副溶血性弧菌

副溶血性弧菌第1頁/共19頁第七節(jié)、副溶血性弧菌檢驗一、生物學(xué)特性1、形態(tài)與染色

革蘭氏陰性無芽胞多形態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌

，有時呈棒狀、甚至球狀、絲狀等。一般兩極濃染。單端鞭毛，長度約為菌體的2倍，運動活潑。無芽胞、無莢膜。第2頁/共19頁2、培養(yǎng)特性本菌對營養(yǎng)要求不高，在普通的瓊脂或蛋白胨水中均可生長需氧特別強，在厭氧條件下生長非常緩慢嗜鹽，在2~３%NaCL培養(yǎng)基中生長最好，無鹽或食鹽>10%不能生長。最適溫度36℃，pH7.5~7.8在肉湯、蛋白胨水等培養(yǎng)基中呈現(xiàn)渾濁，表面形成菌膜在固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形凸起，混濁不透明，表面光滑，較濕潤，邊緣不整齊。在血平板上可見溶血環(huán)。

第3頁/共19頁3、生化特性分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖，蔗糖。H2S（－）、V-P（－）、靛基質(zhì)（吲哚試驗）（+）、精氨酸（－）甲基紅（+）、賴氨酸（＋）、溶血＋/-第4頁/共19頁V.P反應(yīng)檢測某種細菌分解碳水化合物產(chǎn)生乙酰甲基甲醇[CH3CH（OH）COCH3]的反應(yīng)。通常把細菌培養(yǎng)在葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中，加入強堿可見顯有紅色。此反應(yīng)用于細菌的鑒別第5頁/共19頁1、吲哚試驗(indoltest)細菌產(chǎn)生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)與試劑對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基質(zhì)。色氨酸→吲哚（無色）＋對二甲基氨基苯甲醛→玫瑰吲哚（紅色，+大腸桿菌）不產(chǎn)吲哚（無色，-產(chǎn)氣桿菌）試驗方法：取培養(yǎng)24h培養(yǎng)液，先加入少量乙醚，搖動試管以提取和濃縮吲哚，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入吲哚試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。應(yīng)用：用于腸道桿菌的鑒定6第6頁/共19頁2、尿素酶（Urease，脲酶）試驗有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。酚紅：黃色→紅色（+普通變形桿菌）黃色（-大腸桿菌）試驗方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖勻，于36±1℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果?；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)24h左右，觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性。7第7頁/共19頁3、氨基酸脫羧酶的測定

有些細菌含有氨基酸脫羧酶，使羧基釋出，生成胺類和二氧化碳。此反應(yīng)在偏酸的條件下進行，當培養(yǎng)基含胺類時呈堿性反應(yīng)，使指示劑變色。

接種與觀察結(jié)果：用幼齡培養(yǎng)液作為菌種，直接接種。接種后封油，對照管與測定管同時接種封油。腸肝菌科的細菌于37℃培養(yǎng)4天觀察。當指示劑（溴甲酚紫）呈紫色或帶紅色調(diào)的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。對照管應(yīng)呈黃色反應(yīng)。8第8頁/共19頁4、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基：乳糖：蔗糖：葡萄糖=10：10：1；加有酚紅本試驗可同時觀察糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。只能利用葡萄糖的細菌，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。9第9頁/共19頁O抗原（菌體抗原）：O1~O1313種。H抗原（鞭毛抗原）：K抗原（莢膜抗原）：K1~K7165種。（缺編：K2、K14、K17、K35、K62）血清分型：所有副溶血性弧菌的H抗原均相同，但是O抗原和K抗原存在差異，以13種O抗原及65種K抗原將其分為13個群和845個型。4、抗原結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)第10頁/共19頁二、致病性1、致病因素★侵襲力：活菌(105~107/g)，可使人致病.★產(chǎn)生溶血毒素：內(nèi)毒素，成分是脂多糖，100℃30min不被破壞。2、媒介食品

主要是海產(chǎn)品（魚、蝦、蟹、蛤等），含鹽量較高的食物亦可帶菌。3、所致疾病

食物中毒、急性胃腸炎、敗血癥等。

第11頁/共19頁二、致病性4、預(yù)防措施（1）海產(chǎn)品加工前用消毒水沖洗干凈，接觸過海產(chǎn)品的廚具、容器和手及水池等均要洗刷干凈，以免污染食品（2）若要吃涼拌菜應(yīng)充分洗凈，現(xiàn)在沸水中燙后，加醋，放置10min后，再放其他調(diào)味劑（3）嚴格執(zhí)行生熟食品分開制度（4）剩飯菜，在食用前要回鍋熱透

第12頁/共19頁1、檢驗標準：GB/T4789.7-2008副溶血性弧菌檢驗2、培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基：

3％氯化鈉堿性蛋白陳水〔APW)、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂

3％氯化鈉胰蛋白胨大豆〔TSA）瓊脂

3％氯化鈉三糖鐵（TSI

）瓊脂嗜鹽性試驗培養(yǎng)基

3％氯化鈉甘露醇試驗培養(yǎng)基

3％氯化鈉賴氨酸脫狡酶試驗培養(yǎng)基

3％氯化鈉MR-VP

培養(yǎng)基

氯化鈉結(jié)晶紫增菌液試劑：氧化酶試劑、革蘭氏染色液、革蘭氏染色液、3%氯化鈉溶液、

V-P試劑、甲基紅試劑、靛基質(zhì)試劑等。三、檢驗方法第13頁/共19頁3、檢驗程序（1）樣品處理及培養(yǎng)定量測定：樣品用3%氯化鈉蛋白胨水10倍連續(xù)稀釋后取三個稀釋度各接3支含有該培養(yǎng)基的平皿，培養(yǎng)計數(shù)。定性試驗（2）分離培養(yǎng)：首先將樣品接種到氯化鈉瓊脂平板和ss瓊脂平板各一個，培養(yǎng)18-24h觀察。也可增菌液直接分離。（3）可以菌落培養(yǎng)：挑取上述可疑菌落，轉(zhuǎn)種3.5%氯化鈉三糖鐵斜面，觀察結(jié)果（下部變黃，有動力，不產(chǎn)H2S）（4）涂片鏡檢：挑取可疑培養(yǎng)物鏡檢。（5）嗜鹽性試驗：將上述培養(yǎng)物接種無鹽胨水、7%、11%氯化鈉胨水。（6）生化試驗：V-P、靛基質(zhì)、甲基紅試驗等（7）動物實驗：（選做）第14頁/共19頁初步鑒定：

挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，進行副溶血性弧菌的初步鑒定：副溶血性弧菌：氧化酶試驗：陽性。涂片鏡檢：G-，棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛。3％氯化鈉三糖鐵斜面：底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動力。嗜鹽性試驗：分別接種于不同氯化鈉濃度的胰胨水中培養(yǎng)，在無氯化鈉和10％氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在7％氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。第15頁/共19頁生化試驗：分別接種各類生化培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察結(jié)果?；駻PI

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生化鑒定試劑盒或VITEK全自動微生物檢測系統(tǒng)鑒定。生化性狀符合下表要求時，為副溶血性弧菌。確定鑒定:項目結(jié)果項目結(jié)果革蘭氏染色鏡檢陰性，無芽孢乳糖－氧化酶＋硫化氫－動力＋賴氨酸脫梭酶＋蔗糖－V-P－葡萄糖＋ONPG－甘露醇＋分解葡萄糖產(chǎn)氣－

表副溶血性弧菌的生化性狀第