化療聯(lián)合靶向治療

化療聯(lián)合靶向治療第1頁/共44頁研究背景

大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,全世界每年大約有接近一百萬新發(fā)病例,同時(shí)至少五十萬患者死亡。

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20年前,5-Fu是唯一的治療晚期大腸癌有效的藥物,其中位生存期只有12個(gè)月左右。近10年來,草酸鉑、伊立替康、卡培他濱等新的細(xì)胞毒藥物相繼問世,將中位生存期提高至20個(gè)月左右。

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傳統(tǒng)的化療缺乏特異性，而靶向治療單藥有效率低，因此，如何將化療與靶向治療有機(jī)結(jié)合成為腫瘤治療的研究重點(diǎn)。第4頁/共44頁

分子靶向治療常用的治療靶點(diǎn)有：

·細(xì)胞受體

·信號(hào)傳導(dǎo)

·抗血管生成等第5頁/共44頁

血管生成在腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和演進(jìn)中起著非常重要的作用第6頁/共44頁血管前期彌散作用生長緩慢實(shí)體瘤血管期新生毛細(xì)血管生長迅速第7頁/共44頁

研究背景

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Sunitinib

Sunitinib是一種小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑,,對(duì)血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)、干細(xì)胞因子受體(C-Kit)等多種受體酪氨酸激酶具有抑制作用。

第8頁/共44頁圖1Sunitinib抗腫瘤作用機(jī)制

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Sunitinib單藥臨床有效率低,如何與化療聯(lián)合提高抗癌效應(yīng)備受關(guān)注。第10頁/共44頁

研究背景

—奧沙利鉑

奧沙利鉑(Oxaliplatin)是一種水溶性的鉑類復(fù)合物,對(duì)腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用,具有抗腫瘤活性是由于鉑化后鏈間和鏈內(nèi)形成加合物致DNA合成抑制,抗腫瘤活性不受DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷或復(fù)制旁路強(qiáng)化的影響,與順鉑和卡鉑無交叉耐藥。第11頁/共44頁研究內(nèi)容根據(jù)細(xì)胞生長曲線及單藥作用抑制率設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案第12頁/共44頁先奧沙利鉑+sunitinib24h后sunitinib48h

先奧沙利鉑24h后sunitinib72h

化療藥物聯(lián)合舒尼替尼作用于腫瘤細(xì)胞系先sunitinib72h后奧沙利鉑24h

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實(shí)驗(yàn)方法

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材料細(xì)胞株：大腸癌Lovo細(xì)胞主要試劑及試劑盒：注射用奧沙利鉑（Oxaliplatin）蘋果酸舒尼替尼（Sunitinib/Sutent）

Hoechst凋亡試劑盒

細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)試劑盒第14頁/共44頁

實(shí)驗(yàn)方法

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材料主要儀器設(shè)備：

流式細(xì)胞儀酶標(biāo)儀熒光顯微鏡

第15頁/共44頁實(shí)驗(yàn)流程結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞舒尼替尼細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖與活力檢測(cè)化療藥物（奧沙利鉑）周期及凋亡檢測(cè)AnnexinV聯(lián)合PI法MTT法Hoechst法選定幾種最佳的藥物聯(lián)合治療方案第16頁/共44頁

實(shí)驗(yàn)方法

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主要試劑配制逐次稀釋蘋果酸舒尼替尼、奧沙利鉑，使之成系列濃度。

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實(shí)驗(yàn)方法

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MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

單藥處理：

培養(yǎng)細(xì)胞鋪板加化療藥

加DMSO棄液加MTT震蕩酶標(biāo)儀測(cè)值數(shù)據(jù)處理第18頁/共44頁

實(shí)驗(yàn)方法

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MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

雙藥處理：

培養(yǎng)細(xì)胞鋪板加抑制劑

加DMSO加MTT加化療藥震蕩酶標(biāo)儀測(cè)值數(shù)據(jù)處理第19頁/共44頁

實(shí)驗(yàn)方法

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Hoechst法證實(shí)細(xì)胞凋亡存在

·正常細(xì)胞對(duì)染料拒染，熒光著色淡

·凋亡細(xì)胞主要攝取Hoechst染料呈強(qiáng)藍(lán)色熒光

·處于亞二倍體區(qū)的細(xì)胞群屬于形成凋亡小體的細(xì)胞第20頁/共44頁

實(shí)驗(yàn)方法

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Hoechst法證實(shí)細(xì)胞凋亡存在

培養(yǎng)細(xì)胞藥物干預(yù)單細(xì)胞懸液

染色洗滌固定

洗滌鋪片檢測(cè)

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實(shí)驗(yàn)方法

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AnnexinV－PI法檢測(cè)凋亡培養(yǎng)細(xì)胞藥物干預(yù)單細(xì)胞懸液

孵育加試劑分裝流式細(xì)胞儀分析第22頁/共44頁

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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不同時(shí)間抑制率比較

圖2藥物Sunitinib在不同時(shí)間對(duì)Lovo細(xì)胞的抑制（%）第23頁/共44頁變異來源自由度SSMSFP處理組間變異21431.1819715.591014.280.0012區(qū)組間變異5931.8561346.37215.920.0301誤差10500.980950.0981總變異172664.0189注：方差齊性檢驗(yàn)P=0.1904第24頁/共44頁

經(jīng)分析結(jié)果顯示,處理組間變異F=14.28，P=0.0012，可以認(rèn)為不同用藥時(shí)間抑制率值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三組之間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，三組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；區(qū)組間變異F=5.92，P=0.0301，可以認(rèn)為不同用藥濃度抑制率值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第25頁/共44頁Sunitinib作用于Lovo細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的時(shí)間、濃度依賴性第26頁/共44頁

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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不同時(shí)間抑制率比較

圖3

藥物奧沙利鉑在不同時(shí)間對(duì)Lovo細(xì)胞的抑制（%）第27頁/共44頁變異來源自由度SSMSFP處理組間變異22.60471.30378.340.0913區(qū)組間變異53884.7101776.94204653.40<0.0001誤差101.6696210.166962總變異173888.9871注：方差齊性檢驗(yàn)P=0.1904第28頁/共44頁

經(jīng)分析結(jié)果顯示,處理組間變異F=8.34，P=0.0913，尚不能認(rèn)為不同用藥時(shí)間抑制率值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；區(qū)組間變異F=4653.40，P<0.0001，可以認(rèn)為不同用藥濃度抑制率值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第29頁/共44頁奧沙利鉑的時(shí)間依賴性效應(yīng)相對(duì)不明顯，存在濃度依賴性第30頁/共44頁

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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不同時(shí)間抑制率比較注：A奧沙利鉑

BSunitinib圖4不同方案在各測(cè)量時(shí)間對(duì)Lovo細(xì)胞的抑制（%）第31頁/共44頁變異來源自由度SSMSFP處理組間變異42628.4726657.112835.07<0.0001區(qū)組間變異53064.5971612.919432.71<0.0001誤差20374.788818.7394總變異296067.8585注：方差齊性檢驗(yàn)P=0.1904第32頁/共44頁

經(jīng)分析結(jié)果顯示,處理組間變異F=35.07，P<0.0001，可以認(rèn)為不同給藥方案抑制率值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；五組之間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，五組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；區(qū)組間變異F=32.71，P<0.0001，可以認(rèn)為不同用藥濃度抑制率值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

第33頁/共44頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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細(xì)胞周期

腸癌Lovo細(xì)胞經(jīng)奧沙利鉑作用24h再經(jīng)Sunitinib作用72h后，G0/G1

期細(xì)胞由61.18%±2.27%下降到6.58%±2.16%,S

期細(xì)胞由29.35%±1.23%下降到28.47%±1.83%,而G2/M

期細(xì)胞由11.79%±2.08%上升到66.84%±2.44%。由此可見，先奧沙利鉑后Sunitinib聯(lián)合方案能將更多的細(xì)胞阻滯在G2/M期。第34頁/共44頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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細(xì)胞凋亡

腸癌Lovo細(xì)胞經(jīng)奧沙利鉑作用24h再經(jīng)Sunitinib作用72h后，早期凋亡率為13.28%±1.64%，晚期調(diào)往率為8.77%±2.52%，總凋亡率為20.85%±2.32%。第35頁/共44頁

Hoechst法結(jié)果

圖5對(duì)照組Lovo細(xì)胞的熒光顯像（×100）

第36頁/共44頁圖6最佳方案處理組Lovo細(xì)胞的熒光顯像（×200）

（先奧沙利鉑24h后Sunitinib72h組）第37頁/共44頁

討論

Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)用作用于人腸癌Lovo細(xì)胞存在最佳聯(lián)合模式,其可將可將細(xì)胞阻滯在G2/M期，存在顯著凋亡。

第38頁/共44頁

討論

提示:已知化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后，部分細(xì)胞在G2/M期開始DNA修復(fù)和分裂，從而逃避凋亡。奧沙利鉑后給予Sunitinib可將細(xì)胞阻滯在G2/M期，進(jìn)一步干擾損傷細(xì)胞的修復(fù)，維持奧沙利鉑誘導(dǎo)的凋亡。

第39頁/共44頁討論

提示：奧沙利鉑引起的細(xì)胞損傷后,腫瘤細(xì)胞為逃避死亡，可能激活信號(hào)傳導(dǎo)通路,在這種情況下，Sunitinib阻斷通路,聯(lián)合細(xì)胞毒作用，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并造成腫瘤細(xì)胞的不可修復(fù)性損害。

第40頁/共44頁

結(jié)論

本研究著眼于Sunitinib與化療藥物聯(lián)合方案的臨床合理應(yīng)用，旨在為Sunitinib用于腸癌治療提供聯(lián)合用藥的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體研究結(jié)論可歸納為以下兩點(diǎn)：1、Sunitinib與奧沙利鉑聯(lián)合的體外抗腫瘤作用存在方案依賴性。2、先奧沙利鉑后Sunitinib序貫方案具有較強(qiáng)的抗