆粒傾去。第五頁(yè)，共十二頁(yè)，2022年，8月28日1、凝膠柱的制備。裝柱：升高或關(guān)閉色譜柱的出水口，在柱內(nèi)先注入約1/3柱高的緩沖液。輕輕攪動(dòng)三角瓶中的凝膠（切勿攪動(dòng)太快，以免空氣進(jìn)入），使之形成均一的凝膠漿，并立即緩慢并連續(xù)不斷地沿玻棒倒入柱中，讓其沉降約1~2cm高時(shí)，然后降低或打開(kāi)柱的出水口，讓緩沖液慢慢地流出。隨著下面水的流出，上面陸續(xù)不斷地添加凝膠，直至凝膠完全沉降至所需的柱高為止，然后在凝膠表面上放一片濾紙，以防將來(lái)在加樣時(shí)凝膠被沖起。柱要一次裝完，不能間歇，并始終保持凝膠上端有一段液體。層析分離系統(tǒng)第六頁(yè)，共十二頁(yè)，2022年，8月28日2、平衡：用乙酸緩沖液流動(dòng)平衡凝膠色譜柱。開(kāi)始時(shí)，流速控制在低于0.5mL/min，在平衡過(guò)程中逐漸增加到色譜時(shí)的速度即3~4mL/5min，一般用約2~3倍總床體積的緩沖溶液流過(guò)柱即可平衡。第七頁(yè)，共十二頁(yè)，2022年，8月28日3、加樣：吸去柱床表面以上的溶液，面上留下一些液體從柱的出口流出。等到凝膠床面上的液體正好流干時(shí)，小心地用滴管將約1mL藍(lán)色葡聚糖和溶菌酶的混合液加到凝膠床面上。先使滴管尖端接觸離柱床表面約1cm高處的內(nèi)壁，隨加隨沿柱內(nèi)壁轉(zhuǎn)動(dòng)一周，然后迅速移至中央，使樣品盡可能快地覆蓋住全膠面，打開(kāi)下口，以便使樣品均勻地滲入柱內(nèi)，當(dāng)樣品液下降至與膠面相平（膠面必須覆蓋一層薄薄的溶液）時(shí)，關(guān)閉下口。待其正好流干時(shí)再加少量緩沖溶液，這樣滴入洗脫液時(shí)不會(huì)沖動(dòng)凝膠床面。加樣前，如果膠面不平整，可用玻棒將膠表層輕輕攪起，待其自然沉降至平整后，方可加樣，加樣過(guò)程中注意不要破壞膠面的平整。第八頁(yè)，共十二頁(yè)，2022年，8月28日4、洗脫：用乙酸緩沖液進(jìn)行洗脫。流速控制在0.25mL/min。每15分鐘收集一管，然后用紫外分光光度計(jì)于280nm處測(cè)定每管吸光度（A280）。洗脫過(guò)程中要注意觀察藍(lán)色區(qū)帶向下移動(dòng)的情況，如前沿平齊，區(qū)帶均勻，說(shuō)明柱是均勻的，可以使用。如不均一，必須重新裝柱。以管號(hào)（或洗脫體積）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作出洗脫曲線，并分辨藍(lán)色葡聚糖-2000和溶菌酶的洗脫峰或洗脫位置。第九頁(yè)，共十二頁(yè)，2022年，8月28日【注意事項(xiàng)】1、色譜柱大小可根據(jù)實(shí)際需要選擇，一般來(lái)說(shuō)，細(xì)長(zhǎng)的柱分離效果較好。若樣品量多，最好選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時(shí)分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時(shí)，會(huì)發(fā)生管壁效應(yīng)，即柱管中心部分的組分移動(dòng)慢，而管壁周圍的移動(dòng)快。柱越長(zhǎng)，分離效果越好，但柱過(guò)長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。2、裝好的色譜柱凝膠要均勻，不能有斷層或紋路或氣泡，將柱管對(duì)著光照方向觀察，若色譜柱床不均勻，必須重新裝柱。第十頁(yè)，共十二頁(yè)，2022年，8月28日3、各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。操作過(guò)程中，色譜柱內(nèi)液面不斷下降，則表示整個(gè)系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細(xì)檢查并加以糾正。4、始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)，導(dǎo)致分離效果變差，不得不重新裝柱。5、洗脫用的液體應(yīng)與凝膠溶脹所用液體相同，否則，由于更換溶劑引起凝膠容積變化，從而影響分離效果第十一頁(yè)，共十二頁(yè)