液氨預(yù)處理后玉米秸稈的酶解效果研究,化工論文

液氨預(yù)處理后玉米秸稈的酶解效果研究,化工論文纖維素乙醇被稱為第二代生物燃料技術(shù)，它以木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)為原料，而農(nóng)作物秸稈是該類生物質(zhì)的重要來源之一。我們國家年產(chǎn)秸稈6.98億t,華而不實玉米秸稈1.71億t,約占秸稈總量的1/4[1],當(dāng)前秸稈的利用率偏低。預(yù)處理、酶解、發(fā)酵是纖維素乙醇煉制經(jīng)過中的3個關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，預(yù)處理是克制木質(zhì)纖維素原料的酶解頑抗性的必要手段[2-3].預(yù)處理方式方法主要有：酸法、堿法、水熱法、蒸汽爆破法和氨纖維爆破法等[4-5].預(yù)處理效果通過酶解率、預(yù)處理成本、能否產(chǎn)生毒害酶解或發(fā)酵的抑制劑、環(huán)境危害等因從來判定。我們國家學(xué)者圍繞纖維素乙醇研究對玉米秸稈采用了酸法[6]、堿法[7]、水熱法、汽爆法[8]、微波與酸化汽爆[9]等多種預(yù)處理方式，進行了預(yù)處理和酶解的相關(guān)試驗研究，纖維素與半纖維素的72h酶解率分別在80%和60%左右。國外學(xué)者圍繞玉米秸稈的預(yù)處理與酶解糖化的研究更為細致而全面[4-5],并重視預(yù)處理經(jīng)過中的物理化學(xué)變化、木質(zhì)素移除與轉(zhuǎn)化等促進酶解的機理方面的研究[10-12].比照預(yù)處理研究文獻，以氨為介質(zhì)的預(yù)處理方式方法對于玉米秸稈具有較好的預(yù)處理效果。氨是一種價格低廉的堿性原料，其水溶液或純液氨可用于預(yù)處理。氨水預(yù)處理主要代表方式方法是氨回收滲濾法〔ammoniarecyclepercolation,ARP〕，又可根據(jù)處理溫度、氨含量與水分不同，細分為ARP法[13]、SAA法〔soakinginaqueousammonia〕[14]和LMAA法〔low-moistureanhydrousammonia〕[15]等，但它的處理周期長，如ARP法長達10~60d.液氨主要用于氨爆法或氨纖維膨脹法〔ammoniafiberexpansion,AFEX〕，處理后的玉米秸稈在添加纖維素酶15FPU/〔g葡聚糖〕時168h的葡聚糖和木聚糖的酶解率到達95%和80%以上[16],酶解效果非常好。本研究在AFEX的基礎(chǔ)上提出了LAT法，采用液氨加溫處理，預(yù)處理溫度范圍加大，但不采用快速釋放氨氣的爆破法。AFEX經(jīng)過基本上不產(chǎn)生酶解與發(fā)酵抑制劑和環(huán)境危害物[16],本實驗與之相近。因而對LAT預(yù)處理后玉米秸稈的酶解效果與酸、堿、熱水、汽爆、AFEX等預(yù)處理方式方法進行了比照。1實驗材料與方式方法1.1材料玉米秸稈〔糯玉米〕采自福建省三明市〔東經(jīng)117.35、北緯26.13〕，采收期為7月份〔播種至青穗采收約65d〕。實驗采用地上部分的整株植物，將其切割成約1~2cm長條狀，初曬后經(jīng)40℃烘干至含水率低于15%,用FZ102微型植物粉碎機粉碎成50~100目粉末。經(jīng)混合均勻后采用水分分析儀MA35〔賽多利斯〕測得其含水率，并用塑料袋密封后置-20℃冰箱中存放備用。用于高效液相色譜〔HPLC〕分析的對照品的葡萄糖、木糖等均采購自Sigma-Aldrich公司，純度為99%以上；預(yù)處理用的氨采購自杭州龍山化工有限公司。添加的水解酶為纖維素酶〔novozymeNS50013〕、-葡萄糖苷酶〔novozymeNS50010〕，由諾維信〔中國〕有限公司提供。NS50013纖維素酶的活性由濾紙法測定,它是一種混合酶，具有木聚糖酶活性，故實驗中未添加木聚糖酶。1.2方式方法實驗分析方式方法參照了美國國家可再生能源實驗室〔NationalRenewableEnergyLaboratory,NREL〕制定的實驗規(guī)程〔LaboratoryAnalyticalProcedure,LAP〕[17],并減少了酶制劑的添加量〔由60FPU/〔g葡聚糖〕改為15FPU/〔g葡聚糖〕〕，加大了反響容量〔由原規(guī)程中的10mL增加為15mL〕。1.2.1組分測定玉米秸稈中碳水化合物和酸不溶性木質(zhì)素〔Klason木質(zhì)素〕采用酸水解法測定，碳水化合物組分由LAP002方式方法測定，酸不溶性木質(zhì)素由LAP003方式方法測定。LAP002和LAP003采用二步酸解法，在一次實驗中完成。酸水解的詳細步驟是先用分析天平稱量已經(jīng)知道含水率并去除抽提物的秸稈原料約0.3g,參加72%硫酸3mL,在30℃水浴中保持2h,加去離子水84mL〔稀釋至4%硫酸〕，放入滅菌鍋中121℃保持1h.經(jīng)真空過濾后將濾紙上的固形物烘干至恒重，用HPLC法〔色譜分析柱采用BioRad醇酸柱HPX-87H〕測定各種單糖的含量，并折算成葡聚糖〔纖維素〕、木聚糖、阿拉伯聚糖等比例，由濾紙上的固形物質(zhì)量與灰分測定來確定不溶性木質(zhì)素含量?；曳譁y定采用LAP005規(guī)程，用分析天平稱量1g左右已經(jīng)知道含水率的原料，將其放入已測定質(zhì)量的有蓋陶瓷坩鍋中，置入箱式電阻爐中程序緩慢升溫，約2h后升至575℃，保持此溫度4h以上。冷至105℃時將坩鍋取出放入枯燥器，冷卻后稱量質(zhì)量并計算灰分。1.2.2液氨預(yù)處理〔LAT法〕LAT法預(yù)處理：根據(jù)原料確定反響用量，將確定量的液氨注入移液鋼瓶〔300mL〕，并加熱小鋼瓶至50℃左右；將待處理的已經(jīng)知道含水率的原料放置在反響器〔改裝的高壓反響釜，大連自控設(shè)備廠〕中，并將反響器抽成真空；然后將氨注入反響器，加熱反響器到預(yù)定溫度；在預(yù)定溫度下駐留一定的時間，而后氨被釋放〔約30s〕，即預(yù)處理經(jīng)過完成。取出處理原料置于通風(fēng)柜中讓處理后原料中的氨逸出，然后在烘箱中低于40℃枯燥。稱重并測得含水率，計算預(yù)處理后生物質(zhì)原料得率，將處理后的原料放入-20℃冰箱冷藏備用。LAT預(yù)處理優(yōu)化的工藝參數(shù)選擇分別為：預(yù)處理的溫度、含水率、駐留時間等,另外氨用量可以以作為參數(shù)供優(yōu)化。1.2.3酶水解酶水解參照LAP009的相關(guān)規(guī)程進行，酶解液總量為15mL,每組樣品酶解至少做一組重復(fù)。根據(jù)規(guī)程，酶解采用1%葡聚糖當(dāng)量，即稱取0.15g葡聚糖當(dāng)量的秸稈放入酶解瓶〔20mL樣品瓶〕，依次參加蒸餾水、檸檬酸鈉緩沖溶液〔平衡后pH值為4.8〕、抗生素〔四環(huán)素和環(huán)己酰亞胺〕，經(jīng)預(yù)混合1h后添加纖維素酶、-葡萄糖苷酶。每克葡聚糖當(dāng)量的生物質(zhì)原料中添加纖維素酶15FPU/〔g葡聚糖〕、-葡萄糖苷酶64pNPGU/〔g葡聚糖〕。酶解條件是溫度設(shè)定為50℃，搖床轉(zhuǎn)速為150rmin-1.酶解取樣時間分別為24、72h.酶解取樣1mL放入離心管，放置加熱器〔設(shè)置溫度99℃〕中加熱20min,使酶蛋白變性失效，放入-20℃冰箱冷卻5min,再放入離心機〔艾本德5424,設(shè)置轉(zhuǎn)速14500rmin-1〕離心5min,經(jīng)0.22m一次性針頭過濾器過濾〔聚醚砜膜〕后轉(zhuǎn)入HPLC分析瓶，放入4℃或-20℃冰箱冷藏待分析。1.2.4單糖的測定酸解或酶解液中糖的定量分析用HPLC法，設(shè)備為帶示差檢測器的AgilentTechnologies1200系列色譜儀。采用BioRad公司的HPX-87H色譜柱〔該色譜柱可適用于中性或酸性溶液〕，流動相為0.005molL-1稀硫酸，流速為0.60mLmin-1,柱溫為50℃。1.2.5酶解率計算酶解轉(zhuǎn)化率〔酶解率〕為實際獲得單糖含量與理論最高可得單糖含量之比，而理論最高可得單糖根據(jù)原料中經(jīng)組分分析〔二步酸解法，LAP002〕的聚糖含量進行折算。以葡聚糖的酶解率為例，其計算公式是：【1】酶解率d為百分數(shù)，式中分子為酶解所獲得葡萄糖含量折算成葡聚糖的量，華而不實g為酶解液中葡萄糖的含量〔單位為g/L〕，15為酶解液的體積，162/180為化學(xué)式中葡萄糖因聚合失去一個水分子的比例；分母為理論上參加的葡聚糖量，b為參加的原料干基質(zhì)量，c為組分分析〔酸解法〕葡聚糖含量。2結(jié)果與討論2.1原料成分分析原材料的組分如表1所示，碳水化合物和木質(zhì)素含量通過二步酸解法分析獲得，灰分通過箱式電阻爐加熱分析獲得。秸稈中葡聚糖〔纖維素〕和木聚糖的含量合計為56.21%,這是理論上能夠轉(zhuǎn)化為單糖的聚糖主要來源。2.2預(yù)處理溫度對酶解效果的影響預(yù)處理溫度對酶解率的影響如此圖1所示，橫坐標(biāo)為預(yù)處理溫度，即預(yù)處理加熱到此溫度下并保存一定時間的溫度〔實驗經(jīng)過中溫度波動范圍為5℃〕；葡聚糖/木聚糖的轉(zhuǎn)化率用柱狀圖表示〔左側(cè)縱坐標(biāo)〕，每千克干基秸稈原料獲得的單糖量為點線圖〔右側(cè)縱坐標(biāo)〕。本實驗固定液氨與原材料〔干基〕質(zhì)量比為1∶1,其他預(yù)處理條件預(yù)設(shè)為含水率60%、預(yù)處理駐留時間為5min.在70℃~130℃范圍內(nèi)，葡聚糖酶解率的總體變化趨勢是隨著溫度升高而增加，在90℃后，提升更趨緩慢；木聚糖酶解率在90℃有較大值，110℃有所下降，130℃又有提升。單糖總體得率隨著溫度升溫而略有上升，90℃時葡聚糖和木聚糖的轉(zhuǎn)化率分別為86.0%和79.2%,每千克干基秸稈可得單糖524.7g,轉(zhuǎn)化率約為理論最高轉(zhuǎn)化率的83.3%;130℃時葡聚糖和木聚糖的轉(zhuǎn)化率分別為91.8%和82.1%,可得單糖554.4g,轉(zhuǎn)化率約為理論量高轉(zhuǎn)化率的88.0%.LAT預(yù)處理的優(yōu)化溫度略高于AFEX預(yù)處理，AFEX預(yù)處理用于玉米秸稈的優(yōu)化溫度為90℃[16],而LAT預(yù)處理在90~130℃均具有較好的效果。LAT預(yù)處理后的酶解率與AFEX相當(dāng)，AFEX在優(yōu)化條件下，添加纖維素酶15FPU/〔g葡聚糖〕的72h葡聚糖和木聚糖的酶解率分別為接近90%和70%[18],本研究中的130℃預(yù)處理后的酶解效果優(yōu)于AFEX.2.3預(yù)處理含水率對酶解效果的影響預(yù)處理含水率是指預(yù)處理前物料的含水率，采用的是水分與干基物料的比例〔此處為干基水分含水率〕，含水率對玉米秸稈葡聚糖和木聚糖的酶解率的影響如此圖2所示。實驗中含水率分別采用20%、40%、60%、80%,其他反響條件為90℃、氨與秸稈質(zhì)量比為1∶1,反響時間為5min.在實驗區(qū)間范圍內(nèi)，含水率在60%時具有最高的轉(zhuǎn)化率，此時葡聚糖和木聚糖72h酶解率分別為85.97%和79.15%,每千克秸稈可得單糖524.7g.預(yù)處理前含水率的變化對酶解效果的影響與AFEX用于玉米秸稈的情形相近，為60%[18];但與芒草等作物存在差異，芒在AFEX中最佳含水率出如今80%和200%[19],LAT法在其他類生物質(zhì)原料中的應(yīng)用有待進一步研究。2.4預(yù)處理駐留時間對酶解效果的影響LAT預(yù)處理駐留時間對酶解效果的影響如此圖3所示，實驗駐留時間分別為3、5、10min,其他條件為90℃、含水率60%、氨與原料比為1∶1.葡聚糖和木聚糖的轉(zhuǎn)化率在駐留時間3~10min范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化率呈先上升后下降的趨勢，在駐留時間為5min時到達峰值。隨著預(yù)處理時間加長，可能是聚糖或單糖分解導(dǎo)致酶解率下降，其原因待進一步分析。2.5質(zhì)量平衡預(yù)處理與酶解的質(zhì)量平衡流程圖如此圖4所示。采用的預(yù)處理條件為：預(yù)處理溫度130℃、含水率60%、駐留時間為5min、液氨與生物質(zhì)比例為1∶1,纖維素酶添加量為15FPU/〔g葡聚糖〕，72h葡聚糖和木聚糖的酶解率分別為91.8%和82.1%,1000g干基玉米秸稈經(jīng)預(yù)處理后固體得率為95.35%,72h酶解后可獲得單糖524.3g〔僅計算葡萄糖和木糖〕，而未作預(yù)處理的單糖獲得量為228.3g,預(yù)處理后單糖得率是未處理原料的2.1倍。從質(zhì)量分析中能夠看出，木糖在酶解轉(zhuǎn)化中占了相當(dāng)大的比例，約占總糖量的36%.怎樣使木糖在預(yù)處理經(jīng)過中不被降解，并且在后續(xù)發(fā)酵經(jīng)過中充分轉(zhuǎn)化為乙醇〔采用基因工程改造的菌種〕，這在纖維素乙醇研究中非常重要。同時，質(zhì)量平衡在預(yù)處理方式方法比照經(jīng)過中非常重要[20],也值得研究者充分關(guān)注。2.6預(yù)處理效果比擬國外學(xué)者采用氨水預(yù)處理的ARP法和SAA〔法，葡聚糖的15FPU/〔g葡聚糖〕、72h的酶解率分別為88.5%[13]和92.5%[14],LMAA法乙醇的理論得率為90%[15].AFEX法預(yù)處理用于玉米秸稈的酶解率比擬高，一般在90%左右[16,18].LAT和AFEX法由于采用的是液氨，未介入反響的氨能夠再利用或回收，有利于降低成本和環(huán)境保衛(wèi)。不同的預(yù)處理方式方法用于玉米秸稈，酶解效果存在較大的差異。如酸預(yù)處理，采用乳酸或乙酸及混合預(yù)處理，這3種方式方法的葡聚糖的轉(zhuǎn)化率為83.92%~94.28%,木聚糖的轉(zhuǎn)化率58.78%~81.08%[21];玉米秸稈經(jīng)1%稀硫酸溶液浸潤后經(jīng)121℃處理60min,72h后原料的酶解率為62.5%〔纖維素酶添加量6FPU/〔g葡聚糖〕〕[6].如堿預(yù)處理，預(yù)處理條件為1.5%NaOH,80℃下反響1h時，48h纖維素酶解率71.29%,半纖維素酶解率78.85%,總糖得率比未處理樣品提高46.66%[7].水熱法預(yù)處理后48h酶解率為63.13%[8];汽爆預(yù)處理后纖維素與半纖維素酶解率分別為81.5%和55.3%〔纖維素酶添加量為10FPU/〔g葡聚糖〕，144h酶解〕[22];采用微波和酸化汽爆的優(yōu)化條件下預(yù)處理,在添加纖維素酶12FPU/〔g葡聚糖〕時，葡聚糖的轉(zhuǎn)化率分別為47.5%和62.5%[9].LAT預(yù)處理在優(yōu)化條件下，葡聚糖與木聚糖的酶解率分別為91.8%和82.1%,與酸、堿、熱水、汽爆等預(yù)處理方式相比，酶解率相對較高。3結(jié)論通過對玉米秸稈的LAT預(yù)處理和酶解糖化經(jīng)過的實驗研究，有如下結(jié)論：〔1〕LAT預(yù)處理能顯著提高玉米秸稈原料的酶解率，預(yù)處理原料經(jīng)酶解后的單糖產(chǎn)量是未經(jīng)預(yù)處理的2.1倍，LAT法預(yù)處理后的酶解率和單糖得率高于酸、堿、水熱和汽爆法等?！?〕LAT法預(yù)處理的優(yōu)化條件是預(yù)處理溫度為90~130℃、含水率為60%〔干基〕、預(yù)處理駐留時間為5min.在這里優(yōu)化條件下〔130℃〕，在纖維素酶添加量為15FPU/〔g葡聚糖〕時，玉米秸稈中的葡聚糖和木聚糖72h酶解率分別為91.8%和82.1%,每kg干基秸稈可得單糖524.3g.〔3〕溫度、含水率和駐留時間都對預(yù)處理的效果有影響，而溫度的影響為最大。以下為參考文獻：[1]朱建春,李榮華,楊香云,等。近30年來中國農(nóng)作物秸稈資源量的時空分布[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2020,40:139-146.[2]HIMMELME,DINGSY,JOHNSONDK,etal.Biomassrecalcitrance:engineeringplantsandenzymesf