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化生專業(yè)微生物病毒上傳第1頁(yè)/共57頁(yè)病毒是一類由核酸和蛋白質(zhì)等少數(shù)幾種成分組成的超顯微“非細(xì)胞生物”,其本質(zhì)是一種只含有DNA或RNA的遺傳因子,它們能以感染態(tài)和非感染態(tài)兩種狀態(tài)存在。Chapter4—1–病毒(Viruses)第2頁(yè)/共57頁(yè)一、病毒的發(fā)現(xiàn)

(Thediscoveryofviruses)

1886年,A.Mayer:煙草花葉??;1892年,D.Ivanovsky:煙草花葉病病原體能通過(guò)細(xì)菌濾器;1898年,MWBeijerinck:煙草花葉病病原體能通過(guò)細(xì)菌濾器;可被乙醇沉淀而不失去其感染性;能在瓊脂凝膠中擴(kuò)散;不能用培養(yǎng)細(xì)菌的方法培養(yǎng);第3頁(yè)/共57頁(yè)1900年前后,口蹄疫等多種動(dòng)植物疾病病原體的濾過(guò)性特性被證明;1915,F(xiàn)WTwort;1917年,F(xiàn)Herelle:發(fā)現(xiàn)細(xì)菌病毒;1935年,WMStanley:提純并結(jié)晶煙草花葉病毒;Bawden等:證明煙草花葉病毒的本質(zhì)為核蛋白;1940年,Kansche,觀察到煙草花葉病毒顆粒;第4頁(yè)/共57頁(yè)不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu),具有一般化學(xué)大分子的特征;一種病毒只含一種核酸,DNA或者RNA;無(wú)產(chǎn)能、蛋白質(zhì)和核酸合成酶系,必須依賴宿主細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸合成,再裝配形成子代;個(gè)體微小,在電子顯微鏡下才能觀察;對(duì)大多數(shù)抗生素不敏感,對(duì)干擾素敏感。二、病毒的主要特點(diǎn)

(Generalfeaturesofviruses)離體條件下,以有感染性的無(wú)生命的生物大分子形式存在;第5頁(yè)/共57頁(yè)三、病毒的類型(Typesofviruses)1、根據(jù)核酸類型(basedonnucleicacid)DNA病毒DNAvirusesRNA病毒RNAviruses雙鏈DNA和單鏈DNA病毒單鏈RNA和雙鏈RNA病毒第6頁(yè)/共57頁(yè)2、根據(jù)宿主(basedonhost)噬菌體(phage)植物病毒(plantviruses)動(dòng)物病毒(animalviruses)細(xì)菌細(xì)胞(bacteriacell)植物細(xì)胞(plantcell)動(dòng)物細(xì)胞(animalcell)第7頁(yè)/共57頁(yè)個(gè)體小,直徑一般在100nm左右;四、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和成分1、病毒的大小和形狀(sizeandshape)最大的:動(dòng)物痘病毒(poxviruses);D≈200nm;最長(zhǎng)的:絲狀病毒(Filoviridae);L≈790-14,000nm;最小的:植物聯(lián)體病毒(Geminiviruses);D≈18-20nm第8頁(yè)/共57頁(yè)病毒的形狀大致可分為:球狀、桿狀和復(fù)雜形狀3種。第9頁(yè)/共57頁(yè)病毒的形態(tài)(Virusshapes)第10頁(yè)/共57頁(yè)把病毒個(gè)體稱為病毒粒子、病毒顆?;蚨玖?,指成熟的、完整的、有感染性的單個(gè)病毒。一團(tuán)能夠自主復(fù)制的遺傳物質(zhì)保護(hù)遺傳物質(zhì)免遭環(huán)境破壞,并作為將遺傳物質(zhì)從一個(gè)宿主細(xì)胞傳遞給另一個(gè)宿主細(xì)胞的載體。蛋白質(zhì)外殼包膜2、毒粒的結(jié)構(gòu)(structureofvirusparticle)第11頁(yè)/共57頁(yè)衣殼capsid核衣殼nucleocapsid核心core包膜envelop毒粒virusparticle核酸nucleicacid衣殼粒capsomere第12頁(yè)/共57頁(yè)(1)衣殼(capsid)衣殼結(jié)構(gòu)類型螺旋對(duì)稱殼體二十面體對(duì)稱殼體雙對(duì)稱結(jié)構(gòu)包圍著病毒核酸的蛋白質(zhì)外殼,由蛋白質(zhì)亞基(衣殼粒,capsomere)按對(duì)稱的形式、有規(guī)律地排列而成。第13頁(yè)/共57頁(yè)螺旋對(duì)稱殼體:亞基有規(guī)律地沿著中心軸(核酸)呈螺旋排列,進(jìn)而形成高度有序、對(duì)稱的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。螺旋對(duì)稱殼體helicalsymmetry第14頁(yè)/共57頁(yè)二十面體對(duì)稱殼體:蛋白質(zhì)亞基圍繞具立方對(duì)稱的正多面體的角或邊排列,進(jìn)而形成一個(gè)封閉的蛋白質(zhì)的鞘。腺病毒二十面體對(duì)稱殼體icosahedralsymmetry第15頁(yè)/共57頁(yè)有尾噬菌體(tailedphage)的殼體由頭部和尾部組成。包裝有病毒核酸的頭部通常呈二十面體對(duì)稱,尾部呈螺旋對(duì)稱。雙對(duì)稱結(jié)構(gòu)Bisymmetry第16頁(yè)/共57頁(yè)

僅由核衣殼構(gòu)成的病毒稱作裸露病毒(nakedvirus)。有些病毒核衣殼包裹著的一層脂蛋白膜,它是病毒以出芽方式成熟時(shí),由細(xì)胞膜衍生而來(lái)的,有維系毒粒結(jié)構(gòu),保護(hù)病毒核殼的作用。病毒的包膜糖蛋白具有多種生物學(xué)活性,是啟動(dòng)病毒感染所必需的。有包膜的病毒(envelopedvirus)(2)包膜(envelop)第17頁(yè)/共57頁(yè)裸露的二十面體毒粒;裸露的螺旋毒粒;有包膜的二十面體毒粒;有包膜的螺旋毒粒;不同病毒的毒粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度有很大的區(qū)別;有些病毒,如有尾噬菌體、痘病毒等結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,不包括在這些結(jié)構(gòu)類型之內(nèi)。(3)毒粒的結(jié)構(gòu)類型(typesofvirusparticle)第18頁(yè)/共57頁(yè)有包膜的二十面體毒粒裸露的二十面體毒粒第19頁(yè)/共57頁(yè)裸露的螺旋毒粒有包膜的螺旋毒粒第20頁(yè)/共57頁(yè)complexviruses痘苗病毒(vacciniavirus)在病毒中體積最大,在光學(xué)顯微鏡下勉強(qiáng)可見(jiàn)。有尾噬菌體第21頁(yè)/共57頁(yè)毒粒virusparticle碳水化合物(carbohydrate)病毒顆粒在化學(xué)上表現(xiàn)為核蛋白3、毒粒的化學(xué)組成(chemicalcomposition)核酸(nucleicacid)蛋白質(zhì)(protein)脂類(lipid)基本化學(xué)組成第22頁(yè)/共57頁(yè)核酸是病毒的遺傳物質(zhì);一種病毒的毒粒只含有一種核酸:DNA或RNA;核酸存在的狀態(tài)可以是雙鏈或單鏈、線狀或環(huán)狀。病毒核酸單鏈DNA(ssDNA):線狀或環(huán)狀雙鏈DNA(dsDNA):線狀或環(huán)狀單鏈RNA(ssRNA):線狀雙鏈RNA(dsRNA):線狀(1)病毒的核酸(nucleicacidofvirus)第23頁(yè)/共57頁(yè)(2)病毒的蛋白質(zhì)(proteinofvirus)病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白非結(jié)構(gòu)蛋白病毒基因組編碼的,在病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生并具有一定功能,但并不結(jié)合于毒粒中的蛋白質(zhì)。構(gòu)成一個(gè)形態(tài)成熟的有感染性的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì)。殼體蛋白、包膜蛋白、存在于毒粒中的酶。第24頁(yè)/共57頁(yè)病毒粒子無(wú)法用光學(xué)顯微鏡觀察,但當(dāng)它們大量聚集并使宿主細(xì)胞發(fā)生病變時(shí),就形成了具有一定形態(tài)、構(gòu)造并能用光鏡甚至肉眼觀察和識(shí)別的特殊群體,如包涵體(inclusionbody)、噬菌斑(plaque)、空斑(plaque)、枯斑(lesion)。4、病毒的群體形態(tài)第25頁(yè)/共57頁(yè)五、病毒的繁殖(Multiplication)病毒感染敏感宿主細(xì)胞后,病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞,通過(guò)其復(fù)制與表達(dá)產(chǎn)生子代病毒基因組和新的蛋白質(zhì),然后由這些新合成的病毒組分裝配成子代毒粒,并以一定方式釋放到細(xì)胞外。病毒的這種特殊繁殖方式稱做復(fù)制(replication)。第26頁(yè)/共57頁(yè)噬菌體的繁殖一般分為5個(gè)階段:吸附;侵入;增殖;裝配;釋放;1、烈性噬菌體的增殖周期

(productivecycle)凡是能在短時(shí)間內(nèi)連續(xù)完成以上5個(gè)階段而實(shí)現(xiàn)其繁殖的噬菌體,稱為烈性噬菌體(virulentphage),反之稱為溫和噬菌體(temperatephage)。烈性噬菌體的繁殖過(guò)程也叫裂解性周期(lyticcycle)。第27頁(yè)/共57頁(yè)(1)吸附(adsorption,attachment)毒粒敏感細(xì)胞隨機(jī)碰撞而接觸無(wú)特異性,可逆病毒表面蛋白與細(xì)胞受體結(jié)合特異性,不可逆第28頁(yè)/共57頁(yè)(2)侵入(penetration,injection)有尾噬菌體以注射方式使噬菌體核酸侵入細(xì)胞:尾絲收縮;基板使尾鞘蛋白亞基移位、收縮;尾管插入細(xì)胞并釋放溶菌酶;頭部的核酸通過(guò)尾管進(jìn)入細(xì)胞。第29頁(yè)/共57頁(yè)(3)增殖(replication)包括核酸和蛋白質(zhì)的生物合成:噬菌體以核酸中的遺傳信息向宿主細(xì)胞發(fā)出指令并提供“藍(lán)圖”,使宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)按嚴(yán)密的時(shí)序性轉(zhuǎn)向合成噬菌體的組分。第30頁(yè)/共57頁(yè)T4噬菌體的時(shí)序性生物合成第31頁(yè)/共57頁(yè)(4)裝配(maturity)新合成的毒粒結(jié)構(gòu)組分組裝成完整的病毒顆粒,稱做病毒的裝配,亦稱成熟。第32頁(yè)/共57頁(yè)(5)釋放(release)當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)的大量子代噬菌體成熟后,由于脂肪酶和溶菌酶等的作用,細(xì)胞裂解,子代噬菌體釋放。第33頁(yè)/共57頁(yè)第34頁(yè)/共57頁(yè)2、噬菌體的效價(jià)(titer)

效價(jià):每毫升試樣中所含有的具有侵染性的噬菌體粒子數(shù),又稱噬菌斑形成單位數(shù)(plaque-formingunit,pfu)。測(cè)定效價(jià)常用雙層平板法(twolayerplatingmethod)。第35頁(yè)/共57頁(yè)3、一步生長(zhǎng)曲線(onestepgrowthcurve)定量描述烈性噬菌體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線稱為一步生長(zhǎng)曲線。一步生長(zhǎng)曲線反映了每種噬菌體的3個(gè)最重要的特征參數(shù):潛伏期(latentphase)、裂解期(risephase)和裂解量(burstsize)。第36頁(yè)/共57頁(yè)自病毒在受染細(xì)胞內(nèi)消失到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)新的感染性病毒的時(shí)間為為隱蔽期(eclipsephase)。潛伏后期,胞內(nèi)出現(xiàn)了感染性病毒,為胞內(nèi)積累期(intracellularaccumulationphase)。(1)潛伏期(latentphase)第37頁(yè)/共57頁(yè)(2)裂解期(risephase)病毒粒子只有個(gè)體裝配而沒(méi)有個(gè)體生長(zhǎng),再加上宿主細(xì)胞裂解的突發(fā)性,理論上裂解期是瞬時(shí)出現(xiàn)的,但事實(shí)上由于群體細(xì)胞中各個(gè)細(xì)胞的裂解并不同步,所以出現(xiàn)了較長(zhǎng)的裂解期。第38頁(yè)/共57頁(yè)(3)平穩(wěn)期(plateau)指感染后宿主細(xì)胞已全部裂解,溶液中噬菌體效價(jià)達(dá)到最高點(diǎn)的時(shí)期。平均每一宿主細(xì)胞裂解后產(chǎn)生的子代噬菌體數(shù)稱為裂解量(burstsize)。第39頁(yè)/共57頁(yè)溫和噬菌體(temperatephage)侵入相應(yīng)宿主細(xì)胞后,基因組整合到宿主基因組上,并隨宿主的復(fù)制而進(jìn)行同步復(fù)制,因此,這種溫和噬菌體的侵入并不引起宿主細(xì)胞裂解,稱為溶源性或溶源現(xiàn)象。4、溫和噬菌體的溶源性反應(yīng)(lysogenyoftemperatephage)第40頁(yè)/共57頁(yè)溫和噬菌體的生活史第41頁(yè)/共57頁(yè)二元培養(yǎng)物法六、病毒的培養(yǎng)和純化

(Culturingandpurification)1、培養(yǎng)(culturing)噬菌體細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板細(xì)菌培養(yǎng)液變清亮細(xì)菌平板成為殘跡平板第42頁(yè)/共57頁(yè)出現(xiàn)病變出現(xiàn)痘皰細(xì)胞聚集、出現(xiàn)空斑動(dòng)物病毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雞胚多種細(xì)胞培養(yǎng)第43頁(yè)/共57頁(yè)植物病毒敏感植物葉片產(chǎn)生壞死斑,或稱枯斑第44頁(yè)/共57頁(yè)(1)標(biāo)準(zhǔn)(standards)純化的病毒制備物應(yīng)保持其感染性病毒是有感染性的生物體病毒具有化學(xué)大分子的屬性純化的病毒制備物的理化性質(zhì)應(yīng)具有均一性2、病毒純化(purification)第45頁(yè)/共57頁(yè)蛋白質(zhì)提純方法鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等(2)方法(methods)主要化學(xué)組成為蛋白質(zhì)具有一定的大小、形狀和密度差速離心梯度離心第46頁(yè)/共57頁(yè)Chapter4—2–亞病毒(Subvirus)凡在核酸和蛋白質(zhì)兩種成分中,只含其中之一的分子病原體,稱為亞病毒,包括類病毒(Viroid)、擬病毒(Virusoid)和朊病毒(Prion)3類。第47頁(yè)/共57頁(yè)一、類病毒(Viroid)類病毒是當(dāng)今所知道的最小、只含RNA一種成分及專性細(xì)胞內(nèi)寄生的分子生物。1971年首次報(bào)道,引起馬鈴薯紡錘形塊莖病。第48頁(yè)/共57頁(yè)二、擬病毒(Virusoid)擬病毒又稱類類病毒或病毒的病毒,它是一些必須依賴輔助病毒才能復(fù)制的小分子單鏈RNA片段,它被包裝在輔助病毒的殼體中,本身對(duì)于輔助病毒的復(fù)制不是必需的,而且它與輔助病毒的基因組無(wú)明顯的同源性。第49頁(yè)/共57頁(yè)三、朊病毒(Prion)朊病毒又稱“普列昂”或蛋白質(zhì)侵染因子。據(jù)目前所知,朊病毒是一類能侵染動(dòng)物并在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的小分子無(wú)免疫性疏水蛋白質(zhì)。朊病毒在電子顯微鏡下呈桿狀顆粒,直徑25nm,長(zhǎng)100~200nm。桿狀顆粒不單獨(dú)存在,總是呈叢狀排列,每叢大小和形狀不一,多時(shí)可含100個(gè)。第50頁(yè)/共57頁(yè)Chapter4—3–病毒與實(shí)踐噬菌體與發(fā)酵工業(yè)昆蟲(chóng)病毒與生物防治病毒與基因工程第51頁(yè)/共57頁(yè)發(fā)酵液受噬菌體污染的實(shí)例

丙酮丁醇連續(xù)發(fā)酵異常時(shí),發(fā)酵停止,不產(chǎn)生氣泡,醪液上層澄清,呈暗黑色,出現(xiàn)睡眠癥。正常發(fā)酵12-18小時(shí),丙酮產(chǎn)量可達(dá)200mg/L,異常發(fā)酵時(shí)達(dá)到相同水平則需36-42小時(shí),丁醇量也偏低,醪液的蒸餾效率低于正常的10-20%。

紅霉素發(fā)酵液污染噬菌體后,往往在數(shù)小時(shí)至十幾小時(shí)突然出現(xiàn)發(fā)酵液變稀,氨態(tài)氮上升,pH

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