微生物學實驗課件

微生物學實驗蘭州理工大學生命科學與食品工程實驗教學顯微鏡概述微生物的個體微小，必須借助顯微鏡才能觀察到。因此，顯微鏡就成為微生物學研究工作者不可缺少的根本工具。所以，了解顯微鏡的種類、結構、功能和正確地掌握不同顯微鏡的使用方法是很有必要的。顯微鏡可分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。光學顯微鏡有普通光學顯微鏡、相差顯微鏡、微分干預差顯微鏡、暗視野顯微鏡、紫外光顯微鏡、偏光顯微鏡和熒光顯微鏡。下面主要介紹普通光學顯微鏡。實驗一細菌形態(tài)結構觀察和光學顯微鏡的使用一、目的要求1.學習顯微鏡的結構、功能和使用方法。2.學習并掌握油鏡的原理和使用方法。根底知識

尼康E-600顯微鏡

二、顯微鏡的根本結構及油鏡的工作原理普通生物顯微鏡由3局部構成：①照明系統：包括光源和聚光器。②光學放大系統：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體。③機械裝置：用于固定材料和觀察方便，包括鏡臺(載物臺)、調節(jié)器和、物鏡轉換器(旋轉器)。與其他物鏡不同，油鏡需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，原因有二：1.增加照明亮度油鏡的放大倍數可達100x，教具很短，直徑很小，但所需要的光照強度卻最大。為了不使通過的光線有所損失，必須造又精于參加與玻璃的折射率〔n=1.55〕相仿的鏡油。通常用香柏油〔n=1.52〕.2.增加顯微鏡的分辨率油鏡的分辨率可到達0.2μm左右。2.熒光顯微鏡

尼康E800熒光DIC顯微鏡

熒光顯微鏡照片〔微管呈綠色、微絲紅色、核藍色〕3.激光共聚焦掃描顯微鏡

LCSM照片藍色為細胞核，綠色為微管

4.暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡〔darkfieldmicroscope〕的聚光鏡中央有當光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。

一種介殼蟲的染色體

5.相差顯微鏡6.偏光顯微鏡偏光顯微鏡〔polarizingmicroscope〕用于檢測具有雙折射性的物質，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。7.微分干預差顯微鏡DIC顯微鏡其優(yōu)點是能顯示結構的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標本可略厚一點，折射率差異更大，故影像的立體感更強。DIC顯微鏡下的硅藻〔偽彩色〕8.倒置顯微鏡

9.透射電子顯微鏡

JEM-1011透射電子顯微鏡

萊卡超薄切片機

內質網透射電鏡圖〔偽彩色〕冰凍蝕刻電鏡照片

10.掃描電子顯微鏡

JEOL掃描電子顯微鏡人類血細胞SEM照片

11.顯微操作技術

尼康NT-88NE顯微操作/注射儀

顯微鏡的分辨率:也稱為分辨力，它是指能把兩個物點辨清的最小距離，分辨距離越大，那么分辨率越低。所以，分辨率是以分辨距離來表示的。其計算公式為:D=0.61入/N·AN·A·=n·sina/2式中D為分辨率，A為光波波長，N·A·為物鏡的數值孔徑(鏡口率)。在物鏡上，有鏡口率(N.A.)的標志，它反響該鏡頭分辨力的大小，其數字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：物鏡鏡口率(N.A.)工作距離(mm)10×0.255.4040×0.650.39100×1.300.11顯微鏡的總放大倍數等于目鏡和物鏡放大倍數的乘積，公式為:M=K1xK2

焦點深度:顯微鏡調焦到看清標本某一點時，不僅是這一物點，而且它的上下兩側也能看清楚兩側的厚度叫做焦點深度?？吹綐吮镜娜穸?，必須調節(jié)螺旋仔細地從上到下進行觀察。厚標本和薄標本4-5um2um根底知識三、實驗步驟(一)顯微鏡的使用1.觀察前的準備工作

(1)觀察者要養(yǎng)成顯微鏡鏡檢的工作習慣，觀察時要雙眼同時睜開，一邊觀察一邊進行記錄或描繪。

(2)觀察時所用的材料、藥品和各種器具要預先準備好。

(3)顯微鏡在使用之前應檢查一下它的各個部件是否完整和正常，并對載物臺、目鏡、物鏡以及聚光器上端透鏡進行必要的清潔工作。然后進行合軸調節(jié)。瞳距調節(jié)2.顯微鏡的調節(jié)屈光度調節(jié)調節(jié)粗調松緊調節(jié)旋鈕聚光鏡中心調節(jié)⑤光軸中心調節(jié)螺釘③視場光欄③孔徑光欄②10X物鏡①標本④聚光鏡升降旋鈕孔徑光欄調節(jié)N.A聚=(0.6-0.8)N.A物孔徑光欄開度與圖象100%70%30%孔徑光欄的運用操作步驟如下:(1〕可變光欄的中心對準聚光鏡的中心。如果可變光欄的水平是固定的，那么裝配時已保證它與聚光鏡合軸，不必調整;如果可變光欄的水平位置可以移動，那么應把可變光欄關到最小，使它的中心孔對準聚光鏡下方的透鏡中心。(2)載物臺上放置觀察標本，把聚光器上升到它上端透鏡平面稍低于載物臺平面的高度，并將它的可變光欄開到最大，用低倍物鏡，進行調焦到能看見標本，可調反射鏡使視野得到最亮和最均勻的照明，或把光欄關小，最亮的照明區(qū)正處在視野的中央。(3)轉到高倍鏡，并調焦到看清標本，然后去掉標本，拔出目鏡，眼睛直接向鏡筒觀察，并把可變光欄關小，看其亮點是否在視野中心，如果不是，就要轉動聚光器的調節(jié)螺旋，把亮點調到視野中央，再慢慢開啟可變光欄，使視野看到光欄邊緣和聚光鏡的邊緣相接為止。3.觀察操作(1)低、高倍鏡的使用:先把低倍的物鏡用粗調焦螺旋下降至離蓋玻片0.5cm處，然后一邊觀察視野一邊上升物鏡，直至看到圖像，再將標本移到視野中心，用細調焦螺旋把物鏡調至最清晰處，假設要用高倍鏡觀察時，把所要進一步放大觀察的部位移至視野中央，直接順時針轉換成高倍物鏡，然后用細調焦螺旋調焦，至看清物像。

四、本卷須知1.低、高倍鏡的使用。2.合軸調節(jié)。五、實驗結果1.熟練顯微鏡的調節(jié)。

六、思考題1.使用油鏡時，為使么選用香柏油或液體石蠟作為物鏡與玻片間的介質？其他液體行嗎？2.油鏡用畢后，為什么必須把鏡油擦凈？用過多的二甲苯或用酒精擦鏡有什么危害？3.什么是物鏡的同焦現象？他在顯微鏡觀察中有什么意義？4.觀察時為什么要用左眼，并且兩眼都應睜開？實驗二細菌形態(tài)構造的染色觀察一、實驗目的

1、掌握革蘭氏染色、芽孢染色的原理及方法；

2、初步認識細菌的形態(tài)構造；

3、進一步熟練顯微鏡的使用方法。

二、材料與儀器1、菌種：大腸桿菌約1d、枯草芽孢桿菌2d、枯草芽孢桿菌12-20h的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物；2、染色液：革蘭氏染色液、5%孔雀綠溶液、0.5%番紅水溶液；3、儀器：顯微鏡、載玻片、酒精燈等。三、實驗原理〔革氏染色法〕1、革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的重要鑒別染色法，通過此法染色，可將細菌鑒別為革蘭氏陽性菌〔G+)和革蘭氏陰性菌〔G-〕兩大類。2、制片〔涂片，枯燥，固定〕→初染〔結晶紫、水洗〕→媒染〔加碘液覆蓋涂面〕→脫色〔95%酒精、水洗，〕→復染〔蕃紅復染、水洗〕→枯燥→鏡檢革蘭氏染色與細胞壁：肽聚糖外膜外膜蛋白周質空間1、革蘭氏染色1、用堿性染料結晶紫對菌液涂片進行初染2、用碘溶液進行媒染，其作用是提高染料和細胞間的相互作用從而使二者結合得更牢固。3、用乙醇或丙酮沖洗進行脫色。在經歷脫色后仍將結晶紫保存在細胞內的為革蘭氏陽性細菌，而革蘭氏陰性細菌的結晶紫被洗掉，細胞呈無色。4、用一種與結晶紫具有不同顏色的堿性染料對涂片進行復染。例如番紅，它使原來無色的革蘭氏陰性細菌最后呈現桃紅到紅色，而革蘭氏陽性細菌繼續(xù)保持深紫色四、實驗步驟革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌革蘭氏陽性菌2、芽孢染色原理：細菌的芽孢壁致密，透性低，著色和脫色都比營養(yǎng)細胞困難。因此，一般采用堿性染料并在微火上加熱，或延長染色時間，使菌體和芽抱都同時染上色后，再用蒸餾水沖洗，脫去菌體的顏色，但仍保存芽飽的顏色。并用另一種比照鮮明的染料使菌體著色，如此可以在顯微鏡下明顯區(qū)分芽飽和營養(yǎng)體的形態(tài)。

步驟：1、制片:按常規(guī)制片、枯燥、固定。2、染色：加數滴孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片一端，微火加熱至冒蒸汽時，保持5min。切勿讓涂片枯槁。3、水洗至流出的水無色為止。4、復染：用番紅染液復染2min。5、水洗：用緩流水洗后，吸干。6、鏡檢：干后油鏡觀察。芽孢為綠色，芽孢囊及營養(yǎng)體為紅色。枯草芽孢桿菌的染色涂片芽孢芽孢囊五、本卷須知1、注意涂片不宜過厚；2、火焰固定溫度要適宜；3、注意控制好脫色程度。六、思考題1、造成革蘭氏染色結果不正確〔假陰性或假陽性〕的主要原因有哪些？2、在鏡檢時，如圖片中的細菌呈紅色，能否斷定該細菌就是革蘭氏陰性菌？3、用簡單染色法是否能觀察到細菌的芽孢？為什么？4、假設涂片中觀察到的只是大量游離芽孢，很少看到芽孢囊及營養(yǎng)細胞，什么原因？

實驗三酵母菌的形態(tài)觀察一、教學要求學習并掌握形態(tài)觀察及死活細胞的鑒別方法。二、實驗原理酵母菌是不運動的單細胞真核微生物，其大小通常比細菌大幾十倍甚至十幾倍。大多數以出芽方式進行無性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過接合產生子囊孢子。本實驗是通過美藍染液水浸片和水—碘液水浸片來觀察酵母的形態(tài)和出芽生殖方式。

美藍是一種無毒的染料，它的氧化型呈藍色，復原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的復原能力，使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的復原型。因此，具有復原能力的酵母活細胞是無色的，而死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞那么呈藍色，借此即可對酵母菌的死活細胞進行鑒別。Scanningelectronmicrographofthecommonbaker'sandbrewer'syeastSaccharomycescerevisiae.Notethebuddingdivisionandpreviousbudscars.三、材料與器材菌種:釀酒酵母〔Saccharomycescerevisiae〕麥芽汁〔或豆芽汁〕斜面培養(yǎng)物。試劑：0.05％和0.1呂氏堿性美藍染色液，革蘭氏染色用碘液顯微鏡，玻片等四、操作步驟1、菌種活化將酵母移種至新鮮的麥芽汁瓊脂斜面上，25~28℃培養(yǎng)48h左右備用。2、美藍鏡片的觀察1〕在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍染色掖，然后按無菌操作用接種環(huán)挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均勻。2〕用鑷子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上。3〕將制片放置約3min后鏡檢，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽情況，并根據顏色來區(qū)別死活細胞。4〕染色約0.5h后再次進行觀察，注意死活細胞數量是否增加。5〕用0.05%呂氏堿性美藍染液重復上述操作。3、水一碘液鏡片的觀察在載玻片中央加一小滴革蘭氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少許酵母菌苔放在水一碘液中混勻，蓋上蓋玻片后鏡檢。、本卷須知1、加染液不宜過多或過少，否那么，在蓋上蓋玻片時，菌液會溢出或出現大量氣泡而影響觀察。2、蓋玻片不宜平著放下，以免產生氣泡影響觀察。六、思考題1、呂氏堿性美藍染液濃度和作用時間的不同，對酵母菌死細胞數量有何影響？試分析其原因。2、在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別于一般細菌？實驗四酵母菌子囊孢子的觀察

一、教學要求學習并掌握酵母菌子囊孢子的觀察方法。二、根本原理子囊孢子是子囊菌類真菌有性生殖產生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形態(tài)是酵母菌分類鑒定的重要依據之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的條件，所以對不同種屬的酵母要選擇適合形成子囊孢子的培養(yǎng)基。SexualsporesAscospore Formedinasac(ascus)三、材料與器材菌種：同前.試劑：5％孔雀綠水溶液，0.5％番紅水溶液，95％乙醇.顯微鏡，玻片等.四、操作步驟1、菌種活化將酵母移種至新鮮的麥芽汁瓊脂斜面上，25~28℃培養(yǎng)24h左右，然后再轉種2~3次。2、產孢培養(yǎng)將經活化的菌種轉接到麥氏瓊脂斜面上，25~28℃培養(yǎng)約1周。3、制片取經產孢培養(yǎng)的酵母斜面培養(yǎng)物，在凈潔載玻片上按常規(guī)涂片、枯燥、固定。4、染色滴加5%孔雀綠染色1min。5、脫色用95%乙醇脫色30s，水洗。6、復染用0.5%番紅復染30s，水洗，用吸水紙吸干。7、鏡檢干后用油鏡觀察〔子囊孢子呈綠色，菌體和子囊呈粉紅色〕。五、本卷須知菌種活化時，要采用新配制、外表濕潤的斜面培養(yǎng)基。六、思考題如何區(qū)別酵母菌的營養(yǎng)細胞和釋放出子囊外的子囊孢子？實驗五顯微鏡直接計數法一、實驗目的

掌握血球計數板的原理及使用血球計數板進行微生物計數的方法。

二、材料與器材

菌種：釀酒酵母顯微鏡、血球計數板、蓋玻片、酒精燈等。三、實驗原理顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上〔又稱計數器〕，于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內外常用的計菌器有：血球計數板、peteroff-Hauser計菌器、Hawksley計菌器等。設五個中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，如果是25個中方格的計數把板，那么：1ml菌液中的總菌數=A/5×25×104×B=50000AB16個中方格的計數板，那么：1ml菌液中的總菌數=A/4×16×104×B=32000AB四、操作步驟1、以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成適當濃度的菌懸液2、鏡檢計數室3、將清潔枯燥的血球計數板蓋上蓋玻片，用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母液由該玻片邊緣滴一小滴，讓菌液靠毛細滲透作用進入技術室4、顯微鏡計數5、清洗血球計數板：鏡檢五、本卷須知切勿用硬物洗刷血球計數板，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。六、思考題1、在滴加菌液時，為什么要先置蓋玻片，然后滴加菌液？2、計算細菌數目時此法是否可以適用？實驗六霉菌的形態(tài)觀察與鑒定一、目的：學習并掌握觀察霉菌形態(tài)的根本方法。二、實驗原理霉菌可產生復什分支的菌絲體，分基內菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產生孢子。菌絲體〔尤其是繁殖菌絲〕及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗的多〔約3-10um)常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍。因此，用低倍鏡即可觀察。Theportionofthemyceliumthatanchorsthemoldandabsorbsnutrientsiscalledthevegetativemycelium;theportionthatproducesasexualreproductivesporesistermedtheaerialmyceliumBreadMoldSporesonFungalFruitingStructure,Rhizopussp.(SEMx2,990)

FungalMyceliumwithSpores,Penicilliumsp.(SEMx3,220)BlackMold,Aspergillusvariecolor.(SEMx2,315)觀察方法直接制片觀察，載玻片培養(yǎng)觀察，玻璃紙培養(yǎng)觀察三、材料與器材菌種：曲霉(Aspergillus

sp.)、根霉(Rhizopus

sp.)、青霉和(Mucor

sp.)培養(yǎng)2-5d的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)物試劑：乳酸石炭酸棉藍染色液無菌吸管，平皿，載玻片，顯微鏡等四操作程序直接制片觀察：于潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸液于載片中央，用解剖針從霉菌菌落的邊緣處取小量帶有孢子的菌絲置于液滴中，再細心地將菌絲挑散開，然后小心地蓋上蓋玻片，注意不要產生氣泡。置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時再換高倍鏡。載玻片培養(yǎng)觀察法：〔1〕培養(yǎng)小室的滅菌〔2〕瓊脂塊的制作〔3〕接種〔4〕培養(yǎng)〔5〕鏡檢五、本卷須知挑菌和制片時要細心，盡可能保持霉菌自然生長狀態(tài)。加蓋玻片時切勿壓入氣泡，以免影響觀察。六、思考題青霉和曲霉的形態(tài)有哪些異同？細菌、放線菌、酵母菌和霉菌的主要區(qū)別是什么？實驗七微生物大小的測定一、實驗目的1.學習并掌握用測微尺測定微生物大小的方法。2.增強微生物細胞大小的感性認識。二、實驗原理微生物細胞的大小是微生物根本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據之一。微生物大小的測定，需要在顯微鏡下，借助于特殊工具—測微尺，包括目鏡測微尺和鏡臺測微尺。鏡臺測微尺適用于校正目鏡測微尺每個的相對長度。然后，根據微生物細胞相當于目鏡測微尺的個數，即可計算出細胞的實際大小。三、材料與器材

1、菌種釀酒酵母24h馬鈴薯培養(yǎng)物

2、顯微鏡目鏡測微尺鏡臺測微尺載玻片蓋玻片等四、操作步驟1、裝目鏡測微尺2、校正目鏡測微尺裝鏡臺測微尺：校正：計算：鏡臺測微尺每格長10um，根據以下公式即可分別計算出在不同放大倍數下，目鏡測微尺每個所代表的長度。目鏡測微尺每格長度(μm)=兩重和線間鏡臺測微尺格數*10/兩重和線間目鏡測微尺格數3、菌體大小測定4、測定完畢后，取出出目鏡測微尺用擦凈紙擦干凈，放回盒內保存。五、本卷須知換高倍鏡和油鏡時，防止接物鏡壓壞靜臺微尺和損壞鏡頭六、思考題為什么更換不同放大倍數的目鏡和物鏡時，必須用靜臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正。實驗八培養(yǎng)基的配制與滅菌一、教學要求通過配制牛肉膏蛋白胨等培養(yǎng)基，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。了解采用的滅菌方法和原理，掌握高壓蒸汽滅菌技術。二、實驗原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)既是一種應用廣泛和徐普通的細菌根底培養(yǎng)基，又成為普通培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基中含有一般細菌生長所需要的最根本的營養(yǎng)物質，所以可供作微生物生長繁殖之用。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨提供氮源和維生素，氯化鈉提供無機鹽。

三、實驗材料與器材培養(yǎng)基：牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl、1mol/LNaoH、1mol/LHCl、黃豆芽、蔗糖〔或葡萄糖〕器材：玻璃器皿、天平、pH試紙、滅菌鍋等四、操作步驟稱量→溶解→調pH*→〔過濾*〕→分裝*→加塞*→包扎→高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌滅菌操作步驟：首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內參加適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。

放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。開啟電源加熱，并同時翻開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用1.05kg/cm2，121.3℃，20min滅菌。滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，翻開排氣閥，旋松螺栓，翻開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，翻開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養(yǎng)基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫箱培養(yǎng)24h，經檢查假設無雜菌生長，即可待用。五、本卷須知培養(yǎng)基分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。使用滅菌鍋應嚴格按照操作程序進行。滅菌所需時間到后，要先切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，才能翻開排氣閥。六、思考題在配制培養(yǎng)基的操作過程要注意哪些問題？高壓蒸汽滅菌時，為什么要先將滅菌鍋鍋內的冷空氣完全排盡？實驗九平板菌落計數一、教學要求掌握平板菌落計數的原理和方法二、實驗原理平板菌落計數是將待測樣品經適當稀釋后，其中的微生物充分分散成單個細胞，去一定量的稀釋樣液接種到平板上，經過培養(yǎng)，一個菌落就可以看成是由一個細胞繁殖而成的。三、材料與器材無菌培養(yǎng)皿12套、1mL無菌移液管10支、醬油樣品、天平等。四、操作步驟

無菌平皿編號→制備菌懸液→傾注平板→培養(yǎng)(48h)→計數

五、本卷須知倒平板時要注意控制培養(yǎng)基的溫度。稀釋操作時，要盡量減少樣品稀釋誤差，而且每個稀釋度的菌液應各用一支無菌吸管。為使菌落能在平板上均勻分布，樣品液參加平皿后，應盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉混勻。六、思考題要測定某種液體飲料中的活細菌總數，除了采用平板菌落計數法外，還可采用哪些方法？實驗十產淀粉酶枯草芽孢桿菌的別離、純化一、教學要求通過從土壤中別離純化細菌，初步掌握微生物的別離純化方法和無菌操作技術。

二、實驗原理枯草芽孢桿菌的多數中都能產生大量的淀粉酶，較易得到別離。由于芽孢具有較強的抗熱能力，別離純化時可采用熱處理的方法，高溫加熱處理，殺死樣品中所有不含芽孢的菌類，在培養(yǎng)過程中使芽孢桿菌得到很好的富集。利用該菌產淀粉酶的特性，選擇以淀粉為碳源的別離培養(yǎng)基，菌體分泌的淀粉酶會使菌落周圍的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周圍出現清晰的透明圈。根據透明圈的直徑〔C〕與菌落直徑〔H〕之比〔C/H〕可初步鑒定酶活力的上下，即比值越大酶活力越高，進而篩選出優(yōu)良的生產用菌。

三、材料與器材

滅過菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)0.02mol/L碘液無菌生理鹽水無菌培養(yǎng)皿6套/組、1mL無菌移液管7支、土壤樣品、天平等。四、操作步驟制備土壤稀釋液

傾注平板培養(yǎng)

接種和別離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀

挑菌落isolationplate移接斜面常用的接種方法劃線接種點接種穿刺接種涂布接種液體接種注射接種斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌(2)開啟棉塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好棉塞純化〔平板劃線法〕倒平板——劃線——培養(yǎng)——挑菌落——純種〔純培養(yǎng)〕平板劃線別離的方法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法五、本卷須知制備土壤稀釋液時，要注意使土樣均勻分散在稀釋液中。注意無菌操作。六、思考題如何檢驗平板上某個單菌落是不是純培養(yǎng)？實驗十一多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群一、教學要求

1、學習測定水中大腸菌群數量的多管發(fā)酵法；

2、了解大腸菌群的數量在飲水中的重要性。二、實驗原理大腸菌群系一群一大腸埃希氏菌(E.Coli)為主的需氧及兼性厭氧的革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌，在37℃生長時，能于48小時內發(fā)酵乳糖使之產酸產氣。主要包括埃希氏菌屬(Escherichia)、檸檬酸細菌屬(Citrobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)等。

該類細菌是腸道內的常居菌，主要寄居在人及溫血動物的腸道內，不斷隨糞便排泄出來，因而在自然界環(huán)境中所存在的大腸菌群，都可以認為來自糞便。對水和飲食等物質衛(wèi)生情況的判斷，常以所含的大腸菌群的多少作為依據。如大腸菌群細菌越多。表示受糞便污染的程度越大，也就是受腸道中病原菌隨糞便侵入的可能性越大。因此在各種物質的衛(wèi)生細菌學檢查中，非但要檢查大腸菌群的有無，同時要檢查大腸菌群存在的數量，來判斷物質受糞便污染的程度。

多管發(fā)酵法包括初(步)發(fā)酵實驗、平板別離和復發(fā)酵實驗三個局部。1、初(步)發(fā)酵實驗發(fā)酵管內裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管，乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產酸產氣，為便于觀察細菌的產酸情況，培養(yǎng)基內加有溴甲酚紫作為pH指示劑，細菌產酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色，溴甲酚紫還有抑制其他細菌如芽孢細菌生長的作用。水樣接種于發(fā)酵管內，37℃下培養(yǎng)，24小時內小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸菌群為陽性結果，但也有個別其他類型的細菌在此條件下也可能產氣；此外產酸不產氣的也不能完全說明是陰性結果，在少量的情況下，也可能延遲到48小時后才產氣，此時應視為可疑結果，因此，以上兩種結果均需繼續(xù)做下面兩局部實驗，才能確定是否是大腸菌群。48小時后仍產氣的陽性結果。2、平板別離平板培養(yǎng)基一般使用復紅亞硫酸鈉瓊脂〔遠藤氏培養(yǎng)基，Endo’s