化學(xué)酶工程的學(xué)習(xí)資料

化學(xué)酶工程的學(xué)習(xí)資料第1頁/共68頁第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾游離酶缺點：抗原性；穩(wěn)定性差；活性不夠高。第五章化學(xué)酶工程第2頁/共68頁廣義：凡是通過化學(xué)的方法和手段或是通過化學(xué)反應(yīng)使酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的技術(shù)或過程，都可稱為酶的化學(xué)修飾。狹義：酶的化學(xué)修飾則主要是指在較溫和的條件下，以可控的方式使酶同某些化學(xué)試劑發(fā)生特異反應(yīng)，從而引起單個氨基酸殘基或其功能基團發(fā)生共價的化學(xué)改變的過程。定義第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第3頁/共68頁酶化學(xué)修飾的目的：人為地改變天然酶的一些性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的某些優(yōu)良特性甚至創(chuàng)造出新的特性，擴大酶的應(yīng)用領(lǐng)域。酶化學(xué)修飾后的變化：改變活性部位的構(gòu)象。提高生物活性。增強酶的穩(wěn)定性。降低酶類藥物的抗原性。改變酶學(xué)性質(zhì)。第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第4頁/共68頁酶化學(xué)修飾的原理利用化學(xué)修飾劑所具有的各種基團的特性，直接或間接地經(jīng)過一定的活化過程與酶分子的某種氨基酸殘基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。被修飾酶。修飾劑的選擇。修飾反應(yīng)條件的選擇。第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾考慮因素第5頁/共68頁酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾酶分子表面的化學(xué)修飾方法及修飾劑第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第6頁/共68頁采用一些可溶性的大分子物質(zhì)通過共價鍵將其連接到酶分子的的表面，使之在酶表面形成覆蓋層，從而使酶的性質(zhì)發(fā)生改變，以滿足人們的需要。常用的大分子修飾劑：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。常見的修飾方法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、疊氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面的化學(xué)修飾第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第7頁/共68頁酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾酶蛋白的側(cè)鏈主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。側(cè)鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第8頁/共68頁氨基的化學(xué)修飾（賴氨酸）①②乙酸酐2,4,6—三硝基苯磺酸第9頁/共68頁③④2,4—二硝基氟苯碘乙酸氨基的化學(xué)修飾（賴氨酸）酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾第10頁/共68頁⑤⑥丹璜酰氯氨基的化學(xué)修飾（賴氨酸）酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾第11頁/共68頁羧基的化學(xué)修飾（谷氨酸、天冬氨酸）①②③碳二亞胺硼氟化三甲烊鹽第12頁/共68頁巰基的化學(xué)修飾（半胱氨酸）①②③5,5/-二硫代–雙（2-硝基苯甲酸）4,4/-二硫二吡啶對氯汞苯甲酸第13頁/共68頁⑤④N-乙基馬來酰亞胺2-氯汞-4-硝基苯酚巰基的化學(xué)修飾（半胱氨酸）第14頁/共68頁組氨酸咪唑基的化學(xué)修飾①②碘乙酸焦碳酸二乙酯酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾第15頁/共68頁精氨酸胍基的化學(xué)修飾①②丁二酮1,2-環(huán)己二酮丁二酮1,2-環(huán)己二酮第16頁/共68頁③苯乙二醛精氨酸胍基的化學(xué)修飾酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾第17頁/共68頁色氨酸吲哚基的化學(xué)修飾①②2

–羥基–5-硝基芐溴4-硝基苯硫氯第18頁/共68頁酪氨酸殘基和脂肪族氨基酸殘基羥基的化學(xué)修飾①②N-乙酰咪唑酶分子側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾第19頁/共68頁④絲氨酸殘基-----二異丙基氟磷酸酯③四硝基甲烷酪氨酸殘基和脂肪族氨基酸殘基羥基的化學(xué)修飾第20頁/共68頁甲硫氨酸殘基的化學(xué)修飾①②③甲硫氨酸亞砜過甲酸碘乙酰胺第21頁/共68頁第22頁/共68頁采用一些可溶性的大分子物質(zhì)通過共價鍵將其連接到酶分子的的表面，使之在酶表面形成覆蓋層，從而使酶的性質(zhì)發(fā)生改變，以滿足人們的需要。常用的大分子修飾劑：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。常見的修飾方法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、疊氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面的化學(xué)修飾第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第23頁/共68頁聚乙二醇對酶的修飾（單甲氧基聚乙二醇—MPEG）MPEG均三嗪類衍生物MPEG1MPEG2第24頁/共68頁聚乙二醇對酶的修飾（單甲氧基聚乙二醇—MPEG）第25頁/共68頁MPEG氨基類衍生物蜂巢型MPEG聚乙二醇對酶的修飾（單甲氧基聚乙二醇—MPEG）第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第26頁/共68頁右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯對酶的修飾右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯分子中多糖鏈上的羥基經(jīng)活化后可與酶分子上的氨基結(jié)合。（右旋糖酐）第27頁/共68頁羥基活化----溴化氰法第28頁/共68頁羥基活化----高碘酸氧化法第29頁/共68頁糖肽對酶的修飾異氰酸法戊二醛法第30頁/共68頁具有生物活性的大分子對酶的修飾肝素是一種含硫酸酯的黏多糖，由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成，平均分子量20000左右。肝素增加酶的穩(wěn)定性，由于肝素在體內(nèi)還具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性，極適合用來修飾血栓溶解酶而增加其療效。第31頁/共68頁碳二亞胺法第32頁/共68頁三氯均嗪法第33頁/共68頁蛋白質(zhì)或其他大分子對酶的修飾修飾劑：人血清白蛋白修飾方法：戊二醛法、羰二亞胺法、活化酯法活化酯法琥珀酸酐第34頁/共68頁影響酶化學(xué)修飾的因素反應(yīng)時間的影響分子量的影響pH對化學(xué)修飾的影響修飾劑與酶的用量之比對修飾效果的影響溫度的影響第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第35頁/共68頁修飾酶的性質(zhì)修飾酶的穩(wěn)定性得到提高---熱穩(wěn)定性、耐蛋白水解酶穩(wěn)定性。修飾酶的抗原性得到降低---PEG和人血清白蛋白效果明顯。修飾酶的半衰期得到延長---保持藥用酶的體內(nèi)療效修飾酶的最適pH變化---在生理和臨床應(yīng)用上具有重要意義。修飾酶的動力學(xué)性質(zhì)---Vmax沒有變化，有些Km會增大。第一節(jié)酶分子的化學(xué)修飾第36頁/共68頁概述模擬天然酶（生物酶）的結(jié)構(gòu)、特性、作用原理及其在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過程，人工合成的具有分子識別和催化能力的化合物質(zhì)，稱為模擬酶天然酶的缺點：很容易受到多種物理、化學(xué)及生物影響而失活。第二節(jié)模擬酶第37頁/共68頁目前模擬酶的研究方向：模擬酶的金屬輔基。模擬酶的活性功能基。模擬酶的高分子作用方式。模擬酶與底物的作用。模擬酶的性狀。第二節(jié)模擬酶第38頁/共68頁酶學(xué)基礎(chǔ)：Pauling的穩(wěn)定過渡態(tài)理論酶先結(jié)合底物，進而選擇性地讓底物穩(wěn)定處于某一特定反應(yīng)的過渡態(tài)，降低反應(yīng)的活化能，從而加速反應(yīng)速度。模擬酶的理論基礎(chǔ)：第二節(jié)模擬酶第39頁/共68頁超分子化學(xué)基礎(chǔ)---Pederson、Cram、Lehn提出：超分子的形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價鍵相互作用，如靜電作用、氫鍵和范德華力等。模擬酶的理論基礎(chǔ)：第二節(jié)模擬酶第40頁/共68頁模擬酶的分類主-客體酶模型，包括環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物分子印跡酶抗體酶膠束酶模型肽酶半合成酶。根據(jù)模擬酶的屬性可分為：第二節(jié)模擬酶第41頁/共68頁環(huán)糊精是直鏈淀粉在芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，通常含有6~12個D-吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精中各葡萄糖單元均以1,4糖苷鍵結(jié)合成環(huán)，空間結(jié)構(gòu)呈錐形圓環(huán)。環(huán)糊精外緣親水而內(nèi)腔疏水，因此能像酶一樣提供一個疏水的結(jié)合部位。環(huán)糊精模擬酶第二節(jié)模擬酶第42頁/共68頁環(huán)糊精葡萄糖單元的數(shù)量不同可分為α(6個)，β(7個)及γ(8個)環(huán)糊精三種，每個葡萄糖殘基均呈現(xiàn)無扭曲變形的椅式構(gòu)象，葡萄糖單元均以1,4糖苷鍵結(jié)合成環(huán)，內(nèi)有空穴，疏水。外緣親水第43頁/共68頁環(huán)糊精模擬酶所具有的催化作用（活性）：水解酶活性核酸酶活性轉(zhuǎn)氨酶活性橋聯(lián)歡糊精仿酶—氧化和水解酶活性

環(huán)糊精模擬酶第二節(jié)模擬酶第44頁/共68頁大環(huán)聚醚按結(jié)構(gòu)可分為：冠醚、穴醚、球醚。冠醚是指含雜原子的單環(huán)化合物，穴醚是指含雜原子的雙環(huán)化合物，球醚是指含有雜原子的球狀大環(huán)醚。大環(huán)聚醚模擬酶的活性：水解酶活性肽合成酶活性大環(huán)聚醚及其模擬酶第二節(jié)模擬酶Lehn第45頁/共68頁杯芳烴是由苯酚及其衍生物與甲醛縮合而成，分子上緣由苯環(huán)的對位取代基組成，下緣緊密排列著酚羥基，中間是苯環(huán)構(gòu)成的富含π電子的疏水空腔，其上緣親油，下緣親水，可與中性分子和極性離子等多種物質(zhì)結(jié)合。模擬水解酶活性。杯芳烴及其模擬酶第二節(jié)模擬酶第46頁/共68頁金屬卟啉可以模擬以金屬離子為輔基或輔酶的天然酶。卟啉是含有四個吡咯分子的大環(huán)聚合物，主要骨架是卟吩。金屬卟啉分子具有以共軛大π電子體系，金屬原子價改變?yōu)榛A(chǔ)的氧化還原性質(zhì)，因而可作為與分子氧有關(guān)的氧化還原酶的模擬酶。金屬卟啉及其模擬酶第二節(jié)模擬酶第47頁/共68頁肽酶是模擬天然酶的活性部位，人工合成的具有催化活性的多肽。環(huán)肽在分子識別方面更具有優(yōu)勢。肽酶1977年人工合成的八肽Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe具有溶菌酶(lysozyme)活性，其活力可達到天然酶的50%。第二節(jié)模擬酶第48頁/共68頁抗體酶的催化特性具有催化化學(xué)反應(yīng)能力的單克隆抗體，稱為抗體酶，又稱為催化性抗體。抗體酶的理論基礎(chǔ)及研究背景酶的催化機制：過渡態(tài)理論。（1946，Pauling）免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生底物過渡態(tài)的抗體，抗體具有催化性能（1969，Jencks）單克隆抗體技術(shù)發(fā)展。（1975，Kohler,Milstein）第一個催化酯水解的抗體酶。（1986，Lerner,Schultz）第三節(jié)抗體酶第49頁/共68頁抗體酶的特點能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)有更高的專一性和穩(wěn)定性催化作用機制不同?？贵w酶和非催化抗體作用的比較反應(yīng)的特異性反應(yīng)的可逆性反應(yīng)的量效關(guān)系反應(yīng)過程。第三節(jié)抗體酶第50頁/共68頁抗體酶的催化作用機制過渡態(tài)理論抗體酶的催化反應(yīng)類型轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)磷酸酯水解反應(yīng)磺酸酯閉環(huán)反應(yīng)Claisen重排反應(yīng)脫羧反應(yīng)金屬螯合反應(yīng)第三節(jié)抗體酶第51頁/共68頁抗體酶的制備原則利用某一反應(yīng)過渡態(tài)的類似物作為免疫原，則可誘導(dǎo)得到催化該反應(yīng)的抗體酶。過渡態(tài)類似物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可化學(xué)合成。目前制備抗體酶的主要步驟：根據(jù)催化目的，通過化學(xué)反應(yīng)合成模型化合物（過渡態(tài)類似物），并與載體蛋白偶聯(lián)成人工抗原，制備具有催化活性的單克隆抗體?？乖脑O(shè)計是制備抗體酶的關(guān)鍵。策略：利用抗體穩(wěn)定帶電過渡態(tài)抗體作為熵阱抗體靜電互補效應(yīng)第三節(jié)抗體酶第52頁/共68頁目前制備抗體酶的主要方法：根據(jù)催化目的，通過化學(xué)反應(yīng)合成模型化合物（過渡態(tài)類似物），并與載體蛋白偶聯(lián)成人工抗原，制備具有催化活性的單克隆抗體?？截惙ɑ瘜W(xué)誘變法。蛋白質(zhì)工程技術(shù)。相似分子誘導(dǎo)法。共價抗原免疫法。抗體酶的制備方法第三節(jié)抗體酶第53頁/共68頁利用過渡態(tài)類似物制備抗體酶抗體酶的制備方法第三節(jié)抗體酶第54頁/共68頁使不可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)稱為可能。使苛刻條件下的化學(xué)反應(yīng)在溫和條件下實現(xiàn)。選擇性的催化平行反應(yīng)中的某一反應(yīng)。制備蛋白質(zhì)氨基酸序列快速分析的抗體酶。制備水解病毒蛋白的抗體酶。指導(dǎo)未知酶的尋找。為化學(xué)反應(yīng)的機理研究提供依據(jù)。抗體酶的應(yīng)用前景第三節(jié)抗體酶第55頁/共68頁分子印跡的原理以一種分子作為模板，在其周圍用聚合物交聯(lián)，當除去該分子時，聚合物中間留下與該分子形狀相同的空穴，這種空穴就有可能對該分子具有選擇性識別結(jié)合的能力。該化合物分子叫印跡分子，也叫模板分子。聚合物稱為分子印跡聚合物。制備對某一化合物分子具有選擇性識別結(jié)合的聚合物的過程稱為分子印跡（技術(shù)）第四節(jié)印跡酶第56頁/共68頁分子印跡的原理第四節(jié)印跡酶第57頁/共68頁選定印跡分子和功能性單體，使二者發(fā)生互補反應(yīng)；在印跡分子—功能性單體復(fù)合物周圍發(fā)生交聯(lián)聚合；用抽提法從聚合物中除掉印跡分子。分子印跡技術(shù)的一般過程：第四節(jié)印跡酶第58頁/共68頁分子印跡技術(shù)的分類預(yù)組織法又稱共價法。印跡分子先通過共價鍵與功能性單體結(jié)合，聚合后再將共價鍵斷裂除去印跡分子。功能單體：含有乙烯基的硼酸、醛、胺、酚、醇等。共價化合物：硼酸酯、亞胺、希夫堿、縮醛酮等。特點：結(jié)合基團定位精確，對印跡分子選擇性高；共價鍵結(jié)合較牢固，對印跡分子的識別和解離較慢。第四節(jié)印跡酶第59頁/共68頁又稱非共價法。印跡分子與功能性單體自組織排列，以非共價鍵自發(fā)形成具有多個作用位點的復(fù)合物。功能單體：丙烯酸、丙烯酰胺、含有乙烯基的苯甲酸、苯乙酸、咪唑和吡啶類化合物。甲基丙烯酸特點：操作簡單易行，印跡分子易除去，分子識別過程更接近天然的分子識別系統(tǒng)，可同時采用多種功能單體，增加印跡效果；功能單體過量，選擇性下降。分子印跡技術(shù)的分類自組裝法第四節(jié)印跡酶第60頁/共68頁聚合時，印跡分子與功能基團共價結(jié)合。識別時，印跡分子與功能基團非共價結(jié)合。金屬離子配位方法印跡分子-金屬離子-功能單體三維復(fù)合物進行交聯(lián)聚合。金屬配位作用的強度可通過EDTA簡單變換金屬離子的種類