克隆基因的表達(dá)

克隆基因的表達(dá)第1頁/共121頁

原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞所具有的特點(diǎn)：原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析。多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)粒或噬菌體，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)相。內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定。第2頁/共121頁pIJ486是鏈霉菌的質(zhì)粒（如下圖所示），其中neo和tsr分別為新霉素和硫鏈絲菌素的抗性基因。為了準(zhǔn)確克隆并篩選出目的DNA片段的克隆，最為理想的插入位點(diǎn)是？說明其原因？

位點(diǎn)為tsr內(nèi)的EcoRV。當(dāng)外源基因插入EcoRV位點(diǎn)時(shí)，硫鏈絲菌素基因失活。利用新霉素來篩選重組子。第3頁/共121頁怎樣將一個(gè)平末端DNA片段插入到EcoRI限制位點(diǎn)中去?

化學(xué)合成一些長為10bp含有EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用EcoRI切割這種連接片段，就會(huì)產(chǎn)生EcoRI的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何EcoRI的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中。第4頁/共121頁列舉兩種外源基因轉(zhuǎn)化的方法?如何提高其轉(zhuǎn)化效率?CaCl2處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染：低溫和CaCl2處理制備感受態(tài)細(xì)胞，使細(xì)胞膜通透性增加，處于容易捕捉和接受外源DNA的狀態(tài)。電穿孔轉(zhuǎn)化法：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收。質(zhì)粒的大小，拷貝數(shù)；受體細(xì)胞的狀態(tài)；轉(zhuǎn)化的外在條件，如溫度等;質(zhì)粒與宿主菌的比例。第5頁/共121頁建立了一個(gè)基因文庫后，如何鑒定一個(gè)攜帶目的基因的克隆?第6頁/共121頁1基因表達(dá)的機(jī)制1.1外源基因的起始轉(zhuǎn)錄

外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟。選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問題。原核生物啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：組成型啟動(dòng)子：如lac、trp、λPR、λPL、tac等的啟動(dòng)子如T7噬菌體的啟動(dòng)子真核生物啟動(dòng)子也可分為誘導(dǎo)型和組成型等類型。第7頁/共121頁mRNA的延伸與穩(wěn)定外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵。一方面，要防止因轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異性終止而誘發(fā)的mRNA轉(zhuǎn)錄提前終止的現(xiàn)象；另一方面，又要存在正常的轉(zhuǎn)錄終止序列以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使mRNA的長度限制在一定的范圍內(nèi)，從而增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。第8頁/共121頁外源基因mRNA的有效翻譯外源基因mRNA有效翻譯必須考慮的基本原則：AUG(ATG)是首選的起始密碼子。SD序列為與核糖體16SrRNA互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序列至少含有AGGAGG序列中的4個(gè)堿基。SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為3～9個(gè)堿基。在翻譯起始區(qū)周圍序列不易形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。第9頁/共121頁不同基因組使用密碼子具有選擇性。主密碼子（majorcodon）罕用密碼子（rarecodon）如果外源基因mRNA的主密碼子與受體細(xì)胞基因組的主密碼子相同或接近，則該基因表達(dá)的效率就高；反之，若外源基因含有較多的罕用密碼子，其表達(dá)效率就低。第10頁/共121頁1.4表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性避免外源基因表達(dá)蛋白降解的對(duì)策：構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)第11頁/共121頁1.5目的基因沉默基因沉默的作用機(jī)制位置效應(yīng)的基因沉默：轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默：是指基因在基因組中的位置對(duì)其表達(dá)的影響是在DNA水平上的基因調(diào)控是在RNA水平上的基因調(diào)控第12頁/共121頁第七章

克隆基因的表達(dá)基因激活轉(zhuǎn)錄起始mRNA水平蛋白質(zhì)水平第13頁/共121頁克隆基因的表達(dá)第一節(jié)基因表達(dá)的基本過程第二節(jié)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)第三節(jié)外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)第四節(jié)提高外源基因表達(dá)效率的途徑第14頁/共121頁

基因表達(dá)(geneexpression)是指儲(chǔ)存遺傳信息的基因經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個(gè)過程。典型的基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過程。第一節(jié)基因表達(dá)的基本過程第15頁/共121頁基因表達(dá)的基本過程第16頁/共121頁基因表達(dá)的基本過程

基因的表達(dá)主要涉及到兩個(gè)過程：轉(zhuǎn)錄和翻譯。首先，目的基因通過轉(zhuǎn)錄(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；

然后，tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA,transferRNA）將各種氨基酸運(yùn)送到核糖體并按照mRNA的密碼子順序?qū)⒏鞣N氨基酸連接成特定的氨基酸序列(translation)最終得到基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）。第17頁/共121頁基因表達(dá)機(jī)制1.外源基因的起始轉(zhuǎn)錄外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟，轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟。因此，啟動(dòng)子是關(guān)鍵。2.mRNA的延伸和穩(wěn)定性外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵。另外，mRNA的穩(wěn)定性直接決定翻譯產(chǎn)物的多少。第18頁/共121頁思考:基因表達(dá)與克隆基因表達(dá)的異同?表達(dá)的對(duì)象、過程、場所第19頁/共121頁克隆基因的表達(dá)：外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。外源基因表達(dá)載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。第20頁/共121頁第21頁/共121頁基因激活轉(zhuǎn)錄起始mRNA水平蛋白質(zhì)水平第22頁/共121頁原核中表達(dá)真核中表達(dá)外源基因第23頁/共121頁用原核生物作宿主。AdividingE.coli

第一節(jié)

外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)原核或噬菌體啟動(dòng)子MCSSD序列終止子第24頁/共121頁大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物第25頁/共121頁大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素第26頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例原核基因表達(dá)第27頁/共121頁識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有的RNA合成。數(shù)個(gè)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個(gè)表達(dá)的協(xié)同單位。一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)2.以操縱子為單位1.只有一種RNA多聚酶第28頁/共121頁乳糖操縱元（lacoperon）的結(jié)構(gòu)lacIlacZlacYlacA

PlacIPlac

OlacRNADNAlacZlacYlacA

lacI乳糖阻遏物（單體、四聚體）-半乳糖苷酶

滲透酶乙酰轉(zhuǎn)移酶Protein乳糖葡萄糖＋半乳糖

增加乳糖的吸收功能未知第29頁/共121頁有意義鏈5’

反意義鏈3’

轉(zhuǎn)錄mRNA5’

3’

翻譯蛋白質(zhì)NC5’

3’

3.轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行。第30頁/共121頁第31頁/共121頁4.不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。5.調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。

含有一個(gè)啟始密碼子和一段同核糖體16SRNA3’末端堿基互補(bǔ)的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。6.mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)Shine-Dalgarno（S-D）sequence:第32頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例原核基因表達(dá)第33頁/共121頁二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)外源基因不能帶有內(nèi)含子。2.必須用cDNA3.不能直接用真核基因組DNA。4.必須利用原核細(xì)胞的調(diào)控原件（啟動(dòng)子等）5.防止外源基因產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒害。為何？第34頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例原核基因表達(dá)第35頁/共121頁大腸桿菌基因表達(dá)載體基本結(jié)構(gòu)特征三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控第36頁/共121頁是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。

大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensussequence）。

1.啟動(dòng)子-35Box和

-10Box（1）

啟動(dòng)子序列

第37頁/共121頁consensussequences第38頁/共121頁5’-TTGACA-3’

5’-TATAAT-3’

②-10box（PribnowBox）TTGACA

TATAAT

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17bp5’

核糖體結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶

亞基的識(shí)別位點(diǎn)

。①-35box第39頁/共121頁原核啟動(dòng)子共有序列的功能第40頁/共121頁2翻譯的起始位點(diǎn)①核糖體結(jié)合位點(diǎn)（

RBS）1）Shine-Dalgarno（SD）

sequence：mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。ribosomebindingsiteSDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——

16SrRNA3’

UCCUCCAS-D序列距離AUG的距離也影響翻譯第41頁/共121頁AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于SD序列下游。ii）起始密碼：第42頁/共121頁全酶是一個(gè)5聚體，含有兩個(gè)α小亞基，和2兩個(gè)大亞基（β和β′），一個(gè)σ亞基。

3RNA多聚酶

大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA。結(jié)構(gòu)第43頁/共121頁4.轉(zhuǎn)錄終止子內(nèi)終止子intrinsicterminator：E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串A，稱為內(nèi)終止子，形成終止信號(hào)。在表達(dá)載體克隆位點(diǎn)的下游一般設(shè)計(jì)一段轉(zhuǎn)錄終止子。啟動(dòng)子操縱子S-D序列目的基因終止子第44頁/共121頁由于莖環(huán)3’段緊接一串A/U的配對(duì)，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。

終止形成的原因：反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對(duì)的堿基數(shù)降低，整個(gè)減弱了RNA與DNA的互作①莖環(huán)結(jié)構(gòu)②多聚A/U第45頁/共121頁5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)轉(zhuǎn)錄↓5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折疊↓mRNA折疊

UCC

UGG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—CAA

CCCACUUUU—3

DNARNA聚合酶脫落第46頁/共121頁大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上全部的三個(gè)終止密碼防止核糖體跳躍（skipping）。5.翻譯終止密碼6.翻譯增強(qiáng)子Translationenhancer能夠顯著增強(qiáng)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)效率的特殊序列。T7噬菌體基因10前導(dǎo)序列（簡稱g10-L序列）;大腸桿菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的區(qū)段。21第47頁/共121頁1基因表達(dá)的機(jī)制1.1外源基因的起始轉(zhuǎn)錄

外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟。選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問題。原核生物啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：組成型啟動(dòng)子：如lac、trp、λPR、λPL、tac等的啟動(dòng)子如T7噬菌體的啟動(dòng)子真核生物啟動(dòng)子也可分為誘導(dǎo)型和組成型等類型。第48頁/共121頁①必須是一種強(qiáng)啟動(dòng)子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上。②應(yīng)呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄便于表達(dá)毒性蛋白等。③應(yīng)是可誘導(dǎo)型的用溫度或化學(xué)試劑誘導(dǎo)。最佳啟動(dòng)子必須具備的條件

7.基因工程常用的原核啟動(dòng)子

第49頁/共121頁第50頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例原核基因表達(dá)第51頁/共121頁四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（1）包涵體（inclusionbody）是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。形成原理未知。第52頁/共121頁在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人生長激素（humangrowthhormone,hGH）。例：使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞回收的蛋白生物活性差。②缺點(diǎn)①優(yōu)點(diǎn)第53頁/共121頁2.周質(zhì)中表達(dá)（1）周質(zhì)（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)的復(fù)雜機(jī)理目前不完全清楚優(yōu)點(diǎn)：容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。第54頁/共121頁由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。用溶血素（hemolysin）基因構(gòu)建分泌性融合蛋白；使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。3.胞外表達(dá)或與細(xì)菌素釋放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表達(dá)。第55頁/共121頁第56頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例原核基因表達(dá)第57頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例原核基因表達(dá)第58頁/共121頁載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG優(yōu)點(diǎn)五、幾種類型的原核表達(dá)載體1.非融合型表達(dá)載體產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。第59頁/共121頁哈佛大學(xué)的Gilbert實(shí)驗(yàn)室建立的。表達(dá)能力強(qiáng)。舉例：pKK223-3載體組成結(jié)構(gòu)：①強(qiáng)啟動(dòng)子:tac（trp-lac）:trp的-35區(qū)lacUV5的-10區(qū)lac操縱基因②操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。第60頁/共121頁④終止子：③調(diào)節(jié)基因：LacI宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)。

如JM105菌。rrnB的強(qiáng)終止子rrnB強(qiáng)終止子S-D插入位點(diǎn)區(qū)⑤S-D序列和插入位點(diǎn)區(qū)：第61頁/共121頁tacPLacOS-D插入位點(diǎn)區(qū)rrnBT宿主lacI⑥載體的其余部分：來自pBR322質(zhì)粒。⑦表達(dá)誘導(dǎo)物：

IPTG（乳糖的類似物，不會(huì)被降解）阻遏物IPTG第62頁/共121頁啟動(dòng)子第63頁/共121頁載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號(hào)肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。如：pINIII系列：

2.分泌型表達(dá)載體pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,（1）組成結(jié)構(gòu)第64頁/共121頁IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位點(diǎn)Ipp（脂蛋白基因啟動(dòng)子）和lacUV5啟動(dòng)子。②調(diào)節(jié)基因：lacI③S-D序列和起始密碼ATG。④分泌信號(hào)肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。⑤插入位點(diǎn)區(qū)（多克隆位點(diǎn)）。①強(qiáng)啟動(dòng)子：第65頁/共121頁pINIII-comA1第66頁/共121頁第67頁/共121頁表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。①啟動(dòng)子：tac②操縱基因：lacP③調(diào)節(jié)基因：lacI④S-D序列3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng)----pGEX系列（1）優(yōu)點(diǎn)（2）組成結(jié)構(gòu)便于融合蛋白的分離和純化。22第68頁/共121頁lacItaclacOS-D/ATGGST插入位點(diǎn)TGAlacP⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）GST融合蛋白用GlutathioneSepharose親和層析柱分離純化。（3）產(chǎn)物提純第69頁/共121頁（4）產(chǎn)物分離用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來。柱（column）GST外源蛋白凝血酶

外源蛋白柱（column）GSTGST洗脫柱（column）可再利用第70頁/共121頁（5）其他融合蛋白系統(tǒng)His-tag（組氨酸標(biāo)簽）：在外源多肽的N端或C端接上6個(gè)組氨酸（His）。His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。第71頁/共121頁人胰島素在大腸桿菌中的表達(dá)溴化氰Cyanogenbromide：第72頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例原核基因表達(dá)第73頁/共121頁5’-TTGACA-3’

5’-TATAAT-3’

①-35box②-10box（PribnowBox）六、影響外源基因表達(dá)效率的因素1.啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響RNA聚合酶

σ亞基的識(shí)別位點(diǎn)（1）一致順序第74頁/共121頁（2）-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時(shí)，啟動(dòng)子最強(qiáng)。（3）

-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動(dòng)子越強(qiáng)。5’-TTGACA

TATAAT

一致順序lactrpPL

recAtacItacII5’-TTTACA

TATGTT

5’-TTGACA

TTAACT

5’-TTGACA

GATACT

5’-TTGATA

TATAAT

5’-TTGACA

TATAAT

5’-TTGACA

TTTAAT

-35box-10box第75頁/共121頁5’-AGGAGGU-3’

S-D序列后面的4個(gè)堿基：如果是A（T）,翻譯效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。2.轉(zhuǎn)譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響（1）S-D序列？？？？SD序列與16SrＲＮＡ分子之間的堿基互補(bǔ)程度，可明顯地影響mRNA的轉(zhuǎn)譯速率．當(dāng)序列為５‘－ＧＧＡＧＧ－３’，可與16SrＲＮＡ３‘端完全互補(bǔ)，轉(zhuǎn)譯效率最高；而當(dāng)該序列發(fā)生單堿基突變時(shí)，轉(zhuǎn)譯效率便會(huì)下降３０倍．第76頁/共121頁AUG左側(cè)的三個(gè)堿基也有影響。（2）起始密碼AUG-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左側(cè)如果是UAU或CUU時(shí)，最為有效；如果是UUC、UCA或AGG時(shí)下降20倍。AUG右側(cè)的三個(gè)堿基也有影響。第77頁/共121頁多順反子的mRNA與核糖體的結(jié)合位點(diǎn)有一個(gè)或幾個(gè)終止密碼。噬菌體外殼蛋白或核糖體蛋白mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)有多個(gè)U。（3）

其它終止子能有效控制目的基因mRNA的長度、提高mRNA的穩(wěn)定性第78頁/共121頁3.啟動(dòng)子與外源基因之間的距離第79頁/共121頁轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費(fèi)源量和能量、不會(huì)干擾正常的表達(dá)。增加載體的拷貝數(shù)會(huì)增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目。增加表達(dá)效率。4.轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)表達(dá)效率的影響5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響但過度的外源基因的表達(dá)會(huì)影響宿主的正常生長。第80頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例原核基因表達(dá)第81頁/共121頁選擇強(qiáng)啟動(dòng)子序列，如tac

等七、提高表達(dá)水平常用的方法2.調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離距離過長或過短都影響真核基因的表達(dá)。根據(jù)不同的啟動(dòng)子選擇不同的距離。3.改變起始密碼下面的幾組密碼子一般為5-9bp。能提高翻譯的起始效率。第82頁/共121頁4.增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性在外源基因的下游插入“重復(fù)性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’5’外切酶的攻擊。5.減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系。將宿主生長代謝與外源基因表達(dá)分開。（1）誘導(dǎo)表達(dá)

一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。第83頁/共121頁cI857阻遏物有活性，抑制PL啟動(dòng)子，外源基因不表達(dá)，宿主大量生長。32°C:42°C:cI857阻遏物失活，PL啟動(dòng)子啟動(dòng)，外源基因高水平表達(dá)，宿主生長受到限制。cI857PL外源基因POPL啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型第84頁/共121頁調(diào)節(jié)基因lacI（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。無IPTG:阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。有IPTG:阻遏物與IPTG結(jié)合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。tac啟動(dòng)子是藥物誘導(dǎo)型第85頁/共121頁（2）表達(dá)載體誘導(dǎo)復(fù)制

將宿主的生長與載體的復(fù)制分開。當(dāng)宿主大量生長后，再誘導(dǎo)載體制粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。當(dāng)需要宿主大量生長時(shí)，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。第86頁/共121頁N末端：由原核基因編碼一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。（1）設(shè)計(jì)成融合蛋白

這是避免被降解的最好措施。質(zhì)粒基因產(chǎn)物目的基因產(chǎn)物NC切割6.提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。第87頁/共121頁Z系列載體：ZUV5載體:lacZGAATTCCTTAAG外源基因Z2載體:lacZGGGAATTCCCCTTAAG外源基因Z3載體:lacZGGAATTCCCTTAAG外源基因提供三種融合插入閱讀框。第88頁/共121頁①使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。②大腸桿菌的htpR基因突變也減少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶。可把pin增加到載體上。（2）

使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解

減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。第89頁/共121頁（3）表達(dá)分泌蛋白

細(xì)胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”：

蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中?！胺置凇保?/p>

蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。第90頁/共121頁細(xì)菌蛋白分泌的條件：位于N端，一般為15-30aa。真核與原核的結(jié)構(gòu)相似,功能相似，可以互換。

堿性氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)切割位點(diǎn)Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號(hào)肽酶外源蛋白

①有信號(hào)肽。第91頁/共121頁③細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。真核細(xì)胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達(dá)；但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。信號(hào)肽酶I、信號(hào)肽酶II等近20多種蛋白質(zhì)的參與。②蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的aa

序列。

為蛋白指明目的地。23第92頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、原核表達(dá)系統(tǒng)原核基因表達(dá)第93頁/共121頁九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵。二硫鍵異構(gòu)酶催化。使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。1.形成正確的二硫鍵

第94頁/共121頁人胰島素分子第95頁/共121頁抗體分子人血紅蛋白分子第96頁/共121頁如信號(hào)肽、內(nèi)含肽（intein）等序列的切割。2.前體切割

第97頁/共121頁（1）O-糖基化（Ser,Thr）增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和某些特殊性質(zhì)。3.蛋白質(zhì)糖基化

糖基第98頁/共121頁（2）N-糖基化（Asn）Dol：長醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖第99頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、細(xì)菌表達(dá)載體舉例原核基因表達(dá)第100頁/共121頁1、缺乏翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾系統(tǒng)。（如糖基化、氨基酸修飾等）。十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷2、原核表達(dá)外源蛋白常以包涵體形式存在，必須經(jīng)過變形、復(fù)性處理才能獲得有生物活性的蛋白，并且其表達(dá)量非常低。第101頁/共121頁3、原核細(xì)胞中表達(dá)的真核蛋白不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶降解。4、原核細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，無法識(shí)別內(nèi)含子，故原核細(xì)胞無法表達(dá)沒有加工過的真核基因組。5、重組原核細(xì)胞在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的毒素難以排除，污染表達(dá)產(chǎn)物，影響產(chǎn)品純度。第102頁/共121頁一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位六、影響外源基因表達(dá)效率的因素五、幾種類型的原核表達(dá)載體七、提高表達(dá)水平常用的方法九、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾十、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷八、原核表達(dá)系統(tǒng)原核基因表達(dá)第103頁/共121頁第104頁/共121頁

原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞所具有的特點(diǎn)：原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物?；蚪M結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析。多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)粒或噬菌體，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)相。內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定。第105頁/共121頁6.3.1大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌——是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，其遺傳背景清楚，目標(biāo)基因表達(dá)的水平高，培養(yǎng)周期短。目前大多數(shù)外源基因都是以大腸桿菌為受體系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的，是目前應(yīng)用最廣泛的基因表達(dá)系統(tǒng)。與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所具有的優(yōu)越性：①經(jīng)過長期研究，人們已經(jīng)掌握了十分豐富的有關(guān)大腸桿菌基礎(chǔ)生物學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等方面的背景知識(shí)，特別是對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有了深刻的了解；②大腸桿菌已被發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體系列；③實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，許多克隆的真核基因，例如抑制生長素基因和胰島素基因等，都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效的、高水平的表達(dá)；④大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。第106頁/共121頁

常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)：是以lac操縱子調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。PL和PR表達(dá)系統(tǒng)：是以λ噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL和PR構(gòu)建的。T7表達(dá)系統(tǒng)：是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元件構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，它具有很高的表達(dá)能力。第107頁/共121頁2芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌——屬革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，能將表達(dá)蛋白分泌到細(xì)胞外。目前常用作基因表達(dá)系統(tǒng)的有枯草桿菌和短小芽孢桿菌等。利用芽孢桿菌作為表達(dá)外源基因的受體菌的優(yōu)點(diǎn)：許多芽孢桿菌是非致病性微生物，培養(yǎng)條件簡單，生長迅速；表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，且多數(shù)表達(dá)產(chǎn)物具有天然構(gòu)相和生物學(xué)活性；某些芽孢桿菌的遺傳背景比較清楚，便于進(jìn)行遺傳操作；利用芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵的技術(shù)相當(dāng)成熟。第108頁/共121頁6.3.2.1芽孢桿菌表達(dá)載體復(fù)制子金色葡萄球菌的復(fù)制子：如pUB110、pC194和pE194等短小芽孢桿菌的復(fù)制子：如pHY481和pWT481等含金色葡萄球菌復(fù)制子的質(zhì)粒表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)高，但不穩(wěn)定，原因是質(zhì)粒載體與宿主染色體DNA之間發(fā)生遺傳重組。短小芽孢桿菌型復(fù)制子的質(zhì)粒表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)較低，但能穩(wěn)定存在于宿主細(xì)胞中，甚至在沒有抗生素選擇壓力下也不易造成質(zhì)粒的丟失。第109頁/共121頁啟動(dòng)子芽孢桿菌含多種轉(zhuǎn)錄起始識(shí)別因子（σ）。芽孢桿菌啟動(dòng)子的表達(dá)具有明顯的時(shí)序性，它與菌體的生長周期和生理代謝活動(dòng)密切相關(guān)。表達(dá)載體自主復(fù)制質(zhì)粒：是一類穿梭質(zhì)粒，能在大腸桿菌中復(fù)制，同時(shí)含有能在芽孢桿菌中復(fù)制的起始序列，因而也能在芽孢桿菌中進(jìn)行自主復(fù)制。整合質(zhì)粒：在大腸桿菌質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建而成，不含在芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)制的起始序列，因而不能在芽孢桿菌中自主復(fù)制，但它能插入到宿主染色體并將外源基因和標(biāo)記基因整合到染色體上，隨細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制，該方式表達(dá)外源基因解決了芽孢桿菌中質(zhì)粒不能穩(wěn)定遺傳的問題。噬菌體：以芽孢桿菌溫和型噬菌體構(gòu)建的表達(dá)載體能將外源基因定位整合到染色體上，并且在合適條件下（溫度）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。第110頁/共121頁6.3.2.2宿主菌常用的宿主菌枯草芽孢桿菌短小芽孢桿菌地衣芽孢桿菌第111頁/共121頁6.3.2.3外源基因在芽孢桿菌中的分泌表達(dá)芽孢桿菌的細(xì)胞膜不同與大腸桿菌，通常只有一層細(xì)胞膜，當(dāng)分泌型蛋白質(zhì)跨膜后就進(jìn)入到培養(yǎng)基中，因此，外源蛋白的表達(dá)量可以達(dá)到很高的水平，其表達(dá)量可達(dá)30g/L。6.3.2.4在芽孢桿菌中高效表達(dá)外源基因的策略提高表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性滅活芽孢桿菌胞外蛋白酶第112頁/共121頁6.3.3鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌——是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，廣泛分布于土壤中