新生兒溶血病實驗室檢查 新生兒血清學(xué)“三項試驗”

臨床輸血檢驗技術(shù)

教學(xué)培訓(xùn)課件新生兒血清學(xué)“三項試驗”1.掌握新生兒血清學(xué)“三項試驗”試驗原理2.熟悉新生兒溶血“三項試驗”操作步驟3.了解新生兒溶血“三項試驗”臨床意義學(xué)習(xí)要求直接抗人球蛋白試驗在鹽水介質(zhì)中，不完全抗體可以致敏人紅細胞，但不能讓紅細胞凝集。加入抗人球蛋白試劑后，抗人球蛋白分子Fab段能與包被在紅細胞上球蛋白分子的Fc段結(jié)合，借助其橋梁作用，從而使已被不完全抗體致敏的紅細胞出現(xiàn)凝集，而未被抗體包被的紅細胞則不出現(xiàn)凝集。原理【直接檢測新生兒紅細胞上是否被不完全抗體所致敏】直接抗人球蛋白試驗器材與試劑【器材】試管架、試管、記號筆、微量加樣器、37℃水浴箱、塑料吸管、離心機、顯微鏡、玻片、微柱凝膠孵育器、微柱凝膠離心機【試劑】多特異抗人球蛋白試劑或抗IgG和抗C3d單價抗球蛋白血清、IgG抗D致敏的2%~5%RhD陽性紅細胞懸液、2%~5%正常人紅細胞懸液和生理鹽水、Coombs微柱凝膠卡等。直接抗人球蛋白試驗操作（試管法）取受檢者紅細胞用生理鹽水洗滌3次，最后一次洗滌后將上清液棄去，再用濾紙將管口附著的上清液吸盡，配成5%紅細胞懸液。1取小試管3支，分別標明被檢管、陽性對照、陰性對照2被檢管加受檢者5%紅細胞懸液1滴，陽性對照管加IgG抗D致敏的2%~5%RhD陽性紅細胞懸液，陰性管加2%~5%正常人紅細胞懸液1滴3在3管中分別加抗多特異性球蛋白試劑1滴，混勻后以1000g離心15s.4配制5%懸紅標記試管加樣加抗人球試劑直接抗人球蛋白試驗操作（試管法）輕晃試管，先用肉眼觀察有無凝集，然后在顯微鏡下觀察確認。鏡下顯示3個及其以上紅細胞堆積在一起，并均勻分布在游離紅細胞中為陽性，無凝集為陰性。5陽性對照管凝集，陰性對照管不凝集，受檢紅細胞凝集者為直接抗人球蛋白試驗抗陽性，不凝集者為陰性。6陽性者應(yīng)繼續(xù)用單特異性抗球蛋白血清檢測，方法同多特異性抗球蛋白試劑。7結(jié)果觀察結(jié)果判斷單特異性檢測直接抗人球蛋白試驗操作（微柱凝膠法）將受檢者紅細胞、陽性對照紅細胞和正常人RhD陽性對照紅細胞配制0.8%紅細胞懸液取出Coombs微柱凝膠卡，標記檢測孔、陽性孔和陰性孔在三孔中分別加入多特異性球蛋白試劑50ul分別取0.8%待檢者紅細胞、0.8%陽性對照紅細胞、0.8%正常人紅細胞懸液各50ul分別加入檢測孔、陽性孔和陰性孔。將加好的凝膠卡置于微柱凝膠孵育器內(nèi)，37℃孵育15min.將孵育好的凝膠卡置于微柱凝膠離心機內(nèi)，1000r/min離心10min取出微柱凝膠卡觀察結(jié)果直接抗人球蛋白試驗操作（微柱凝膠法）直接抗人球蛋白試驗質(zhì)量控制1.要證實直抗試驗陽性不是補體體外致敏結(jié)果，用EDTA抗凝標本，抗凝后立即試驗，以免放置過久造成假陽性結(jié)果。若懷疑冷抗體引起DAT陽性，標本凝固應(yīng)保持在37℃，直至血清分離出來。2.每次試驗都必須設(shè)立陰性和陽性對照。被污染、全凝集或冷凝集均可出現(xiàn)假陽性。3.標本若為直抗陽性需區(qū)別直抗類型，即用單特異性IgG抗體、C3d抗體重復(fù)上述操作以鑒別致敏在細胞上免疫分子種類。4.Rh新生兒溶血病的直抗結(jié)果都相對強，一般≧2+。而ABO新生兒溶血病的直抗呈弱陽性甚至陰性。因此新生兒直抗強弱是區(qū)別ABO和Rh-HDN的主要標志。血漿游離抗體試驗原理用新生兒血清加上A、B型紅細胞懸液，做酶法及間接抗人球蛋白試驗，并以此試驗來驗證新生兒血清中是否存在與其紅細胞不配合的IgG抗A或抗B，這些來自于母親的IgG抗體可與新生兒紅細胞結(jié)合，嬰兒可能受害，引起新生兒溶血病。血漿游離抗體試驗操作（試管法）1取靜脈血3~5ml,離心分離血清備用。2取3支試管，分別標記Ac、Bc、Oc管。3于每支試管中各加入待檢血清2滴，在相應(yīng)標記管中分別加入5%A、B、O型試劑紅細胞懸液各1滴，混勻，37℃致敏30min4以1000g離心15s，肉眼或顯微鏡觀察凝集結(jié)果并記錄。若某管出現(xiàn)凝集，說明該管有相應(yīng)鹽水抗體，不必繼續(xù)操作5若無凝集，用生理鹽水洗滌3次后，加入多特異抗球蛋白1滴，以3400r/min離心15s，肉眼及顯微鏡下觀察凝集結(jié)果血漿游離抗體試驗操作（微柱凝膠法）A取靜脈血3~5ml,離心分離血清備用。B取Coombs凝膠卡一張，用筆在相鄰3孔下面標記Ac、Bc、OcC于每孔中加50ul待檢血清，在相應(yīng)標記孔加入Ac、Bc、Oc試劑紅細胞，陰性及陽性對照紅細胞各50ulD將加樣完畢的Coombs卡放入微柱凝膠卡孵育器內(nèi)，37℃孵育15minE將孵育好的Coombs微柱凝膠卡放入微柱凝膠離心機內(nèi)1000r/min離心10min,取出Coombs微柱凝膠卡，觀察并記錄結(jié)果。血漿游離抗體試驗檢測意義指示紅細胞意義AcBcOc+---+-++-+/-+/-+---游離的抗-A游離的抗-B游離的抗-A、抗-B或者抗-AB游離的ABO系統(tǒng)以外抗體無游離抗體血漿游離抗體試驗質(zhì)量控制1.微柱凝膠卡式法檢測血清游離抗體時應(yīng)根據(jù)說明書配制紅細胞懸液濃度。2.游離試驗陽性常發(fā)生在新生兒溶血病早期或病情嚴重時，應(yīng)在出生后3-7天內(nèi)進行檢查，避免致敏紅細胞被破壞導(dǎo)致假陰性結(jié)果。但游離試驗陰性并不說明病情較輕，該試驗在新生兒溶血病檢測中僅起到輔助診斷作用。3.游離抗體陽性必須是可以檢測到能與患兒紅細胞起反應(yīng)的抗體，不依據(jù)患兒血型則無法準確判斷該實驗結(jié)果紅細胞抗體放散試驗放散實驗紅細胞上的抗原與血清中的抗體在適當(dāng)條件下能發(fā)生凝集或致敏，這種反應(yīng)是可逆的，如果改變某些條件，抗體又可以從結(jié)合的細胞上放散下來，再用相應(yīng)紅細胞鑒定放散液內(nèi)抗體的種類，從而進行新生兒溶血病的診斷。常用方法熱放散法冷放散法乙醚放散法紅細胞抗體放散試驗熱放散試驗結(jié)合在紅細胞上的抗體可以用加熱的方式進行分離，然后再進行抗體種類鑒定。用生理鹽水洗滌待檢紅細胞，將離心后形成的壓積紅細胞放入56℃水浴中振搖一定時間后，再高速離心后取上清液（放散液）與已知紅細胞反應(yīng)看是否凝集來鑒定放散液中抗體種類。熱放散試驗1將受檢者紅細胞用生理鹽水洗滌3次，以3000r/min離心5min,棄去上清液。在壓積紅細胞中加入等量生理鹽水，混勻。2將試管置于56℃水浴振蕩箱不斷振搖10min，取出試管，立即以900g-1000g離心2min。3分離上清液置于另一試管中即為放散液4取3支潔凈試管，分別標明Ac、Bc、Oc管，各管加入放散液2滴，然后按標記各管加入相應(yīng)（A、B、O）2%-5%酶處理紅細胞一滴，混勻，37℃水浴30min5孵育后用生理鹽水洗滌3次，棄上清液，各管加入多特異性抗人球蛋白試劑2滴，以1000g離心15s，肉眼觀察結(jié)果熱放散試驗熱放散試驗質(zhì)量控制1.56℃溫度要準確，在加熱時要不斷振蕩試管，使抗體從紅細胞上完全分離下來。溫度過高，抗原抗體變性；溫度過低，已被放散下來的抗體會重新與紅細胞結(jié)合，因此在離心時要使用經(jīng)過預(yù)熱的離心杯。2.制備得到的放散液應(yīng)立即進行鑒定，否則放散液中的抗體容易變性。如果需要保存，應(yīng)在放散液中加入AB型血清或牛血清蛋白。3.最后一次洗滌液中應(yīng)檢查是否有殘存抗體，如果最后一次洗滌液中檢出了殘存抗體，說明洗滌不充分，會影響放散效果。乙醚放散試驗乙醚是種較強的有機溶劑，與紅細胞結(jié)合后破壞溶解紅細胞，使結(jié)合抗體解離下來，再用標準譜紅細胞測定放散液中抗體特異性?？蓹z測吸附于紅細胞上的各種IgG抗體乙醚放散試驗操作將受檢者紅細胞用生理鹽水洗滌3次,以3000r/min離心5min,棄上清液。在壓積紅細胞中加入等體積的生理鹽水和2倍體積的乙醚，用塞子塞緊試管口，充分混勻振搖10minA1000g離心5min，輕輕取出試管，離心后液體分為三層，上層為乙醚層，中間層為紅細胞層，下層為放散液層B將下層深紅色的放散液移至另一試管中，置于37℃孵育30min，除盡乙醚C取另一支試管，加入放散液2滴，再加標準譜紅細胞懸液1滴，37℃孵育30min，充分洗滌后，棄上清液，加入多特異抗人球蛋白血清1滴D1000g離心15s，輕輕取出試管，輕彈試管，肉眼觀察凝集和溶血情況，必要時在顯微鏡下觀察，記錄凝集情況E乙醚放散試驗質(zhì)量控制1.操作過程中應(yīng)注意安全，乙醚為危險化學(xué)試劑，防止放散液溢出。2.與所有標準譜紅細胞均發(fā)生凝集可能由于自身抗體所致。因此，用標準譜紅細胞鑒定放散液中抗體時應(yīng)同時做自身對照試驗。冷放散試驗紅細胞冰凍導(dǎo)致細胞破碎，膜上結(jié)合抗體解離，用標準譜紅細胞鑒定放散液中抗體性質(zhì)。冷放散試驗操作01將受檢者紅細胞用生理鹽水洗滌3次，以3000r/min離心5min，棄上清液，保留壓積紅細胞。03將試管放置平穩(wěn)，置-70℃~-20℃低溫冷凍柜中快速冷凍10min.051000g離心5min,立即將上清液移至另一已標記的試管中，即放散液待用02標記試管，取0.5ml壓積紅細胞，加0.15ml生理鹽水，混勻。塞住試管口，轉(zhuǎn)動試管，使細胞懸液在試管內(nèi)壁形成薄層04取出試管，立即用流動溫水沖洗試管外壁，使紅細胞快速融化。06取潔凈試管3支，分別標明Ac、Bc、Oc管，各管加入放散液2滴，然后按標記各管加入相應(yīng)的2%-5%標準A、B、O紅細胞懸液1滴，混勻，置37℃水浴箱孵育30min07孵育后用生理鹽水洗滌3次，棄上清液，各管加多特異抗人球蛋白試劑2滴，以1000g離心15s，肉眼觀察結(jié)果冷放散試驗質(zhì)量控制1.操作中充分冰凍，獲得更多的放散液2.放散液平均分配在試管中，保證觀察結(jié)果準確。紅細胞抗體放散試驗方法學(xué)評價ABO血型不合的HDN采用熱放散法，由于Rh血型抗體與紅細胞結(jié)合能力較強，熱放散效果不佳Rh血型及其他血型系統(tǒng)HDN通常采用乙醚放散法，乙醚放散試驗所用致敏紅細胞濃度高，所以在“三項試驗”中該試驗敏感度最高新生兒血清學(xué)“三項試驗”臨床應(yīng)用新生兒溶血“三項試驗”直接抗人球蛋白試驗檢查新生兒紅細胞是否已被母親不完全抗體致敏游離抗體試驗檢測新生兒血清中是否有游離的IgG血型抗體放散試驗檢查新生兒