PEG誘導(dǎo)細胞融合課件

PEG誘導(dǎo)細胞融合細胞融合自發(fā)條件下或人工誘導(dǎo)下，兩個或兩個以上的同種基因型或異種基因型的細胞融合成一個細胞的過程稱為細胞融合，也稱細胞雜交。同種細胞能夠自發(fā)融合，是機體重要的生命活動，如有性生殖時配子的融合。異種細胞的融合必須經(jīng)過誘導(dǎo)劑處理，進行誘發(fā)融合。細胞融合技術(shù)是指細胞通過誘導(dǎo)和培養(yǎng)，在離體條件下用人工方法使不同種細胞發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合從而形成雜種細胞，使其同時具有兩種細胞的遺傳和生物特性。常用的人工誘導(dǎo)方法包括：病毒誘導(dǎo)法、電刺激法、聚乙二醇誘導(dǎo)法。2.PEG作為促融劑引起的革命、

由于病毒誘導(dǎo)細胞融合存在著病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價差異大等原因,科學(xué)家們又嘗試尋找比病毒簡便、快速和高效且比病毒更易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便的化學(xué)PEG加拿大華裔科學(xué)家高國楠等(1974年)的研究取得重大突破他發(fā)現(xiàn)高分子量的聚乙二醇(PEG)在Ca2+存在時能促使植物原生質(zhì)體融合顯著提高融合率從而迅速推動了原生質(zhì)體技術(shù)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。至此應(yīng)用原生質(zhì)體和發(fā)展操縱它們的方法已引起實驗生物學(xué)的“無聲革命”。,同時,Pontecorvo(1975年)發(fā)現(xiàn)PEG能誘導(dǎo)哺乳動物細胞融合并產(chǎn)生雜交細胞。1976年Davidson等對此作了進一步證實。以后的研究工作表明,PEG不僅可以促使植物、動物、微生物的細胞融合,而且還能促使動物細胞與植物的原生質(zhì)體發(fā)生融合,促使微生物原生質(zhì)體與動物細胞融合,使植物原生質(zhì)體攝入微生物。1975年Ahkono報道用PEG將母雞的紅血球細胞和酵母菌的原生質(zhì)體融合成功1976年Dudus等報道人的細胞能和胡蘿卜的原生質(zhì)體發(fā)生融合。Davey(1972年)和Vasil(1977年)用植物原生質(zhì)體攝取了細菌細胞。1975年，在動物體細胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上又創(chuàng)立了淋巴細胞雜交瘤技術(shù)。同體細胞融合一樣,雜交瘤工作早期使用的促融劑——滅活的仙臺病毒,已逐漸為化學(xué)促融劑PEG所取代。Davidson等于1976年建立的以PEG誘發(fā)哺乳類細胞融合的方法,也同樣適用于淋巴細胞同瘤細胞的融合。由于淋巴細胞雜交瘤技術(shù)能制備純度高、專一性強的抗體,適于由未純化的抗原大量制備,因而在短短幾年時間里,即已被廣泛用于制備各種單克隆抗體。PEG作用機制聚乙二醇（PEG）是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG是一種特殊的脫水劑，可與水借氫鍵結(jié)合，導(dǎo)致細胞脫水而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的變化，使細胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散，進而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親和以及彼此間表面張力的作用，引起相鄰的重排質(zhì)膜在修復(fù)時相互合并在一起，使細胞的胞質(zhì)溝通，從而造成相互接觸的細胞之間發(fā)生融合。PEG的最適使用條件細胞的融合效果與PEG的相對分子質(zhì)量及其體積分數(shù)成正比，但PEG的相對分子質(zhì)量越大、體積分數(shù)越高，對細胞的毒性也就越大。實驗時常選用PEG相對分子質(zhì)量為4000-6000，體積分數(shù)為50%時，細胞破碎較少，融合率較高。實驗結(jié)果：

觀察到兩個或多個細胞發(fā)生質(zhì)膜融合但核尚未融合，有的則是細胞間不僅發(fā)生質(zhì)膜融合，而且細胞核也發(fā)生了融合。

剛開始融合

開始進行核融合分析討論聚乙二醇分子能改變各類細胞的生物膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，使細胞發(fā)生融合，形成融合細胞。本次實驗用聚乙二醇處理雞紅血細胞并制片利用顯微鏡觀察。由實驗結(jié)果可得，雞血紅細胞兩個或者更多出現(xiàn)不同程度的相互融合，但總體來說融合率還是不錯的。經(jīng)分析主要是以下原因：由于PEG與雞血紅細胞懸濁液接觸時間適宜，PEG與雞血紅細胞充分接觸，從而融合率比較高。實驗注意事項：1.由于離心時紅細胞的數(shù)量很少，吸取的時候要小心，盡量把吸附在管壁上的紅細胞都吸出來。此外吸取的動作不能太大，否則會破壞離心形成的分層。2.PEG處理時間不宜過長，最多不能超過90s，否則會有多個細胞彼此融合形成巨大的合胞體，或者細胞膜破裂導(dǎo)致細胞質(zhì)外泄。3.經(jīng)PEG處理后加液混勻時應(yīng)輕輕洗打，以免剛剛?cè)诤系募毎珠_。4.加PEG應(yīng)該在37oC水浴加，這樣可以防止PEG凝固，導(dǎo)致離心失敗。5.注意每次離心的時間和速度，否則得不到想要的紅細胞。新的細胞融合方法細胞融合技術(shù)在生物科學(xué)各領(lǐng)域取得進展的同時,從事細胞融合研究的科學(xué)工作者一直沒有放棄尋找具有更高融合效率的方法。雖然用PEG作介質(zhì)誘導(dǎo)細胞融合具有上述優(yōu)點,但PEG誘導(dǎo)細胞融合也存在一些內(nèi)在的問題,如PEG在有效的濃度范圍內(nèi)(50%～55%)對細胞毒性很大,因此人們又試圖尋找新的方法來替代PEG介導(dǎo)細胞融合法。細胞融合技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展前景從細胞融合技術(shù)發(fā)展的歷程可以看到,伴隨著細胞融合技術(shù)的每一次革新和改進,都會迅速在各個領(lǐng)域得到充分的應(yīng)用,然后在實際應(yīng)用中又不斷發(fā)現(xiàn)新的問題,在解決實際問題中又促使細胞融合技術(shù)躍上一個又一個新的臺階,使其日臻完善。動物細胞融合、植物細胞融合、微生物細胞融合以及三者之間的細胞融合不斷應(yīng)用于基礎(chǔ)理論研究和人類生產(chǎn)實際。如創(chuàng)造新物種、培育動物新品種、植物育種、種質(zhì)保存、無性系的快速繁殖、獲得優(yōu)良的微生物菌種以及藥物單克隆抗體和疫苗等有用物質(zhì)的生產(chǎn)。并且細胞融合技術(shù)和基