基因工程復習知識點

質(zhì)粒名稱和大小、復制啟動子、多克隆酶切位點MCS、選擇標記基因16°C連接，37°C酶切凝膠電泳pH8.0帶負電基因工程：又稱遺傳工程，是通指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計和應用的流程。強調(diào)基因克隆、載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、性狀表達與產(chǎn)品提取及純化等全部過程?；虿僮骷夹g(shù)：利用遺傳重組技術(shù)，在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，將包含目的基因、特殊載體在內(nèi)的各種必需元件的DNA分子經(jīng)過改造和重組后，轉(zhuǎn)入另一受體生物細胞內(nèi)。基因：DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列。核酸：由許多核苷酸單位通過3，5-磷酸二酯鍵連接起來形成的不含側(cè)鏈的具有方向性的長鏈狀化合物。順反子（基因同義詞）：在反式構(gòu)型中不能互補的各個突變型在染色體上所占的一個區(qū)域稱為一個順反子。是一個必須保存完整才具有正常生理功能的遺傳物質(zhì)最小單位。突變子（muton）：突變單位，基因內(nèi)部有許多突變位點，突變后產(chǎn)生變異的最小單位。（最小的突變單位為1個堿基對bp）重組子（recon）：重組單位，基因內(nèi)部有多個重組單位，不能由重組分開的最小單位。一個基因不是一個突變單位，也不是一個重組單位。斷裂基因（splitgene）：指基因內(nèi)部被一個或更多不翻譯的編碼順序即內(nèi)含子所隔裂?；蚨伎蓜澐譃檗D(zhuǎn)錄區(qū)（轉(zhuǎn)錄起始點至轉(zhuǎn)錄終止子的區(qū)域）和調(diào)控區(qū)（位于轉(zhuǎn)錄起始點5’上游，包括核心啟動子、上游啟動元件及增強子等序列）結(jié)構(gòu)基因并非都是連續(xù)的，原核生物基因是連續(xù)的，而真核生物的基因是斷裂的內(nèi)含子（intron）：在成熟mRNA的片段中未反應出的DNA區(qū)段；外顯子（extron/exon）:DNA序列中被轉(zhuǎn)錄成為mRNA中的片段?；蛑心茏兂珊塑账嵝蛄械氖峭怙@子，內(nèi)含子不能。核小體（nucleosome）：在真核生物中，雙螺旋的DNA分子圍繞一蛋白質(zhì)八聚體進行盤繞，從而形成特殊的串珠狀結(jié)構(gòu)。核小體結(jié)構(gòu)屬于DNA的高級結(jié)構(gòu)。核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位。重疊基因（overlappinggene）：兩個或兩個以上的基因共有一段DNA序列的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座子（Transposon）：又名轉(zhuǎn)位子、跳躍基因（jumpinggene）是一類DNA序列，它們能夠在基因組中通過轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄，或在內(nèi)切酶（Nuclease）的作用下，在其他基因座上出現(xiàn)。轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)，證明了基因組并不是一個靜態(tài)的集合，而是一個不斷在改變自身構(gòu)成的動態(tài)有機體。同源重組：是指發(fā)生在DNA同源序列之間的重組。位點特異性重組：指發(fā)生在特異序列之間的重組，僅見于噬菌體的基因組整合到細菌染色體中的過程。轉(zhuǎn)座重組：是指不依賴于序列間的同源性而使一種DNA順序插入另一種DNA順序中的重組，因此轉(zhuǎn)座是一種可在染色體的不同區(qū)段或不同染色體之間廣泛發(fā)生的重組。又稱為復制重組。基因組：是指細胞內(nèi)遺傳信息的攜帶者DNA的總體。組蛋白（histones）：是指染色體中的堿性蛋白質(zhì)，其特點是富含二種堿性氨基酸（賴氨酸和精氨酸）。PCR（PolymeraseChainReaction）：聚合酶鏈式反應的簡稱。PCR技術(shù)是一種在體外高效快速擴增特定基因或DNA序列的方法。電泳：帶電顆粒在電場作用下向著與其電荷相反的電極移動的過程。載樣緩沖液（loadingbuffer）：待電泳的樣品在點樣前與之相混合的一種緩沖液。載體（vector）：能攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具，且有完整的復制（及轉(zhuǎn)錄）功能的DNA大分子?？寺≥d體（cloningvector）：主要是對目的基因克隆，有復制子即可表達載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細胞中表達的一類載體，既有復制子，更要有強啟動子穿梭載體（shuttlevector）：既可在原核細胞中復制，也可在真核細胞中擴增和表達質(zhì)粒（plasmid）：存在于微生物染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，基因工程技術(shù)中應用最廣泛、功能最強大、最易操作的載體。不相容性：同一細胞內(nèi)不能同時存在兩種質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）：由人工構(gòu)建的具有兩種不同復制起點和選擇標記，因而可在兩種不同的寄主細胞存活和復制的質(zhì)粒載體Ampr（氨芐青霉素抗性）Tetr（四環(huán)素抗性）MCS：載體上供外源基因插入的、具有多個RE單一酶切位點的片段，一般為人工拼接而成回文結(jié)構(gòu)（palindrom）：以切割序列正中作為軸心，反轉(zhuǎn)對稱；同一單鏈以中心軸對折可形成互補雙鏈。平末端：在識別序列的對稱軸上進行切割；粘（黏）性末端：在識別序列的兩個對稱點切割，產(chǎn)生末端帶有單鏈尾巴的切口；同裂酶：不同的RE有相同的識別特點，但切割位點不一定相同;同尾酶：不同RE識別不同序列,但切割后能產(chǎn)生相同的粘性末端，可以連接起來;酶單位（U）：在最適反應條件下1小時完全消化lμg標準DNA所需的酶量為1個單位星活力：RE在酶切反應條件改變后識別特異序列的特性降低的一種現(xiàn)象DNA連接酶（DNAligase）：催化雙鏈DNA中相鄰堿基的5’磷酸和3’羥基間磷酸二酯鍵形成的酶DNA聚合酶：催化dNTP聚合成DNA的酶，主要用于DNA的體外合成、探針標記等基因重組：DNA分子間（目的基因和載體）發(fā)生共價連接形成重組DNA分子的過程。轉(zhuǎn)化：是指感受態(tài)的宿主細胞捕獲（重組）DNA分子的過程感受態(tài)細胞（competentcells）：處于能攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細胞絕大多數(shù)原核生物的DNA都是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋。根據(jù)重復程度，可以將DNA重復序列分為三種類型：單一或輕度重復序列、中等重復序列、高度重復序列。組成染色體的化學成分：DNA、蛋白質(zhì)，RNA。蛋白質(zhì)含量約為DNA的二倍，RNA含量很少,還不到DNA量的10%。組成染色體的蛋白質(zhì)分為組蛋白和非組蛋白。染色體外DNA：線粒體DNA、葉綠體DNA、質(zhì)粒DNACTAB（溴化十六烷三甲基銨），可與多糖、變性蛋白質(zhì)等結(jié)合，提取核酸時除去多糖、脂類等雜質(zhì)pUC18，拷貝數(shù)可達500-700個；攜帶抗氨芐青霉素基因，轉(zhuǎn)化細菌后含pUC18能生長；還攜帶細菌lacI和lacZ基因編碼，使菌落呈現(xiàn)藍色；如果在lacz‘中間插入外源DNA，破壞半乳糖苷酶活性，生長的菌落就呈白色，作為選擇重組子的標記。聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高于瓊脂糖凝膠電泳載體按功能分為克隆載體、表達載體、穿梭載體；按來源分為質(zhì)粒載體、噬菌體載體、柯斯質(zhì)粒載體、真核細胞克隆載體；按受體細胞分為原核生物載體、真核生物載體、植物基因工程載體、動物基因工程載體具有三種不同的構(gòu)型：SC型（共價閉合環(huán)形DNA）、OC型（開環(huán)DNA）、L型（線性DNA）β-半乳糖酶可分解無色的化合物X-gal產(chǎn)生不溶性的藍色分解物，MCS在無外源基因插入時不影響lacZ基因表達；插入了外源基因的MCS影響lacZ基因表達，無β-半乳糖酶產(chǎn)生。因此在含X-gal的瓊脂平板上，含非重組質(zhì)粒的菌菌落是藍色的、重組菌菌落是白色的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的應用價值最大。Ⅱ型酶只具限制活性，無甲基化修飾活性；對DNA的切割要求嚴格的序列作為靶位點，切割精確；此類酶作用時只需要Mg2+參與，無需ATPDNA連接酶主要類型有T4噬菌體DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶基因工程（Geneengineering）遺傳工程（Geneticengineering）轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenetechnology）基因操作技術(shù)（Geneopertation/Genemanipulation）分子克?。∕olecularcloning）基因克?。℅enecloning）基因重組（Generecombination）突變子（muton）重組子（recon）斷裂基因（splitgene）內(nèi)含子（intron）外顯子（extron/exon）核小體（nucleosome）重疊基因（overlappinggene）轉(zhuǎn)座子（Transposon）內(nèi)切酶（Nuclease）同源重組（homologousrecombination）位點特異性重組（site-specificrecombination）PCR（PolymeraseChainReaction）Taq-DNA聚合酶（Thermusaquaticus)多克隆位點（Multiplecloningsites，簡稱MCS）分離純化核酸的原則和要求：①應保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。核酸制備時的注意事項：①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。②盡量減少化學（化學試劑等）、物理（機械剪切力、高溫等）和生物（核酸酶等）因素對核酸的影響。如果提取的是DNA，則需要抑制DNase活力，同時還要防止機械張力拉斷。金屬離子螯合劑（如EDTA或檸檬酸鈉）、去垢劑（如SDS）、蛋白變性劑（如苯酚、氯仿）都也可使DNase失活核酸制備中常用酶DNase：降解DNARNase：降解RNA蛋白酶K：去除蛋白質(zhì)溶菌酶：溶解細胞壁（尤其是革蘭氏陽性菌）核酸的保存保存溫度：-70℃長期保存的良好溫度-20℃也可較長時間保存4℃短期保存保存介質(zhì)：TE緩沖溶液----最常用，首選；水--短期保存可用質(zhì)粒DNA提取溶液Ⅰ組成：葡萄糖、EDTA、溶菌酶葡萄糖：增加溶液黏度，防止菌體沉淀和DNA機械損傷EDTA：抑制DNAase，有利于溶菌酶作用溶菌酶：水解細胞壁（尤其是G+菌）溶液Ⅱ組成：NaOH、SDSNaOH：溶解細胞、核酸在pH＞12或＜3時會因H鍵解離而變性，0.2mol/LNaOH會使溶液pH至12.6SDS：溶解膜蛋白破壞細胞膜、使蛋白質(zhì)變性沉淀溶液Ⅲ組成：KAc（pH4.8）使溶液pH回至中性，質(zhì)粒DNA復性高濃度K鹽的存在，置換了SDS上的Na鹽而形成PDS，有利于大分子染色體DNA、RNA以及蛋白質(zhì)凝聚而沉淀。溶液I要加RNAase（如果提取的是RNA，則應該加DNAase），葡萄糖讓DNA重懸（可加溶菌酶，蛋白EK，破壁）溶液II：堿變性，讓細胞裂解，讓蛋白質(zhì)，基因組DNA變性溶液III：酸復性，醋酸鉀，蛋白質(zhì)，基因組DNA復性不了，只有質(zhì)粒DNA復性可能問題及解決辦法1、DNA樣品不純混有多糖、蛋白等——重新純化DNA有金屬離子殘留——增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA溶解前有乙醇殘留——重新沉淀DNA，讓乙醇充分揮發(fā)DNA降解材料不新鮮或反復凍融——新鮮避免反復凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性——可增加裂解液中螯合劑的含量操作過于劇烈，DNA被機械打斷——細胞裂解后的操作應盡量輕柔外源核酸酶污染——所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌反復凍融——將DNA分裝保存于緩沖液中DNA提取量少實驗材料不佳或量少——盡量選材新鮮破壁或裂解不充分——延長處理時間和強度沉淀不完全——低溫沉淀、延長沉淀時間、加輔助物促進沉淀洗滌時DNA丟失——洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒PCR的反應體系標準的PCR反應體系組成4種dNTP混合物各200mol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2gTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L實操的PCR反應體系組成反應體系（50l）：（注意順序）無菌雙蒸水（待定）l5.5引物（10M）1l+1l模板DNA﹤1g（待定，參考量0.5g左右）52PCRMasterMix12.5l總體積25lPCR編程預變性94℃，4min--------------3min變性94℃，45sec-------------45s退火55℃，50sec-------------45s延伸72℃，1min--------------1min重復2-4步驟，30次循環(huán)最后延伸72℃，8min--------------5min保溫4℃-20。C保存?zhèn)溆糜绊慞CR的因素（一）PCR體系各成分的影響：1、模板：模板是待擴增的核酸；單、雙鏈DNA均可；不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類；一般100ngDNA模板/100L；模板濃度過高會導致反應的非特異性增加2、引物濃度：引物是與靶DNA特異性結(jié)合的寡核苷酸片段引物濃度一般為0.1-0.5mol/L濃度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。3、Taq-DNA聚合酶（Thermusaquaticus)：0.5-2.5U/50l多則反應特異性下降，少則影響產(chǎn)量4、dNTP：dNTP濃度取決于擴增片段的長度，一般為20-200mol/L；四種dNTP濃度應相等；濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。5、Mg2+：Mg2+濃度對TaqDNA聚合酶的影響很大；一般濃度范圍為0.5-2mmol/L；濃度過低會使Taq酶活性喪失、產(chǎn)量下降；濃度過高影響反應特異性；Mg2+可與負離子結(jié)合，所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。6、緩沖液：維持PCR反應體系的pH;一般含有10-50mMTris-HCl(pH8.3-8.8)、50mMKCl和適量濃度的Mg2+；可增加產(chǎn)量、利于退火，但鹽濃度過高會抑制TaqDNA聚合酶的活性。7、其他因素：在反應體系中加入一定濃度的添加劑如甘油、二甲基亞砜、液體石蠟等，可提高擴增效率與特異性。（二）反應參數(shù)的影響：1、變性：使雙鏈DNA解鏈為單鏈；變性溫度取決于DNA模板的GC含量，≤55%的一般為94-95℃，45秒，＞55%需要更高變性溫度；在循環(huán)開始前會在94℃，預變性3-10min使模板DNA完全解鏈；循環(huán)程度中變性一般為94℃，30-60秒。2、退火：使變性模板DNA與引物復性；退火溫度高低與時間的長短取決于引物的長度和GC含量；一般為37-55℃，1-2min，具體的退火溫度可通過設(shè)計序列實驗來摸索（如利用梯度PCR來設(shè)計一系列退火溫度）。3、延伸：即寡核苷酸引物的延長；在TaqDNA聚合酶的最適反應溫度下進行；一般為70-72℃，30-60sec;具體延伸時間取決于擴增片段長度，如：＜500bp，20sec500-1200bp,40sec4、循環(huán)次數(shù)：主要取決于模板DNA的濃度；一般為25-35次，通常取30次；次數(shù)過多擴增效率降低、錯誤摻入率增加。影響電泳分離的因素生物分子本身的性質(zhì)：帶電荷越多、分子越小、形狀越接近球形，電泳遷移速度越快電場強度：電場強度越大，電泳速度越快支持介質(zhì)：篩孔大小、帶電性質(zhì)緩沖液：pH、黏度瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理DNA分子在堿性環(huán)境中（pH8.0-8.3）帶負電荷（磷酸基團），外加電場作用下向正極泳動，不同的DNA分子，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。影響因素DNA分子大?。悍肿恿吭酱?，遷移速度越慢DNA的分子構(gòu)型：超螺旋>線性>開環(huán)閉合環(huán)狀所加電壓：3-5V/cm電場方向：如脈沖電泳核酸染料：常用染料溴化乙錠（EB），嵌入堿基對中，可降低DNA的遷移率電泳緩沖液：常用緩沖液TAE、TBE、TPE電泳緩沖液：在電泳過程中維持合適的pH；使溶液具有一定的導電性，以利于DNA分子的遷移。TAE：緩沖容量最低，不宜長時間使用；對高分子質(zhì)量的DNA分辨率略高；對超螺旋DNA分辨率略高；線狀dsDNA片段在TAE中比在另兩者中遷移速率快10%；適用于回收DNA片段的電泳。TBE：緩沖容量高，但成本也略高；對小分子量DNA（＜1kb）分辨率略高；不宜用于回收DNA片段的電泳。TPE：緩沖容量高，但成本也略高；不宜用于回收DNA片段的電泳。電泳操作步驟制膠--放入緩沖液--點樣--電泳--觀察結(jié)果（一）制膠稱一定量的瓊脂糖，加入電泳緩沖液，加熱溶解；準備制膠模具，加梳子；倒膠，膠厚一般為0.3-0.5cm；冷卻凝固，取出梳子，凝膠置于電泳槽中；加入電泳緩沖液，液面高于膠面1mm注意事項：控制好瓊脂糖加熱溶解時間控制好倒膠時的溫度控制好膠的厚度控制好梳子高度、寬度注意電泳儀器及緩沖液的使用太短，不溶解；太長，水分蒸發(fā)多；低于45℃，凝固；高于60℃，使制板變形；太薄，上樣量小，易裂；太厚，不易取出梳子，浪費；梳齒與膠板之間有一定空隙；根據(jù)上樣量選擇梳子寬度。配膠與電泳槽中緩沖液最好同批次；電泳槽中緩沖液使用次數(shù)不宜太多。（二）點樣DNA樣品與載樣緩沖液混勻；吸取混合液，加入樣品孔中。載樣緩沖液：待電泳的樣品在點樣前與之相混合的一種緩沖液。作用：增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)使樣品帶有顏色易于點樣其中的染料在電場中以可預測的泳動速率向陽極遷移，可參考來判斷DNA的電泳情況注意事項：控制好樣品與載樣緩沖液比例：參考說明書，一般為5μLDNA+1μLloadingbuffer；控制好上樣量：控制好槍頭的深度：按照載樣緩沖液說明書，按比例混勻樣品與載樣緩沖液體，樣品量不能大于上樣孔容積，否則樣品溢出，交叉污染。一般樣品投入量達50～100ng/帶即可觀察到清晰結(jié)果，而對于珍貴DNA樣品則上樣量達電泳的最低分辨率5～10ng/帶也可。而對于一定量的DNA，當電泳時采用較薄的梳子制膠，則電泳時DNA條帶相對較窄，觀察較清晰；而隨著電泳時間的延長，由于DNA分子本身有一定的擴散，電泳條帶也會變淺；太淺，樣品不易進入孔內(nèi)；太深，容易損壞樣品孔。（三）電泳設(shè)置好電壓，接通電源；根據(jù)指示劑遷移位置，判斷是否終止電泳；切斷電源，取出凝膠，觀察結(jié)果。注意事項：電極要正確連接，點樣孔在負極；電壓一般采用1-5v/cm（兩極間距離），大片段DNA可略低，防止拖尾；小分DNA可略高些，縮短電泳時間；控制好電壓：電壓高，時間短，條帶不整齊不清晰；電壓低，時間長，條帶相對清晰整齊；控制好電泳槽內(nèi)緩沖液的量（沒過膠1mm）：太多，電流加大，凝膠發(fā)熱；（四）檢測觀察切斷電壓，取出凝膠；觀察結(jié)果、拍照、記錄。目前通用方法，用核酸染料對核酸進行染色，通過紫外光進行直接（肉眼）或間接（凝膠成像儀）觀察，或利用相應檢測設(shè)備捕捉熒光信號，進行數(shù)據(jù)處理（熒光定量PCR儀）核酸染料溴化乙錠（EtBr,EB）:成本較低，致癌劑GoldView?:成本較低，毒性有爭論SYBRGreenI：昂貴，據(jù)說是目前毒性最低的染色劑的使用方法染膠法：制膠時添加，靈敏度最高染樣品法：與核酸樣品混合點樣，靈敏度最低后染法：電泳完畢后將膠放入染色液中染色一段時間，緩沖液沖洗，靈敏度較高常見問題及解決方法（一）DNA條帶模糊：DNA降解：避免核酸酶污染電泳緩沖液陳舊：經(jīng)常更換電泳條件不當：電壓不應超過20V/cm，溫度＜30℃；DNA上樣量過多：減少凝膠中DNA上樣量DNA變性：電泳前勿加熱（二）DNA條帶弱或無DNA帶：DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量DNA降解：避免DNA的核酸酶污染DNA跑出凝膠：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度；檢測時光源不合適：如EB染色的DNA，應用短波長（254nm）的紫外光源檢測（三）DNA帶缺失：小的DNA帶跑出凝膠：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度分子大小相近的DNA帶混在一起，沒有分離開：增加電泳時間，核準正確的凝膠濃度DNA變性：電泳前請勿高溫加熱DNA鏈DNA鏈巨大，不適于常規(guī)電泳：脈沖電泳載體的基本條件：具自主復制能力；如質(zhì)粒具有復制起始點ori具有供外源DNA插入的單一RE酶切位點；如：MCS具有合適的選擇標記基因，篩選重組；抗藥基因如：氨芐青霉素抗性某些表達載體還具有外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達能力（除復制子外還有啟動子）較小的分子量，可容納較大的外源DNA片段，又可在受體細胞內(nèi)擴增較多的拷貝數(shù)在細胞內(nèi)穩(wěn)定性高，可以使重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失表達載體與克隆載體相比還需具備的條件一個強啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列;有SD序列（mRNA上與核糖體結(jié)合的部位）且該序列與起始密碼于ATG之間要有合適的距離（約10bp左右）在克隆基因與啟動子之間有正確的閱讀框架（方向、核苷酸數(shù)量）外源基因下游有轉(zhuǎn)錄終止子噬菌體作載體的原因：高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增可克隆大分子DNA酶切操作過程：根據(jù)RE說明書，建立酶切反應體系加樣：依次加入水、緩沖液、DNA、酶混勻一定溫度下保溫一定時間終止反應電泳檢測酶切結(jié)果影響限制性酶切反應的因素DNA樣品純度及分子結(jié)構(gòu)DNA提取過程殘留的污染物如：蛋白質(zhì)、乙醇、EDTA、SDS以及高濃度的鹽等會抑制酶的活性：解決辦法：加大酶的用量、加大反應總體積、延長反應時間DNA分子的構(gòu)型對酶活影響也很大：線性DNA分子比超螺旋質(zhì)粒DNA更易切割PCR產(chǎn)物往往要加保護堿基才可正常切割DNA甲基化程度從普通大腸桿菌分離出來的質(zhì)粒DNA，由于甲基化，難酶切酶切反應溫度大多數(shù)RE的最佳反應溫度是37°C實際操作中常采用水浴鍋，但由于離心管底部與頂部溫度不同，反應體系會蒸發(fā)，引起酶反應條件改變，可能會造成酶產(chǎn)生星活力；酶反應時間較短（2h左右)時可在水浴鍋內(nèi)進行，如時間較長，最好在培養(yǎng)箱內(nèi)進行反應緩沖液每一種RE都具有相應的反應緩沖液；反應緩沖液可能相同也可能不同（鹽濃度、緩沖液成分不同）；同一公司RE的相同的緩沖液一般可以通用，不同公司的一般不能；若不同RE使用相同緩沖液，可在同一酶切體系中同時進行雙酶切；反之，則只能在第一個RE酶切完成后，進行酚抽提、乙醇沉淀，再進行另一個RE的酶切操作注意事項新購回的RE應該分裝成小份，于-20℃保存，避免反復凍融由于操作中DNA樣品與RE的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性要注意酶切時加樣的次序：水、緩沖液、DNA，最后才加酶液取用RE時要將其放在冰浴內(nèi)，防止失活注意要更換槍頭，防止RE污染酶切反應中所使用的槍頭、離心管等都要是潔凈無菌的，使用時用鑷子夾取，不直接用手去拿，嚴防手上雜酶污染；當樣品在保溫反應時，蓋子要蓋緊，防止水汽進入，增加反應體積，還要防止標簽脫落；樣品酶切期間或完畢后取樣電泳前要離心2秒鐘（保溫時樣品會有水汽冷凝至管蓋及管壁上）。影響連接反應的因素（1）連接酶用量：平末端連接：1-2個單位黏性末端連接：0.1個單位（2）反應溫度：連接酶最適反應溫度為37℃該溫度會致黏性末端間堿基配對不穩(wěn)定；常用連接溫度在：15-26℃（3）載體DNA和目的DNA之間比例一般為1：3（4）DNA末端特性：黏性未端連接效率高于平末端連接平末端可采用加大酶、底物濃度，延長連接時間等方式重組DNA技術(shù)步驟目的基因的獲取----載體的選擇和構(gòu)建----外源基因與載體的連接---DNA導入受體菌----重組體的篩選----克隆基因的表達基因轉(zhuǎn)移（重組DNA導入宿主菌）（1）物理方法裸DNA直接注射（基因槍）微粒轟擊電穿孔：利用脈沖電場提高細胞膜的通透性使細胞膜上形成納米大小的微孔，可將DNA轉(zhuǎn)移到細胞中。該方法簡便、轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定、可廣泛運用于細胞的基因轉(zhuǎn)移顯微注射：在顯微鏡下，將DNA由細胞玻璃針直接注入細胞，可以將DNA直接注入核內(nèi)，有助于基因的整合與表達。適用于細胞的基因轉(zhuǎn)移（2）化學方法鈣鹽轉(zhuǎn)化法：氯化鈣轉(zhuǎn)化法（原核表達體系采用）冰凍！磷酸鈣共沉淀法（真核表達體系采用）生物方法Ti質(zhì)粒--土壤根瘤菌Ri質(zhì)粒--發(fā)根土壤根菌逆轉(zhuǎn)錄病毒(Rv)載體腺病毒(Ad)載體腺相關(guān)病毒(AAv)載體單純皰疹病毒(HSv)載體嵌合病毒載體操作步驟（一）感受態(tài)細胞的制備受體菌的培養(yǎng)取適量4℃離心10分鐘棄上清,用冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重懸菌體，冰浴后4℃離心棄上清,加冷CaCl2二次重懸,冰浴,即為感受態(tài)細胞懸液，貯存于-70℃可保存半年。（二）轉(zhuǎn)化取感受態(tài)細胞懸液置冰上，加入DNA搖勻,冰上置30分鐘，42℃水浴中熱擊2min，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘加入預熱液體培養(yǎng)基,混勻，37℃振蕩培養(yǎng)1小時左右，取適量涂布于含選擇性抗生素的篩選平板適溫培養(yǎng)對照：取未轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞分別涂布篩選平板（含篩選抗生素）和空白平板注意事項：（1）用于制備感受態(tài)的細胞要保證：較好的生長狀態(tài)：如：不要多次轉(zhuǎn)接、用－70℃或-20℃甘油保存的菌種而不是４℃的培養(yǎng)菌適宜密度，過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率：細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制（2）用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒要求：質(zhì)量：主要是超螺旋DNA濃度，與轉(zhuǎn)化效率在一定范圍內(nèi)成正比：濃度過高或過低均會降低轉(zhuǎn)化效率，一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％。（3）試劑的質(zhì)量:所用的試劑均需是最高純度，用超純水配制,分裝保存于干燥的冷暗處。（4）防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行,所用器皿是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,且注意防止污染,否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入,為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化常見問題問題一：轉(zhuǎn)化后無克隆產(chǎn)生原因：感受態(tài)細胞低效抗生素使用錯誤轉(zhuǎn)化后立即涂板忘記溫浴對策：使用高效率的感受態(tài)細胞（106以上）復查質(zhì)?？剐?，使用正確的抗生素轉(zhuǎn)化后溫浴45min左右讓抗性基因得以表達問題二：實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性原因：未加誘導劑、顯色劑或其失效抗生素失活，敏感菌亦能生長用于制備感受態(tài)的菌株退化對策：檢查平板是否含有誘導劑顯色劑以及是否新鮮,否則重新制備新鮮平板復查抗生素的抗性用于制備感受態(tài)的菌株，傳代次數(shù)不能太多（20代以內(nèi)為佳）重組子的篩選和鑒定根據(jù)載體遺傳標記檢測抗藥性篩選法：四環(huán)素、氨卞青霉素篩選pBR322質(zhì)粒營養(yǎng)缺陷型篩選法：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子顯色篩選法：藍白斑篩選pUC質(zhì)粒根據(jù)克隆DNA序列檢測限制性酶切圖譜法：如：質(zhì)粒3593bp；目的片段830bp；則：重組質(zhì)粒4.4kb；PCR檢測：以重組質(zhì)粒為模板PCR可得到830bp的條帶核酸分子雜交：應用放射性標記的特定的DNA或RNA作探針（已知序列），與待測的核酸序列進行雜交探針只能與互補的特異核酸特異結(jié)合，通過檢測放射性雜交信號來定位待測序列。DNA測序：最可靠的檢測方法；測序服務(wù)已商業(yè)化，可很方便地進行。根據(jù)外源基因表達產(chǎn)物檢測蛋白質(zhì)生物功能檢測：如：納豆激酶具有溶纖活性，在纖維蛋白平板上會出現(xiàn)溶纖圈。免疫檢測：利用外源基因表達蛋白相應的抗體來檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳：如：外源表達蛋白分子量約為27kd目的基因的擴增和表達目的基因的擴增：通過重組菌的增殖即可達到目的基因的表達：表達體系的選擇表達載體構(gòu)建重組菌的培養(yǎng)和發(fā)酵表達產(chǎn)物的分離純化原核表達體系（大腸桿菌、枯草桿菌、農(nóng)桿菌）優(yōu)點：成熟的克隆及表達體系繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制易于進行遺傳操作和高效表達不足：不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體很難表達大量可溶性蛋白真核表達體系（酵母、昆蟲、哺乳動物細胞）優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟一、不同生物種類基因組的結(jié)構(gòu)特點1、病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點（1）病毒基因組大小相差較大（2）病毒基因組可以由DNA組成，也可以由RNA組成，組成病毒基因組的DNA和RNA可以是單鏈的，也可以是雙鏈的，可以是閉環(huán)分子，也可以是線性分子。（3）多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的核糖核酸鏈組成，但也有些病毒的基因組RNA由不連續(xù)的幾條核酸鏈組成。（4）基因重疊（5）病毒基因組的大部分是用來編碼蛋白質(zhì)。（6）病毒基因組DNA序列中功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個或幾個特定的部位，形成一個功能單位或轉(zhuǎn)錄單元。（7）除了反轉(zhuǎn)錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次。（8）噬菌體（細菌病毒）的基因是連續(xù)的2、細菌染色體基因組結(jié)構(gòu)的一般特點（1）細菌的染色體基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成細菌的染色體相對聚集在一起，形成一個較為致密的區(qū)域，稱為類核（nucleoid）。（2）具有操縱子結(jié)構(gòu)（3）在大多數(shù)情況下，結(jié)構(gòu)基因在細菌染色體基因組中都是單拷貝。（4）不編碼的DNA部分所占比例