高通量測(cè)序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用詳解

高通量測(cè)序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用詳解演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共27頁(yè)。優(yōu)選高通量測(cè)序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用當(dāng)前2頁(yè)，總共27頁(yè)。1.1什么是高通量測(cè)序技術(shù)高通量序技術(shù)（next-generationsequencing）是對(duì)傳統(tǒng)Sanger法測(cè)序的一次革命性的改變，是一次可對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定的高通量的測(cè)序技術(shù)，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序(deepsequencing)。

一.高通量測(cè)序技術(shù)當(dāng)前3頁(yè)，總共27頁(yè)。1.2為什么要發(fā)展高通量測(cè)序技術(shù)快速和準(zhǔn)確地獲取生物體的遺傳信息對(duì)于生命科學(xué)研究一直具有十分重要的意義。對(duì)于每個(gè)生物體來(lái)說(shuō)，基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。測(cè)序技術(shù)能夠真實(shí)地反映基因組DNA上的遺傳信息，進(jìn)而比較全面地揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性，因而在生命科學(xué)研究中扮演了十分重要的角色。當(dāng)前4頁(yè)，總共27頁(yè)。1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生。盡管第一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測(cè)序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測(cè)序方法。經(jīng)過(guò)不斷的開(kāi)發(fā)和測(cè)試，進(jìn)入21世紀(jì)后，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的第二代測(cè)序技術(shù)誕生了。當(dāng)前5頁(yè)，總共27頁(yè)。1.3高通量測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)速度快準(zhǔn)確度高成本低覆蓋度深產(chǎn)出巨大當(dāng)前6頁(yè)，總共27頁(yè)。二

高通量測(cè)序技術(shù)的原理高通量測(cè)序技術(shù)包括Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。下面對(duì)三種高通量測(cè)序技術(shù)的原理和特點(diǎn)分別進(jìn)行具體介紹。當(dāng)前7頁(yè)，總共27頁(yè)。454Pyrosequencing基于磁珠的焦磷酸測(cè)序：A磁珠制備設(shè)備B454測(cè)序儀C454測(cè)序原理當(dāng)前8頁(yè)，總共27頁(yè)。當(dāng)前9頁(yè)，總共27頁(yè)。當(dāng)前10頁(yè)，總共27頁(yè)。454測(cè)序流程與BaseCalling每次加入一種堿基然后再對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行讀取。堿基聚合反應(yīng)產(chǎn)生焦磷酸ppi，ppi在硫化酶催化下生成ATP，ATP在熒光酶催化下激發(fā)熒光，熒光強(qiáng)度和焦磷酸的量成正比。當(dāng)前11頁(yè)，總共27頁(yè)。454技術(shù)的主要缺點(diǎn)是無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物(homopolymer)的長(zhǎng)度。例如當(dāng)待測(cè)序列中出現(xiàn)Poly(A)的情況下，測(cè)序反應(yīng)中會(huì)一次加上多個(gè)T，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)推測(cè)，有可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是因?yàn)檫@個(gè)原因，454技術(shù)主要的錯(cuò)誤不是來(lái)自核苷酸的替換，而是來(lái)自插入或缺失。454技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于較長(zhǎng)的讀取長(zhǎng)度，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準(zhǔn)確。當(dāng)前12頁(yè)，總共27頁(yè)。IlluminaSolexa簡(jiǎn)介橋式PCR邊合成邊測(cè)序可逆終止物HiSeq2000當(dāng)前13頁(yè)，總共27頁(yè)。當(dāng)前14頁(yè)，總共27頁(yè)。當(dāng)前15頁(yè)，總共27頁(yè)。Solexa的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長(zhǎng)較短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要應(yīng)用：RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究當(dāng)前16頁(yè)，總共27頁(yè)。ABISOLiD簡(jiǎn)介SOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo連接測(cè)序：通過(guò)連接酶連接，再對(duì)oligo上熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)SOLiD5500xl當(dāng)前17頁(yè)，總共27頁(yè)。ABISOLiD測(cè)序前期制備A樣品片段化磁珠連接B乳化PCR3‘末端修飾C磁珠富集轉(zhuǎn)到測(cè)序玻片當(dāng)前18頁(yè)，總共27頁(yè)。ABISOLiD測(cè)序原理測(cè)序流程依次加入五種引物進(jìn)行五次測(cè)序。加入測(cè)序引物及加入oligo連接酶連接，激發(fā)熒光檢測(cè)，循環(huán)一個(gè)流程，換一種引物再循環(huán)一個(gè)流程，五個(gè)流程結(jié)果疊加分析出序列。當(dāng)前19頁(yè)，總共27頁(yè)。SOLiD的特點(diǎn)與主要應(yīng)用讀長(zhǎng)較短，50-75bp精度高，可達(dá)Q40通量高，20-30G每天，1Run可達(dá)120G主要應(yīng)用：基因組重測(cè)序、SNP檢測(cè)等當(dāng)前20頁(yè)，總共27頁(yè)。三種平臺(tái)的技術(shù)差異平臺(tái)454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR橋式PCR磁珠乳化PCR測(cè)序載體磁珠玻片玻片測(cè)序方式焦磷酸、熒光可逆終止物、熒光連接酶、熒光結(jié)果序列FastQFastQCSFastQ當(dāng)前21頁(yè)，總共27頁(yè)。三、高通量測(cè)序技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用目前，高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物全基因組測(cè)序、基因組重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、小RNAs測(cè)序和表觀基因組測(cè)序等方面。下面對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的一些具體應(yīng)作以介紹。當(dāng)前22頁(yè)，總共27頁(yè)。3.1全基因組重測(cè)序全基因組重測(cè)序是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。全基因組重測(cè)序的個(gè)體，通過(guò)序列比對(duì)，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)、插入缺失位點(diǎn)(InDel，Insertion/Deletion)、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)(SV，StructureVariation)，通過(guò)生物信息學(xué)手段，分析不同個(gè)體基因組間的結(jié)構(gòu)差異，同時(shí)完成注釋。

當(dāng)前23頁(yè)，總共27頁(yè)。3.1.1利用重測(cè)序進(jìn)行進(jìn)化分析及SNP篩選

Lai等(2010)對(duì)6個(gè)玉米(Zeamays)骨干自交系進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，共發(fā)現(xiàn)

1273124個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)，得到30178個(gè)1～6bp的插入缺失位點(diǎn)(InDels)，新發(fā)現(xiàn)的這些SNPs和InDels提供了1個(gè)高密度的全基因組標(biāo)記信息，同時(shí)也鑒定出數(shù)百個(gè)基因獲得與丟失變異(Presence/AbsenceVariations，PAVs)。當(dāng)前24頁(yè)，總共27頁(yè)。3.1.2利用重測(cè)序技術(shù)鑒定突變體突變基因Ashelford等(2011)對(duì)一個(gè)擬南芥突變體ebi－1的回交系進(jìn)行基因組重測(cè)序，隨后又通過(guò)對(duì)突變體的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)查使得候選SNPs數(shù)目得以有效縮小，最終成功鑒定出1個(gè)在AtNFXL－2基因中引起ebi－1突變表型的SNPs位點(diǎn)該研究證實(shí)利用回交系材料可以降低遺傳背景噪音，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析可有效減少候選SNPs數(shù)目。當(dāng)前25頁(yè)，總共27頁(yè)。3.2全基因組denovo測(cè)序

全基因組denovo測(cè)序也稱為從頭測(cè)序，是直接對(duì)某個(gè)物種進(jìn)行基因組全測(cè)序，然后利用生物信息學(xué)方法對(duì)序列進(jìn)行拼接和組裝，得到完整的物種基因組序列、基因組測(cè)序?qū)ρ芯课锓N的基因組和功能基因信息、闡明物種的進(jìn)化及其生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的意義。

Huang等(2009)完成的黃瓜(CucumissativusL.)全基因組測(cè)序是世界上第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的蔬菜作物，該工作的完成對(duì)黃瓜及其他近緣物種的遺傳、改良基礎(chǔ)生物學(xué)研究等具有重要的意義。當(dāng)前26頁(yè)，總共27頁(yè)。3.3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究

轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有R