基因工程的概念

基因工程的概念第1頁/共64頁第2頁/共64頁第3頁/共64頁第4頁/共64頁15.1基因工程的概念

一、基因工程的概念：

利用DNA體外重組或PCR擴增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當?shù)氖荏w細胞，以期獲得基因表達的過程.第5頁/共64頁基因工程(geneengineering)常和以下名稱混用遺傳工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重組DNA技術(shù)(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名詞時指含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖系.15.1基因工程的概念第6頁/共64頁二、基因工程的主要內(nèi)容或（步驟）1、從復雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片段。2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3、將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞(亦稱寄主細胞)，并與之一起增殖。4、從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞克隆。5、從這些篩選出來的受體細胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進一步分析研究使用。6、將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。15.1基因工程的概念第7頁/共64頁三、基因工程的應用醫(yī)藥：生物制藥；基因治療；人工器官農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)

轉(zhuǎn)基因植物：抗病蟲害新品種、抗逆新品種、高品質(zhì)新品種

轉(zhuǎn)基因動物：生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)和高品質(zhì)的畜產(chǎn)品

生物反應器：利用動植物細胞或組織作為生物反應器，直接生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)輕工與食品新型食品；營養(yǎng)食品；保健食品；輕工用酶環(huán)境污染治理；廢物利用；污染物生物降解15.1基因工程的概念第8頁/共64頁15.1基因工程的概念第9頁/共64頁轉(zhuǎn)基因植物15.1基因工程的概念第10頁/共64頁轉(zhuǎn)基因動物作為生物發(fā)生器15.1基因工程的概念第11頁/共64頁15.2基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類—用于生物細胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測等第12頁/共64頁15.2基因工程中的工具酶第13頁/共64頁

一、限制性內(nèi)切酶

（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名（三）、限制酶的特點（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、限制酶的用途15.2基因工程中的工具酶第14頁/共64頁一種限制酶只能識別一種特定核苷酸序列；并在特定切點切割．限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”

來源：

種類：

作用：主要是微生物4000種。15.2基因工程中的工具酶第15頁/共64頁（一）、限制修飾系統(tǒng)的種類1.

Ⅰ型：由三個基因構(gòu)成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色體上，三個基因構(gòu)成一個復合體，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），無特異切割位點。2.

Ⅱ型：限制與修飾基因產(chǎn)物獨立起作用，在Ｅ.coli中這兩種基因位于質(zhì)粒上。3.

Ⅲ型：修飾酶與Ｉ型酶相同，hsdＭ與hsdＳ基因產(chǎn)物結(jié)合成一亞單位，限制酶是獨立存在的。上述三個系統(tǒng)中，只有II型限制酶與甲基化酶具有相當高的核苷酸識別特異性，因而被廣泛用于基因工程中。15.2基因工程中的工具酶第16頁/共64頁（二）、限制性內(nèi)切酶的定義、命名

1.定義：廣義指上述三個系統(tǒng)中的限制酶；狹義指Ⅱ型限制酶。

2.命名：限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名、菌系編號、分離順序。例如：HindⅢ前三個字母來自于菌種名稱H.influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個限制酶。

EcoRI—Escherichiacoli

RI

15.2基因工程中的工具酶第17頁/共64頁（三）、限制酶的特點

1.識別順序和酶切位點

１）識別４-8個相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

２）富含ＧＣ３）對稱性—雙對稱

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外５）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是５’-Ｐ和３’-ＯＨ15.2基因工程中的工具酶第18頁/共64頁

2.

末端種類

１）３’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’

粘性末端能與另一個相同的粘連末端相連接，任何兩個具有相同識別位點的DNA分子經(jīng)限制酶切割后能夠重新連接成新的重組DNA分子。在進行

DNA重組時，應用限制酶同時切割目的基因和載體DNA，使之產(chǎn)生相對的粘性末端，然后再將二者連接成重組DNA分子15.2基因工程中的工具酶第19頁/共64頁

EcoRⅠ

5’-

G-A-A-T-T-C-3’

3’-

C-T-T-A-A-G-5’

Palindrome5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAP

HOG-5’CohesiveEnds(StickyEnds)15.2基因工程中的工具酶第20頁/共64頁SmaI

5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’BluntEnds15.2基因工程中的工具酶第21頁/共64頁

３）

平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互補的粘性末端

ａ）切點在識別順序之外的，如：FokI

FokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

ｂ）能識別簡并順序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

15.2基因工程中的工具酶第22頁/共64頁（四）、異源同序酶（isoschizomer，同裂酶）

1.定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶

2.特點：1）識別相同順序

2）切割位點的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG15.2基因工程中的工具酶第23頁/共64頁（五）、限制酶的用途

1.

DNA重組

2.

限制酶（物理）圖譜繪制

3.

突變分析（RFLP分析）

4.限制酶的部分酶切與完全酶切附：IIS型限制酶的特點

1.

具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。

2.

酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側(cè)，1--20nt。

3.

酶切后的末端經(jīng)補平后又可發(fā)生酶切反應。

4.

產(chǎn)生粘性末端可以是1--5個核苷酸。

5.

均為單體，分子量為47—108kD。15.2基因工程中的工具酶第24頁/共64頁RestrictionMaps(a)15.2基因工程中的工具酶第25頁/共64頁RestrictionMaps(b)15.2基因工程中的工具酶第26頁/共64頁M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連甲基化酶人工接頭RE用于基因組文庫的建立用于cDNA的連接RERERE15.2基因工程中的工具酶第27頁/共64頁二、DNA聚合酶（一）、E.coliDNA聚合酶I（polⅠ）

1.E.coli

的DNA聚合酶系統(tǒng)

PolⅠ參與DNA修復,具3’→5’和5’→3’外切酶活性

polⅡ同上具3’→5’外切酶活性

polⅢ參與DNA復制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性

2.E.colipolⅠ的特點

1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應條件的影響

3）外切酶活性15.2基因工程中的工具酶第28頁/共64頁3.用途

1）除去3’-端突起的單鏈DNA（在無dNTP時）

2）補齊5’-突起端

3）合成第二條cDNA4）切口移位制備探針其中用途2)和3)常用大片段15.2基因工程中的工具酶第29頁/共64頁三、連接酶（一）、T4DNA連接酶

1.特點：

只連接ds-DNA分子，要求3’-羥基和5’-磷酸基

2.用途：

1)相同或相容粘性末端的連接

2)平整末端的相連

DNA平端來源：限制酶作用結(jié)果;限制酶與其它酶共同作用結(jié)果。平端的連接比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多

15.2基因工程中的工具酶第30頁/共64頁5’-AAGCTT-3’5’-AOH

PAGCTT-3’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAP

HOA-5’HOATTCGAP

退火

5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’

或

5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’

T4DNA連接酶

5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’

或

5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’T4DNA連接酶的連接反應(兩種插入方向)

+第31頁/共64頁Thepolymerasechainreaction(PCR)：toamplifyasequenceofDNAusingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.

1985年，美國Cetus公司和加利福尼亞大學聯(lián)合創(chuàng)建了一種核酸體外擴增技術(shù)。15.3

PolymeraseChainReaction第32頁/共64頁Denaturation（變性）:ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing（引物退火）:Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg++15.3

PolymeraseChainReaction第33頁/共64頁第34頁/共64頁15.4

Vectors一、質(zhì)粒的一般生物學特性；二、質(zhì)粒DNA的分離與純化；三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型；四、常用質(zhì)粒載體舉例；第35頁/共64頁一、質(zhì)粒的一般生物學特性（一）、質(zhì)粒DNA1、質(zhì)粒是細菌染色體外能夠自主復制的環(huán)形雙鏈的DNA分子。2、編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。R質(zhì)?？蓪⑵淇剐赞D(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的適宜的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。2、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外地游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。3、質(zhì)粒DNA不僅能在細菌中復制，并且在添加真核復制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細胞中均可復制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應用廣泛。4、環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型：共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），開環(huán)DNA（ocDNA），線性DNA（cDNA），具有不同的電泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠電泳中分開。第36頁/共64頁第37頁/共64頁（二）、質(zhì)粒的拷貝數(shù)與不親和性1、質(zhì)粒的拷貝數(shù)是指某種質(zhì)粒在一個細菌細胞內(nèi)的數(shù)目。根據(jù)每個寄主細胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴緊型復制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-5個）與松弛型復制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達10-200份拷貝）。因此，作為載體的質(zhì)粒應該是松弛型的。2、質(zhì)粒的不親和性，有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細胞的增殖構(gòu)成中，其中必然有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。15.4

Vectors第38頁/共64頁二、質(zhì)粒DNA的分離與純化15.4

Vectors第39頁/共64頁三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型（一）質(zhì)粒載體的發(fā)展概況；（二）質(zhì)粒載體的特點（基本條件）；（三）遺傳標記基因（四）質(zhì)粒載體的類型15.4

Vectors第40頁/共64頁（一）發(fā)展概況

1.

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)

2.

第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。

3.第三階段：進一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。

15.4

Vectors第41頁/共64頁（二）載體特點1、至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。2、

至少應有一個克隆位點，以供外源DNA插入。3、

至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞。4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。注：前三個特點必不可少。第42頁/共64頁（三）遺傳標記基因1、標記基因的作用

1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞這種指示可以是選擇性的（Ampr

，Tetr

，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）

2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。*這種指示也可以是選擇性的（如TcS），也可以是非選擇性的（如TcS，

lacZα），絕大多數(shù)為后者。

**有的遺傳標記基因可以完成上述兩項作用。當充任第一作用時，最好是選擇性標記基因；當完成第二作用時，目前多采用非選擇性的—檢測性標記基因。有的基因是不能用作選擇性標記基因（lacZ等）。第43頁/共64頁2、

標記基因的種類

1）抗性標記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr

，Tetr

，Cmlr，Kanr，Strr2）生化標記基因

其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ3、常用的遺傳標記基因及其作用機制

1)四環(huán)素抗性基因（Tetr

，Tcr）

Tetracycline可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs蛋白質(zhì)，與細菌細胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進入細菌細胞。

2)氨芐青霉素抗性基因（Ampr

，Apr）

Ampicillin可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質(zhì)的酶，可特異地切割氨芐青霉素的β—內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。第44頁/共64頁3)氯霉素抗性基因（Cmlr

，Cmr）

Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；瑢е乱阴；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。Kanr等抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進入細胞內(nèi)。第45頁/共64頁5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負責四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補作用。這兩個部分可獨立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZ和LacZα）均可作為標記基因。

lacZ（lacZα）中含有多克隆位點，當無外源DNA片段插入時，質(zhì)粒表達β—半乳糖苷酶的α-肽，與缺失突變體宿主菌（不能編碼α-肽）表達的lacZ基因產(chǎn)物（β鏈）互補，產(chǎn)生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示劑X-gal和誘導劑IPTG的存在下，菌落呈現(xiàn)蘭色；外源基因的插入后，破壞了lacZα-肽基因的結(jié)構(gòu)，細菌內(nèi)不能產(chǎn)生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。β—半乳糖苷酶基因的優(yōu)點:

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀

b.

lacZα編碼5‘-端可容許很大的變化（如加入多克隆位點）而不影響酶活性

c.lacZα和β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大第46頁/共64頁

PLacZαLacZβ

轉(zhuǎn)錄

翻譯

αβLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18BamHI片段重組DNA分子轉(zhuǎn)化E.coli

外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子第47頁/共64頁（四）、質(zhì)粒載體的類型1、根據(jù)載體的分子生物學特性劃分

（1）.

質(zhì)粒型載體—環(huán)狀dsDNA分子，自主復制（2）.

病毒型載體—環(huán)狀、線狀、ss-和ds-DNA分子，形成病毒顆粒（3）.混合型載體—具質(zhì)粒和病毒特性，特性的轉(zhuǎn)換依賴于宿主細胞生物學特性

15.4

Vectors第48頁/共64頁2、根據(jù)載體功能劃分

（1）.普通型載體

1)特點:至少有一個以上的克隆位點和兩個標記基因，其中一個用于轉(zhuǎn)化體選擇，另一個用于重組子檢測。

2)用途:基因組或cDNA文庫的構(gòu)建;次克隆(subcloning)或限制酶譜分析；外源DNA擴增。例子:

pBR322和pUC載體。

上述兩例中的非重組子來源有兩個：

a.

酶切反應時仍未被作用的pBR322或pUC18分子

b.酶切后的載體分子經(jīng)自我連接又形成載體分子15.4

Vectors第49頁/共64頁pUC18和pUC19載體普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖第50頁/共64頁（2）、表達型載體（expressionvector）

1)

特點:a.基因的啟動子序列和終止子序列；

b.一般無檢測標記基因；

c.

克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）；

d.重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。

2)

結(jié)構(gòu):a.轉(zhuǎn)化單元--宿主細胞轉(zhuǎn)化

b.表達單元--外源基因表達

3)類型:

Ⅰ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動子）+終止子

Ⅱ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+終止子

Ⅲ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)+信號肽鏈編碼區(qū)+終止子（常稱之為表達分泌型載體）15.4

Vectors第51頁/共64頁三種表達型載體結(jié)構(gòu)圖第52頁/共64頁15.4

VectorsPlasmidsEasytouseandstore.Recombinantplasmidsreadilyselectedwithantibiotics.LambdaphageUsefulforcloninglarge(15-20Kbfragments).CosmidsCombinedplasmid/phagevectorpermitscloningofevenlarger(e.g.45Kb)DNAfragments.YeastplasmidsPermitdirectstudiesoneukaryoticgeneregulation.PlantplasmidsBacterial(Agrobacterium)infectionofplanttransfersTiplasmidintohostplantcells.TypeofVectorAdvantage第53頁/共64頁四、常用質(zhì)粒載體舉例1、pBR322載體2、pUC載體15.4

Vectors第54頁/共64頁1、pBR322載體優(yōu)點：1、分子量較小，為4363bp，不僅利于自身DNA的純化，可容納的外源DNA也較大。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供轉(zhuǎn)化子的選擇記號。3、具有較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過氯霉素擴增后，每個細胞中可累積1000-3000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。15.4

Vectors第55頁/共6