微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與食品工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)顯微鏡概述微生物的個(gè)體微小，必須借助顯微鏡才能觀察到。因此，顯微鏡就成為微生物學(xué)研究工作者不可缺少的根本工具。所以，了解顯微鏡的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)、功能和正確地掌握不同顯微鏡的使用方法是很有必要的。顯微鏡可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類(lèi)。光學(xué)顯微鏡有普通光學(xué)顯微鏡、相差顯微鏡、微分干預(yù)差顯微鏡、暗視野顯微鏡、紫外光顯微鏡、偏光顯微鏡和熒光顯微鏡。下面主要介紹普通光學(xué)顯微鏡。實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和光學(xué)顯微鏡的使用一、目的要求1.學(xué)習(xí)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、功能和使用方法。2.學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。根底知識(shí)

尼康E-600顯微鏡

二、顯微鏡的根本結(jié)構(gòu)及油鏡的工作原理普通生物顯微鏡由3局部構(gòu)成：①照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。②光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體。③機(jī)械裝置：用于固定材料和觀察方便，包括鏡臺(tái)(載物臺(tái))、調(diào)節(jié)器和、物鏡轉(zhuǎn)換器(旋轉(zhuǎn)器)。與其他物鏡不同，油鏡需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，原因有二：1.增加照明亮度油鏡的放大倍數(shù)可達(dá)100x，教具很短，直徑很小，但所需要的光照強(qiáng)度卻最大。為了不使通過(guò)的光線(xiàn)有所損失，必須造又精于參加與玻璃的折射率〔n=1.55〕相仿的鏡油。通常用香柏油〔n=1.52〕.2.增加顯微鏡的分辨率油鏡的分辨率可到達(dá)0.2μm左右。2.熒光顯微鏡

尼康E800熒光DIC顯微鏡

熒光顯微鏡照片〔微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色〕3.激光共聚焦掃描顯微鏡

LCSM照片藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管

4.暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡〔darkfieldmicroscope〕的聚光鏡中央有當(dāng)光片，使照明光線(xiàn)不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線(xiàn)進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見(jiàn)到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。

一種介殼蟲(chóng)的染色體

5.相差顯微鏡6.偏光顯微鏡偏光顯微鏡〔polarizingmicroscope〕用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。7.微分干預(yù)差顯微鏡DIC顯微鏡其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差異更大，故影像的立體感更強(qiáng)。DIC顯微鏡下的硅藻〔偽彩色〕8.倒置顯微鏡

9.透射電子顯微鏡

JEM-1011透射電子顯微鏡

萊卡超薄切片機(jī)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖〔偽彩色〕冰凍蝕刻電鏡照片

10.掃描電子顯微鏡

JEOL掃描電子顯微鏡人類(lèi)血細(xì)胞SEM照片

11.顯微操作技術(shù)

尼康NT-88NE顯微操作/注射儀

顯微鏡的分辨率:也稱(chēng)為分辨力，它是指能把兩個(gè)物點(diǎn)辨清的最小距離，分辨距離越大，那么分辨率越低。所以，分辨率是以分辨距離來(lái)表示的。其計(jì)算公式為:D=0.61入/N·AN·A·=n·sina/2式中D為分辨率，A為光波波長(zhǎng)，N·A·為物鏡的數(shù)值孔徑(鏡口率)。在物鏡上，有鏡口率(N.A.)的標(biāo)志，它反響該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：物鏡鏡口率(N.A.)工作距離(mm)10×0.255.4040×0.650.39100×1.300.11顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，公式為:M=K1xK2

焦點(diǎn)深度:顯微鏡調(diào)焦到看清標(biāo)本某一點(diǎn)時(shí)，不僅是這一物點(diǎn)，而且它的上下兩側(cè)也能看清楚兩側(cè)的厚度叫做焦點(diǎn)深度?？吹綐?biāo)本的全厚度，必須調(diào)節(jié)螺旋仔細(xì)地從上到下進(jìn)行觀察。厚標(biāo)本和薄標(biāo)本4-5um2um根底知識(shí)三、實(shí)驗(yàn)步驟(一)顯微鏡的使用1.觀察前的準(zhǔn)備工作

(1)觀察者要養(yǎng)成顯微鏡鏡檢的工作習(xí)慣，觀察時(shí)要雙眼同時(shí)睜開(kāi)，一邊觀察一邊進(jìn)行記錄或描繪。

(2)觀察時(shí)所用的材料、藥品和各種器具要預(yù)先準(zhǔn)備好。

(3)顯微鏡在使用之前應(yīng)檢查一下它的各個(gè)部件是否完整和正常，并對(duì)載物臺(tái)、目鏡、物鏡以及聚光器上端透鏡進(jìn)行必要的清潔工作。然后進(jìn)行合軸調(diào)節(jié)。瞳距調(diào)節(jié)2.顯微鏡的調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)粗調(diào)松緊調(diào)節(jié)旋鈕聚光鏡中心調(diào)節(jié)⑤光軸中心調(diào)節(jié)螺釘③視場(chǎng)光欄③孔徑光欄②10X物鏡①標(biāo)本④聚光鏡升降旋鈕孔徑光欄調(diào)節(jié)N.A聚=(0.6-0.8)N.A物孔徑光欄開(kāi)度與圖象100%70%30%孔徑光欄的運(yùn)用操作步驟如下:(1〕可變光欄的中心對(duì)準(zhǔn)聚光鏡的中心。如果可變光欄的水平是固定的，那么裝配時(shí)已保證它與聚光鏡合軸，不必調(diào)整;如果可變光欄的水平位置可以移動(dòng)，那么應(yīng)把可變光欄關(guān)到最小，使它的中心孔對(duì)準(zhǔn)聚光鏡下方的透鏡中心。(2)載物臺(tái)上放置觀察標(biāo)本，把聚光器上升到它上端透鏡平面稍低于載物臺(tái)平面的高度，并將它的可變光欄開(kāi)到最大，用低倍物鏡，進(jìn)行調(diào)焦到能看見(jiàn)標(biāo)本，可調(diào)反射鏡使視野得到最亮和最均勻的照明，或把光欄關(guān)小，最亮的照明區(qū)正處在視野的中央。(3)轉(zhuǎn)到高倍鏡，并調(diào)焦到看清標(biāo)本，然后去掉標(biāo)本，拔出目鏡，眼睛直接向鏡筒觀察，并把可變光欄關(guān)小，看其亮點(diǎn)是否在視野中心，如果不是，就要轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器的調(diào)節(jié)螺旋，把亮點(diǎn)調(diào)到視野中央，再慢慢開(kāi)啟可變光欄，使視野看到光欄邊緣和聚光鏡的邊緣相接為止。3.觀察操作(1)低、高倍鏡的使用:先把低倍的物鏡用粗調(diào)焦螺旋下降至離蓋玻片0.5cm處，然后一邊觀察視野一邊上升物鏡，直至看到圖像，再將標(biāo)本移到視野中心，用細(xì)調(diào)焦螺旋把物鏡調(diào)至最清晰處，假設(shè)要用高倍鏡觀察時(shí)，把所要進(jìn)一步放大觀察的部位移至視野中央，直接順時(shí)針轉(zhuǎn)換成高倍物鏡，然后用細(xì)調(diào)焦螺旋調(diào)焦，至看清物像。

四、本卷須知1.低、高倍鏡的使用。2.合軸調(diào)節(jié)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.熟練顯微鏡的調(diào)節(jié)。

六、思考題1.使用油鏡時(shí)，為使么選用香柏油或液體石蠟作為物鏡與玻片間的介質(zhì)？其他液體行嗎？2.油鏡用畢后，為什么必須把鏡油擦凈？用過(guò)多的二甲苯或用酒精擦鏡有什么危害？3.什么是物鏡的同焦現(xiàn)象？他在顯微鏡觀察中有什么意義？4.觀察時(shí)為什么要用左眼，并且兩眼都應(yīng)睜開(kāi)？實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌形態(tài)構(gòu)造的染色觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、掌握革蘭氏染色、芽孢染色的原理及方法；

2、初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)構(gòu)造；

3、進(jìn)一步熟練顯微鏡的使用方法。

二、材料與儀器1、菌種：大腸桿菌約1d、枯草芽孢桿菌2d、枯草芽孢桿菌12-20h的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物；2、染色液：革蘭氏染色液、5%孔雀綠溶液、0.5%番紅水溶液；3、儀器：顯微鏡、載玻片、酒精燈等。三、實(shí)驗(yàn)原理〔革氏染色法〕1、革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的重要鑒別染色法，通過(guò)此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭氏陽(yáng)性菌〔G+)和革蘭氏陰性菌〔G-〕兩大類(lèi)。2、制片〔涂片，枯燥，固定〕→初染〔結(jié)晶紫、水洗〕→媒染〔加碘液覆蓋涂面〕→脫色〔95%酒精、水洗，〕→復(fù)染〔蕃紅復(fù)染、水洗〕→枯燥→鏡檢革蘭氏染色與細(xì)胞壁：肽聚糖外膜外膜蛋白周質(zhì)空間1、革蘭氏染色1、用堿性染料結(jié)晶紫對(duì)菌液涂片進(jìn)行初染2、用碘溶液進(jìn)行媒染，其作用是提高染料和細(xì)胞間的相互作用從而使二者結(jié)合得更牢固。3、用乙醇或丙酮沖洗進(jìn)行脫色。在經(jīng)歷脫色后仍將結(jié)晶紫保存在細(xì)胞內(nèi)的為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，而革蘭氏陰性細(xì)菌的結(jié)晶紫被洗掉，細(xì)胞呈無(wú)色。4、用一種與結(jié)晶紫具有不同顏色的堿性染料對(duì)涂片進(jìn)行復(fù)染。例如番紅，它使原來(lái)無(wú)色的革蘭氏陰性細(xì)菌最后呈現(xiàn)桃紅到紅色，而革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌繼續(xù)保持深紫色四、實(shí)驗(yàn)步驟革蘭氏陽(yáng)性菌革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌革蘭氏陽(yáng)性菌2、芽孢染色原理：細(xì)菌的芽孢壁致密，透性低，著色和脫色都比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞困難。因此，一般采用堿性染料并在微火上加熱，或延長(zhǎng)染色時(shí)間，使菌體和芽抱都同時(shí)染上色后，再用蒸餾水沖洗，脫去菌體的顏色，但仍保存芽飽的顏色。并用另一種比照鮮明的染料使菌體著色，如此可以在顯微鏡下明顯區(qū)分芽飽和營(yíng)養(yǎng)體的形態(tài)。

步驟：1、制片:按常規(guī)制片、枯燥、固定。2、染色：加數(shù)滴孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片一端，微火加熱至冒蒸汽時(shí)，保持5min。切勿讓涂片枯槁。3、水洗至流出的水無(wú)色為止。4、復(fù)染：用番紅染液復(fù)染2min。5、水洗：用緩流水洗后，吸干。6、鏡檢：干后油鏡觀察。芽孢為綠色，芽孢囊及營(yíng)養(yǎng)體為紅色?？莶菅挎邨U菌的染色涂片芽孢芽孢囊五、本卷須知1、注意涂片不宜過(guò)厚；2、火焰固定溫度要適宜；3、注意控制好脫色程度。六、思考題1、造成革蘭氏染色結(jié)果不正確〔假陰性或假陽(yáng)性〕的主要原因有哪些？2、在鏡檢時(shí)，如圖片中的細(xì)菌呈紅色，能否斷定該細(xì)菌就是革蘭氏陰性菌？3、用簡(jiǎn)單染色法是否能觀察到細(xì)菌的芽孢？為什么？4、假設(shè)涂片中觀察到的只是大量游離芽孢，很少看到芽孢囊及營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，什么原因？

實(shí)驗(yàn)三酵母菌的形態(tài)觀察一、教學(xué)要求學(xué)習(xí)并掌握形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒別方法。二、實(shí)驗(yàn)原理酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物，其大小通常比細(xì)菌大幾十倍甚至十幾倍。大多數(shù)以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過(guò)接合產(chǎn)生子囊孢子。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)美藍(lán)染液水浸片和水—碘液水浸片來(lái)觀察酵母的形態(tài)和出芽生殖方式。

美藍(lán)是一種無(wú)毒的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，復(fù)原型無(wú)色。用美藍(lán)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的復(fù)原能力，使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的復(fù)原型。因此，具有復(fù)原能力的酵母活細(xì)胞是無(wú)色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞那么呈藍(lán)色，借此即可對(duì)酵母菌的死活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。Scanningelectronmicrographofthecommonbaker'sandbrewer'syeastSaccharomycescerevisiae.Notethebuddingdivisionandpreviousbudscars.三、材料與器材菌種:釀酒酵母〔Saccharomycescerevisiae〕麥芽汁〔或豆芽汁〕斜面培養(yǎng)物。試劑：0.05％和0.1呂氏堿性美藍(lán)染色液，革蘭氏染色用碘液顯微鏡，玻片等四、操作步驟1、菌種活化將酵母移種至新鮮的麥芽汁瓊脂斜面上，25~28℃培養(yǎng)48h左右備用。2、美藍(lán)鏡片的觀察1〕在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍(lán)染色掖，然后按無(wú)菌操作用接種環(huán)挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均勻。2〕用鑷子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上。3〕將制片放置約3min后鏡檢，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)顏色來(lái)區(qū)別死活細(xì)胞。4〕染色約0.5h后再次進(jìn)行觀察，注意死活細(xì)胞數(shù)量是否增加。5〕用0.05%呂氏堿性美藍(lán)染液重復(fù)上述操作。3、水一碘液鏡片的觀察在載玻片中央加一小滴革蘭氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少許酵母菌苔放在水一碘液中混勻，蓋上蓋玻片后鏡檢。、本卷須知1、加染液不宜過(guò)多或過(guò)少，否那么，在蓋上蓋玻片時(shí)，菌液會(huì)溢出或出現(xiàn)大量氣泡而影響觀察。2、蓋玻片不宜平著放下，以免產(chǎn)生氣泡影響觀察。六、思考題1、呂氏堿性美藍(lán)染液濃度和作用時(shí)間的不同，對(duì)酵母菌死細(xì)胞數(shù)量有何影響？試分析其原因。2、在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別于一般細(xì)菌？實(shí)驗(yàn)四酵母菌子囊孢子的觀察

一、教學(xué)要求學(xué)習(xí)并掌握酵母菌子囊孢子的觀察方法。二、根本原理子囊孢子是子囊菌類(lèi)真菌有性生殖產(chǎn)生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形態(tài)是酵母菌分類(lèi)鑒定的重要依據(jù)之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的條件，所以對(duì)不同種屬的酵母要選擇適合形成子囊孢子的培養(yǎng)基。SexualsporesAscospore Formedinasac(ascus)三、材料與器材菌種：同前.試劑：5％孔雀綠水溶液，0.5％番紅水溶液，95％乙醇.顯微鏡，玻片等.四、操作步驟1、菌種活化將酵母移種至新鮮的麥芽汁瓊脂斜面上，25~28℃培養(yǎng)24h左右，然后再轉(zhuǎn)種2~3次。2、產(chǎn)孢培養(yǎng)將經(jīng)活化的菌種轉(zhuǎn)接到麥?zhǔn)檄傊泵嫔希?5~28℃培養(yǎng)約1周。3、制片取經(jīng)產(chǎn)孢培養(yǎng)的酵母斜面培養(yǎng)物，在凈潔載玻片上按常規(guī)涂片、枯燥、固定。4、染色滴加5%孔雀綠染色1min。5、脫色用95%乙醇脫色30s，水洗。6、復(fù)染用0.5%番紅復(fù)染30s，水洗，用吸水紙吸干。7、鏡檢干后用油鏡觀察〔子囊孢子呈綠色，菌體和子囊呈粉紅色〕。五、本卷須知菌種活化時(shí)，要采用新配制、外表濕潤(rùn)的斜面培養(yǎng)基。六、思考題如何區(qū)別酵母菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和釋放出子囊外的子囊孢子？實(shí)驗(yàn)五顯微鏡直接計(jì)數(shù)法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握血球計(jì)數(shù)板的原理及使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。

二、材料與器材

菌種：釀酒酵母顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片、酒精燈等。三、實(shí)驗(yàn)原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上〔又稱(chēng)計(jì)數(shù)器〕，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。目前國(guó)內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血球計(jì)數(shù)板、peteroff-Hauser計(jì)菌器、Hawksley計(jì)菌器等。設(shè)五個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)把板，那么：1ml菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000AB16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，那么：1ml菌液中的總菌數(shù)=A/4×16×104×B=32000AB四、操作步驟1、以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵母制成適當(dāng)濃度的菌懸液2、鏡檢計(jì)數(shù)室3、將清潔枯燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母液由該玻片邊緣滴一小滴，讓菌液靠毛細(xì)滲透作用進(jìn)入技術(shù)室4、顯微鏡計(jì)數(shù)5、清洗血球計(jì)數(shù)板：鏡檢五、本卷須知切勿用硬物洗刷血球計(jì)數(shù)板，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。六、思考題1、在滴加菌液時(shí)，為什么要先置蓋玻片，然后滴加菌液？2、計(jì)算細(xì)菌數(shù)目時(shí)此法是否可以適用？實(shí)驗(yàn)六霉菌的形態(tài)觀察與鑒定一、目的：學(xué)習(xí)并掌握觀察霉菌形態(tài)的根本方法。二、實(shí)驗(yàn)原理霉菌可產(chǎn)生復(fù)什分支的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長(zhǎng)到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。菌絲體〔尤其是繁殖菌絲〕及孢子的形態(tài)特征是識(shí)別不同種類(lèi)霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線(xiàn)菌粗的多〔約3-10um)常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍。因此，用低倍鏡即可觀察。Theportionofthemyceliumthatanchorsthemoldandabsorbsnutrientsiscalledthevegetativemycelium;theportionthatproducesasexualreproductivesporesistermedtheaerialmyceliumBreadMoldSporesonFungalFruitingStructure,Rhizopussp.(SEMx2,990)

FungalMyceliumwithSpores,Penicilliumsp.(SEMx3,220)BlackMold,Aspergillusvariecolor.(SEMx2,315)觀察方法直接制片觀察，載玻片培養(yǎng)觀察，玻璃紙培養(yǎng)觀察三、材料與器材菌種：曲霉(Aspergillus

sp.)、根霉(Rhizopus

sp.)、青霉和(Mucor

sp.)培養(yǎng)2-5d的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)物試劑：乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液無(wú)菌吸管，平皿，載玻片，顯微鏡等四操作程序直接制片觀察：于潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸液于載片中央，用解剖針從霉菌菌落的邊緣處取小量帶有孢子的菌絲置于液滴中，再細(xì)心地將菌絲挑散開(kāi)，然后小心地蓋上蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡。置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時(shí)再換高倍鏡。載玻片培養(yǎng)觀察法：〔1〕培養(yǎng)小室的滅菌〔2〕瓊脂塊的制作〔3〕接種〔4〕培養(yǎng)〔5〕鏡檢五、本卷須知挑菌和制片時(shí)要細(xì)心，盡可能保持霉菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)。加蓋玻片時(shí)切勿壓入氣泡，以免影響觀察。六、思考題青霉和曲霉的形態(tài)有哪些異同？細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母菌和霉菌的主要區(qū)別是什么？實(shí)驗(yàn)七微生物大小的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)并掌握用測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法。2.增強(qiáng)微生物細(xì)胞大小的感性認(rèn)識(shí)。二、實(shí)驗(yàn)原理微生物細(xì)胞的大小是微生物根本的形態(tài)特征，也是分類(lèi)鑒定的依據(jù)之一。微生物大小的測(cè)定，需要在顯微鏡下，借助于特殊工具—測(cè)微尺，包括目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。鏡臺(tái)測(cè)微尺適用于校正目鏡測(cè)微尺每個(gè)的相對(duì)長(zhǎng)度。然后，根據(jù)微生物細(xì)胞相當(dāng)于目鏡測(cè)微尺的個(gè)數(shù)，即可計(jì)算出細(xì)胞的實(shí)際大小。三、材料與器材

1、菌種釀酒酵母24h馬鈴薯培養(yǎng)物

2、顯微鏡目鏡測(cè)微尺鏡臺(tái)測(cè)微尺載玻片蓋玻片等四、操作步驟1、裝目鏡測(cè)微尺2、校正目鏡測(cè)微尺裝鏡臺(tái)測(cè)微尺：校正：計(jì)算：鏡臺(tái)測(cè)微尺每格長(zhǎng)10um，根據(jù)以下公式即可分別計(jì)算出在不同放大倍數(shù)下，目鏡測(cè)微尺每個(gè)所代表的長(zhǎng)度。目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度(μm)=兩重和線(xiàn)間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)*10/兩重和線(xiàn)間目鏡測(cè)微尺格數(shù)3、菌體大小測(cè)定4、測(cè)定完畢后，取出出目鏡測(cè)微尺用擦凈紙擦干凈，放回盒內(nèi)保存。五、本卷須知換高倍鏡和油鏡時(shí)，防止接物鏡壓壞靜臺(tái)微尺和損壞鏡頭六、思考題為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時(shí)，必須用靜臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行校正。實(shí)驗(yàn)八培養(yǎng)基的配制與滅菌一、教學(xué)要求通過(guò)配制牛肉膏蛋白胨等培養(yǎng)基，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。了解采用的滅菌方法和原理，掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)既是一種應(yīng)用廣泛和徐普通的細(xì)菌根底培養(yǎng)基，又成為普通培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的最根本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以可供作微生物生長(zhǎng)繁殖之用。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨提供氮源和維生素，氯化鈉提供無(wú)機(jī)鹽。

三、實(shí)驗(yàn)材料與器材培養(yǎng)基：牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl、1mol/LNaoH、1mol/LHCl、黃豆芽、蔗糖〔或葡萄糖〕器材：玻璃器皿、天平、pH試紙、滅菌鍋等四、操作步驟稱(chēng)量→溶解→調(diào)pH*→〔過(guò)濾*〕→分裝*→加塞*→包扎→高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌滅菌操作步驟：首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)參加適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。

放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以?xún)蓛蓪?duì)稱(chēng)的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。開(kāi)啟電源加熱，并同時(shí)翻開(kāi)排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用1.05kg/cm2，121.3℃，20min滅菌。滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí)，翻開(kāi)排氣閥，旋松螺栓，翻開(kāi)蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí)，翻開(kāi)排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫箱培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查假設(shè)無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可待用。五、本卷須知培養(yǎng)基分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。使用滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行。滅菌所需時(shí)間到后，要先切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí)，才能翻開(kāi)排氣閥。六、思考題在配制培養(yǎng)基的操作過(guò)程要注意哪些問(wèn)題？高壓蒸汽滅菌時(shí)，為什么要先將滅菌鍋鍋內(nèi)的冷空氣完全排盡？實(shí)驗(yàn)九平板菌落計(jì)數(shù)一、教學(xué)要求掌握平板菌落計(jì)數(shù)的原理和方法二、實(shí)驗(yàn)原理平板菌落計(jì)數(shù)是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，去一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，一個(gè)菌落就可以看成是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的。三、材料與器材無(wú)菌培養(yǎng)皿12套、1mL無(wú)菌移液管10支、醬油樣品、天平等。四、操作步驟

無(wú)菌平皿編號(hào)→制備菌懸液→傾注平板→培養(yǎng)(48h)→計(jì)數(shù)

五、本卷須知倒平板時(shí)要注意控制培養(yǎng)基的溫度。稀釋操作時(shí)，要盡量減少樣品稀釋誤差，而且每個(gè)稀釋度的菌液應(yīng)各用一支無(wú)菌吸管。為使菌落能在平板上均勻分布，樣品液參加平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻。六、思考題要測(cè)定某種液體飲料中的活細(xì)菌總數(shù)，除了采用平板菌落計(jì)數(shù)法外，還可采用哪些方法？實(shí)驗(yàn)十產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌的別離、純化一、教學(xué)要求通過(guò)從土壤中別離純化細(xì)菌，初步掌握微生物的別離純化方法和無(wú)菌操作技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)原理枯草芽孢桿菌的多數(shù)中都能產(chǎn)生大量的淀粉酶，較易得到別離。由于芽孢具有較強(qiáng)的抗熱能力，別離純化時(shí)可采用熱處理的方法，高溫加熱處理，殺死樣品中所有不含芽孢的菌類(lèi)，在培養(yǎng)過(guò)程中使芽孢桿菌得到很好的富集。利用該菌產(chǎn)淀粉酶的特性，選擇以淀粉為碳源的別離培養(yǎng)基，菌體分泌的淀粉酶會(huì)使菌落周?chē)牡矸鬯猓渭拥庖杭纯稍诰渲車(chē)霈F(xiàn)清晰的透明圈。根據(jù)透明圈的直徑〔C〕與菌落直徑〔H〕之比〔C/H〕可初步鑒定酶活力的上下，即比值越大酶活力越高，進(jìn)而篩選出優(yōu)良的生產(chǎn)用菌。

三、材料與器材

滅過(guò)菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)0.02mol/L碘液無(wú)菌生理鹽水無(wú)菌培養(yǎng)皿6套/組、1mL無(wú)菌移液管7支、土壤樣品、天平等。四、操作步驟制備土壤稀釋液

傾注平板培養(yǎng)

接種和別離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀

挑菌落isolationplate移接斜面常用的接種方法劃線(xiàn)接種點(diǎn)接種穿刺接種涂布接種液體接種注射接種斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作(1)接種滅菌(2)開(kāi)啟棉塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好棉塞純化〔平板劃線(xiàn)法〕倒平板——?jiǎng)澗€(xiàn)——培養(yǎng)——挑菌落——純種〔純培養(yǎng)〕平板劃線(xiàn)別離的方法1.斜線(xiàn)法2.曲線(xiàn)法3.方格法4.放射法5.四格法五、本卷須知制備土壤稀釋液時(shí)，要注意使土樣均勻分散在稀釋液中。注意無(wú)菌操作。六、思考題如何檢驗(yàn)平板上某個(gè)單菌落是不是純培養(yǎng)？實(shí)驗(yàn)十一多管發(fā)酵法測(cè)定水中大腸菌群一、教學(xué)要求

1、學(xué)習(xí)測(cè)定水中大腸菌群數(shù)量的多管發(fā)酵法；

2、了解大腸菌群的數(shù)量在飲水中的重要性。二、實(shí)驗(yàn)原理大腸菌群系一群一大腸埃希氏菌(E.Coli)為主的需氧及兼性厭氧的革蘭氏染色陰性無(wú)芽孢桿菌，在37℃生長(zhǎng)時(shí)，能于48小時(shí)內(nèi)發(fā)酵乳糖使之產(chǎn)酸產(chǎn)氣。主要包括埃希氏菌屬(Escherichia)、檸檬酸細(xì)菌屬(Citrobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)等。

該類(lèi)細(xì)菌是腸道內(nèi)的常居菌，主要寄居在人及溫血?jiǎng)游锏哪c道內(nèi)，不斷隨糞便排泄出來(lái)，因而在自然界環(huán)境中所存在的大腸菌群，都可以認(rèn)為來(lái)自糞便。對(duì)水和飲食等物質(zhì)衛(wèi)生情況的判斷，常以所含的大腸菌群的多少作為依據(jù)。如大腸菌群細(xì)菌越多。表示受糞便污染的程度越大，也就是受腸道中病原菌隨糞便侵入的可能性越大。因此在各種物質(zhì)的衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢查中，非但要檢查大腸菌群的有無(wú)，同時(shí)要檢查大腸菌群存在的數(shù)量，來(lái)判斷物質(zhì)受糞便污染的程度。

多管發(fā)酵法包括初(步)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、平板別離和復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)三個(gè)局部。1、初(步)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管，乳糖能起選擇作用，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為便于觀察細(xì)菌的產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為pH指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來(lái)的紫色變?yōu)辄S色，溴甲酚紫還有抑制其他細(xì)菌如芽孢細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，37℃下培養(yǎng)，24小時(shí)內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說(shuō)明水中存在大腸菌群為陽(yáng)性結(jié)果，但也有個(gè)別其他類(lèi)型的細(xì)菌在此條件下也可能產(chǎn)氣；此外產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的也不能完全說(shuō)明是陰性結(jié)果，在少量的情況下，也可能延遲到48小時(shí)后才產(chǎn)氣，此時(shí)應(yīng)視為可疑結(jié)果，因此，以上兩種結(jié)果均需繼續(xù)做下面兩局部實(shí)驗(yàn)，才能確定是否是大腸菌群。48小時(shí)后仍產(chǎn)氣的陽(yáng)性結(jié)果。2、平板別離平板培養(yǎng)基一般使用復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂〔遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基，Endo’s