分子遺傳學(xué)基因突變與重組遺傳學(xué)詳解演示文稿

分子遺傳學(xué)基因突變與重組遺傳學(xué)詳解演示文稿1當(dāng)前1頁，總共149頁。優(yōu)選分子遺傳學(xué)基因突變與重組遺傳學(xué)2當(dāng)前2頁，總共149頁。3當(dāng)前3頁，總共149頁。4當(dāng)前4頁，總共149頁。蛋白質(zhì)因子特異DNA序列編碼序列啟動(dòng)序列操縱序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)5當(dāng)前5頁，總共149頁。6當(dāng)前6頁，總共149頁。7當(dāng)前7頁，總共149頁。8當(dāng)前8頁，總共149頁。9當(dāng)前9頁，總共149頁。10當(dāng)前10頁，總共149頁。11當(dāng)前11頁，總共149頁。AGAATTTTCTAACTAAAAGTTCATAAGACAAACCCAAACATTGTCATGTTTCTCGGTTCTTTCTTACAACCCAAGCTGACCCTTAACATCATCGAAGAGTCCCCCCCACCGAAAGCCCTCCCCTCTGCTCTTAAAGTCCCCTTCATTCCATTACAAAAATGTCCGAACTCTGATATCCCTTCACTTATCTTTCCACCACCACAATTCCACCAGTTCCAAGCTTCTTTTCAAACAACAAAACCCCACATGTCTTCCTTTTCGGTCCGTTTCTTTGCTCCACAACAGCCGTTACTGCCGTCCACAGCTTCCTCTTTCAAGCCCAAAACATGGGTTATGGCAGCTCCCACGACGGCGCCAGCGACTTCGGTGGATGTCGACGGGCAGAGGTTGGAACCCCGAGTTGAAGAACGAGAGGGGTACTTCGTGTTGAAAGAGAAGTTCAGAGATGGCATCAACCCTCAAGAGAAAATAAAGATCGAGAAAGACCCTTTGAAGCTTTTCATGGAAGCTGGGATTGATGAACTCGCTAAGATGTCGTTCGAGGATATTGATAAAGCTAAGGCTACAAAGGACGACATTGATGTTAGACTTAAATGGCTCGGCTTGTTCCATAGGAGAAAACATCAATATGGGAGATTTATGATGAGATTAAAACTACCAAATGGTGTAACAACAAGTGCACAAACACGGTACTTAGCCAGTGTGATAAGGAAATACGGCAAAGAAGGGTGTGCAGATGTTACGACAAGGCAAAACTGGCAAATCCGTGGAGTGGTGTTGCCTGATGTGCCTGAAATACTTAAGGGTCTCGACGAAGTAGGCTTGACGAGCCTACAGAGTGGCATGGACAATGTGAGGAACCCTGTTGGTAATCCTCTTGCCGGCATCGACCCCGAAGAGATTGTCGATACTCGACCTTATACCAACTTGTTATCTCAGTTCATCACCGCCAATTCCCGCGGCAATCCGGCTTTTGCCAACTTGCCTAGGAAATGGAATGTCTGTGTCGTGGGGTCTCATGATCTTTACGAACATCCCCATATCAATGATCTCGCTTATATGCCGGCGACGAAAAACGGACGATTTGGGTTTAATTTGCTGGTTGGTGGGTTCTTTAGTGCCAAGAGATGTGATGAGGCCATTCCTCTTGATGCTTGGGTCTCAGCTGATGATGTGATTCCATTGTGCAAAGCTGTGTTAGAAGCCTATAGGGATCTTGGATACAGGGGCAATAGGCAAAAGACTAGAATGATGTGGCTGATTGATGAACTGGGTATTGAAGTGTTCAGATCAGAAGTAGCCAAAAGAATGCCTCAGAAAGAGTTGGAGAGAGCATCTGATGAAGATTTGGTTCAAAAGCAATGGGAAAGGAGAGACTACCTTGGTGTCCATCCGCAAAAGCAAGAAGGTTTCAGCTACATCGGCATTCACATCCCAGTCGGTCGAGTCCAAGCCGACGACATGGACGAACTAGCCCGGTTAGCCGACACGTATGGCTCGGGCGAATTCAGACTCACTGTGGAGCAAAACATCATAATCCCCAACGTTGAGAACTCGAAACTAGAAGCATTACTAAACGAGCCTCTATTGAAAGACCGGTTTTCACCCCAACCAAGTATTCTCATGAAAGGGCTAGTAGCTTGTACTGGTAACCAGTTTTGCGGACAAGCCATTATTGAAACAAAAGCTAGAGCCTTGAAGGTGACGGAAGAGGTTGAAAGGCTAGTGTCGGTGAGCCGGCCGGTGAGGATGCATTGGACCGGTTGCCCCAACACGTGTGGTCAAGTCCAAGTGGCGGATATAGGTTTCATGGGGTGCATGGCAAGGGATGAGAATGGGAAACCATGTGAAGGGGCAGACATATTTTTGGGAGGGAGAATTGGGAGTGACTCCCATTTAGGAGAGCTTTATAAGAAGGGTGTCCCTTGTAAGAACTTGGTACCTGTAGTTGCTGACATTTTGGTGGAACCCTTTGGAGCTGTCCCTAGGCAAAGGGAAGAAGGGGAAGATTGATTCAAAATCAACTTCATTTCATTCCATTACTTTTATATTTGTTTTATTTTTTTTTTTTAATAACCAAGAAAAA12當(dāng)前12頁，總共149頁。MSSFSVRFFAPQQPLLPSTASSFKPKTWVMAAPTTAPATSVDVDGQRLEPRVEEREGYFVLKEKFRDGINPQEKIKIEKDPLKLFMEAGIDELAKMSFEDIDKAKATKDDIDVRLKWLGLFHRRKHQYGRFMMRLKLPNGVTTSAQTRYLASVIRKYGKEGCADVTTRQNWQIRGVVLPDVPEILKGLDEVGLTSLQSGMDNVRNPVGNPLAGIDPEEIVDTRPYTNLLSQFITANSRGNPAFANLPRKWNVCVVGSHDLYEHPHINDLAYMPATKNGRFGFNLLVGGFFSAKRCDEAIPLDAWVSADDVIPLCKAVLEAYRDLGYRGNRQKTRMMWLIDELGIEVFRSEVAKRMPQKELERASDEDLVQKQWERRDYLGVHPQKQEGFSYIGIHIPVGRVQADDMDELARLADTYGSGEFRLTVEQNIIIPNVENSKLEALLNEPLLKDRFSPQPSILMKGLVACTGNQFCGQAIIETKARALKVTEEVERLVSVSRPVRMHWTGCPNTCGQVQVADIGFMGCMARDENGKPCEGADIFLGGRIGSDSHLGELYKKGVPCKNLVPVVADILVEPFGAVPRQREEGED編碼588氨基酸的蛋白質(zhì)序列13當(dāng)前13頁，總共149頁。14當(dāng)前14頁，總共149頁。7.2點(diǎn)突變的類型

7.3突變發(fā)生的機(jī)理(自發(fā)突變，誘發(fā)突變)7.4保證生物體遺傳穩(wěn)定性的機(jī)制7.5基因重組交換的分子機(jī)制7.1有關(guān)突變的基本概念主要內(nèi)容15當(dāng)前15頁，總共149頁。7.1有關(guān)突變的基本概念突變(mutation)：可以通過復(fù)制而遺傳的DNA結(jié)構(gòu)的任何永久性改變。突變是一種遺傳狀態(tài)，是相對(duì)于正常狀態(tài)而言突變體(mutant)：攜帶突變基因的生物個(gè)體或群體遺傳突變：包括核苷酸點(diǎn)突變和染色體突變（染色體數(shù)目和染色體結(jié)構(gòu)的改變)點(diǎn)突變：在一個(gè)基因內(nèi)部發(fā)生的一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸對(duì)的增加、缺失或取代，稱為點(diǎn)突變16當(dāng)前16頁，總共149頁。表示方法表現(xiàn)型Arg+Arg-基因型arg+

arg-

野生型正性狀突變基因(mutantgene):存在突變位點(diǎn)的基因野生型基因（wildtypegene）：沒有發(fā)生突變的基因突變率:單位時(shí)間內(nèi)（如細(xì)胞世代內(nèi)）某一基因突變發(fā)生的頻率。17當(dāng)前17頁，總共149頁。突變的多方向性和復(fù)等位基因

基因突變的方向是不定的，可以多方向發(fā)生。A→a，A→a1，A→a2，A→a3，A→an。基因A可突變?yōu)閍也可以突變?yōu)閍1、a2、a3等，它們對(duì)A來說都是隱性基因

Aa1a2a3a4a5a618當(dāng)前18頁，總共149頁。遺傳試驗(yàn)表明這些隱性突變基因彼此之間，以及它們與A基因之間都存在有對(duì)性關(guān)系19當(dāng)前19頁，總共149頁。具有對(duì)性關(guān)系的基因是位于同一基因位點(diǎn)上的。位于同一基因位點(diǎn)的各個(gè)等位基因，在遺傳上稱為復(fù)等位基因。復(fù)等位基因不存在于同一個(gè)體，而是存在于同一生物類型的不同個(gè)體里。20當(dāng)前20頁，總共149頁。21當(dāng)前21頁，總共149頁。復(fù)等位基因廣泛存在于生物界，煙草中有兩個(gè)野生種，N.forgation和N.alate表現(xiàn)自交不親和性。在這些煙草中發(fā)現(xiàn)15個(gè)自交不親和復(fù)等位基因S1、S2、S3、S4……S15等控制自花授粉的不結(jié)實(shí)。自交不親和性是指自花授粉不結(jié)實(shí)，而株間授粉卻能結(jié)實(shí)的現(xiàn)象。試驗(yàn)表明，具有某一基因的花粉不能在具有同一基因的柱頭上萌發(fā)，好象同一基因之間存在一種抵抗作用。22當(dāng)前22頁，總共149頁。s1s2和s1s2雜交不能結(jié)實(shí)：23當(dāng)前23頁，總共149頁?；蛲蛔兊臅r(shí)期突變可以發(fā)生在生物個(gè)體發(fā)育的任何時(shí)期，性細(xì)胞發(fā)生的突變可以通過受精直接傳遞給后代顯性突變：aA當(dāng)代表現(xiàn)隱性突變：Aa當(dāng)代不表現(xiàn)24當(dāng)前24頁，總共149頁。體細(xì)胞如果發(fā)生突變，突變的體細(xì)胞在生長過程中，往往競爭不過周圍的正常細(xì)胞，受到抑制或最終消失保留體細(xì)胞的突變，需將它從母體上及時(shí)分割下來加以無性繁殖，許多植物的突變就是體細(xì)胞的突變結(jié)果。如果果樹上一旦發(fā)生優(yōu)良突變，即可直接采用無性繁殖方法育成新品種25當(dāng)前25頁，總共149頁。26當(dāng)前26頁，總共149頁。27當(dāng)前27頁，總共149頁。28當(dāng)前28頁，總共149頁。29當(dāng)前29頁，總共149頁。（1）取代(conversion)轉(zhuǎn)換(transition)

PyPy

Pu

Pu

顛換(transversion)

Py

Pu

7.2.1點(diǎn)突變的種類

7.2點(diǎn)突變的類型１．轉(zhuǎn)換（transition）：指ＤＮＡ分子中的嘌呤為另一種嘌呤或嘧啶為另一種嘧啶所取代而引起的突變。２．顛換（transversion）:指DNA分子中的嘌呤被嘧啶取代或嘧啶被嘌呤取代所引起的突變。30當(dāng)前30頁，總共149頁。轉(zhuǎn)換31當(dāng)前31頁，總共149頁。顛換32當(dāng)前32頁，總共149頁。轉(zhuǎn)換和顛換的相互關(guān)系示意圖33當(dāng)前33頁，總共149頁。（2）核苷酸缺失突變或插入突變

=3xdNt

±nxAminoacid對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響較小

=3xdNt

Frameshift(移框突變)改變了氨基酸的組成，也會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)合成過早終止移碼突變（frameshiftmutation）：指ＤＮＡ分子中插入或缺失一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸，使整個(gè)閱讀框改變而引起的突變。34當(dāng)前34頁，總共149頁。Examplesofdeletionmutations

35當(dāng)前35頁，總共149頁。7.2.2堿基取代的效應(yīng)從對(duì)遺傳信息的改變上同義突變(synonymousmut.)：指沒有改變產(chǎn)物氨基酸序列的密碼子的變化，與密碼子的簡并性有關(guān)。GAA(Glu)→GAG(Glu)

錯(cuò)義突變(Missensemut.)：指堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸序列的改變。GAA(Glu)→AAA(Lys)

無義突變(Nonsensemut.)：指某個(gè)堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子變?yōu)榈鞍踪|(zhì)合成的終止密碼子。產(chǎn)物一般沒有活性。

AAG(Lys)→UAG(stop)

無義突變類型UAA（Oc）赭石型（Ocher）UAG（Am）琥珀型（amber）UGA（Opal）乳石型（Opal）36當(dāng)前36頁，總共149頁。(４)延長突變（elongationmutation）：這是一類剛好與無義突變相反的突變，是由于終止密碼子突變?yōu)榫幋a子，使肽鏈延長。

37當(dāng)前37頁，總共149頁。38當(dāng)前38頁，總共149頁。獲得突變型是遺傳學(xué)研究的重要前提

非條件型突變；

alleleinDNAlevel(RFLP,RAPD…)

alleleinphenotyle(紅花/白花，糯/非糯…)

條件型突變；

突變的表現(xiàn)=突變基因型+誘導(dǎo)條件

（光，溫敏感不育，Ts,su--…）

7.2.3突變的表達(dá)類型

有些基因突變的結(jié)果在正常生長情況下表型沒有明顯的改變，但在特定條件下可以表現(xiàn)為不同程度的改變甚至死亡39當(dāng)前39頁，總共149頁。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG40當(dāng)前40頁，總共149頁。ABCPCRABCSSR多態(tài)性分析示意圖ABC分別代表不同的基因型41當(dāng)前41頁，總共149頁。SSR引物的擴(kuò)增42當(dāng)前42頁，總共149頁。7.3.1自發(fā)突變

（1）堿基異構(gòu)式替代正常堿基引起DNA復(fù)制過程錯(cuò)誤

a)堿基異構(gòu)式

A(amino)A(imino)

C(a)C(i)

G(keto)G(enol)

G(k)

G(e,i)

T(keto)

T(enol-2’)orT(enol-4’)

在細(xì)胞內(nèi)某些因素的作用下即可發(fā)生。突變的頻率平均為每一核苷酸每一世代10－9～10－107.3突變發(fā)生的機(jī)理(自發(fā)突變，誘發(fā)突變)

43當(dāng)前43頁，總共149頁。嘧啶Pyrimidines嘌呤Purines堿基、核苷、核苷酸☉堿基NitrogenousbasesUracil(U)44當(dāng)前44頁，總共149頁。b)堿基異構(gòu)式引起DNA復(fù)制的錯(cuò)配

G(k)C(a)

正確配對(duì)A(a)T(k)

錯(cuò)誤配對(duì)G(k)T(e)

A(a)

C(i)

A(i,anti)A(a,syn)A(i,anti)G(k,syn)

G(e,i,anti)G(k,syn)G(e,i,anti)A(a,syn)

A(i)

C(a)

G(e)

T(k)

45當(dāng)前45頁，總共149頁。A(a)

T(k)

A(a,anti)

T(k,anti)

C(i)

C(a,anti)

A(a)

A(a,anti)

堿基異構(gòu)式引起DNA的錯(cuò)配突變

C(i)

C(a)G(k,syn)

G(k,syn)

G(k,anti)G(k)46當(dāng)前46頁，總共149頁。（2）重復(fù)序列間的非對(duì)等（不對(duì)稱）交換

（3）增變基因（mutatorgene）

生物體內(nèi)有些基因與整個(gè)基因組的突變率直接相關(guān)。當(dāng)這些基因突變時(shí)，整個(gè)基因組的突變率明顯上升，這些基因稱為增變基因增變基因類別DNApolymerase相關(guān)基因3’5’editingfunctionmutation錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的基因MCE(mismatchcorrectionenzyme)DNA

損傷修復(fù)系統(tǒng)基因錯(cuò)配，修復(fù)功能喪失突變率升高47當(dāng)前47頁，總共149頁。7.3.2誘發(fā)突變

（1）物理誘變

a)電離輻射誘變

Co60(χ)(γ)ray

Cs137(χ)(γ)ray

H3(α)ray

P32,,S35(β)ray

衛(wèi)星搭載誘變；

高真空，強(qiáng)輻射，微重力

(χ)(γ)ray穿透性

（外照射處理）

(α)(β)ray非穿透性

（內(nèi)標(biāo)記處理）

dNt電荷及結(jié)構(gòu)改變

導(dǎo)致DNA的斷裂、錯(cuò)接及堿基配對(duì)關(guān)系的改變48當(dāng)前48頁，總共149頁。航天誘變品種矮稈早熟大豆（右）與相對(duì)照的大豆品種

49當(dāng)前49頁，總共149頁。50當(dāng)前50頁，總共149頁。51當(dāng)前51頁，總共149頁。太空西瓜52當(dāng)前52頁，總共149頁。太空蘿卜53當(dāng)前53頁，總共149頁。54當(dāng)前54頁，總共149頁。55當(dāng)前55頁，總共149頁。電離輻射誘變的作用規(guī)律輻射劑量的表示方法：X射線、γ射線：倫琴(R)；中子：積分流量(n/cm2)；β射線：微居里(μcu/g)。突變率與輻射劑量：突變率與輻射總劑量成正比；突變率與劑量率(輻射強(qiáng)度的影響)無關(guān)。56當(dāng)前56頁，總共149頁。b)非電離輻射—UltraVioletlight(U.V)大劑量的UV照射；相鄰的兩個(gè)T或兩個(gè)C或C和T之間均可以形成嘧啶二聚體，最容易形成的是TT二聚體在人皮膚中，每小時(shí)由于UV而產(chǎn)生嘧啶二聚體的頻率為5×104／細(xì)胞UV因穿透力有限，對(duì)于人的作用僅限于皮膚，但可以影響微生物的存活57當(dāng)前57頁，總共149頁。pyrimidinedimer(TTdimer)isgeneratedbycovalentlinks

betweenadjacentTT

∧U.V.…CTTA…環(huán)丁基嘧啶二聚體58當(dāng)前58頁，總共149頁。主要是紫外線：紫外線的作用機(jī)制：激發(fā)作用：T-T，CU；穿透能力與處理方法：微生物或植物配子最有效波長260nm(嘌呤、嘧啶的共軛環(huán))間接誘變作用：培養(yǎng)基內(nèi)H2O2的產(chǎn)生；物理誘變的非專性：對(duì)DNA分子及其核苷酸殘基無選擇性，所以沒有?；院吞禺愋?。脫氨59當(dāng)前59頁，總共149頁。（2）生物技術(shù)定點(diǎn)誘變（3）化學(xué)誘變（4）轉(zhuǎn)座子和Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的插入突變1.提高基因突變率；2.獲得更豐富的突變類型；3.改良生物的個(gè)別性狀。應(yīng)用60當(dāng)前60頁，總共149頁。(5-BrU,5-溴尿嘧啶)酮式烯醇式Kea)堿基類似物在DNA復(fù)制時(shí)的滲入造成堿基錯(cuò)誤配對(duì)（3）化學(xué)誘變61當(dāng)前61頁，總共149頁。5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)ATGCreplicationerrorA/T

G/CincorporationerrorG/CA/TAGReplication62當(dāng)前62頁，總共149頁。A(a)T(k)5-BrU(k)G(k)5-BrU(e)C(a)mispairingmispairingT(k)A(a)5-BrU(k)G(k)C(e)5-BrU(e)A(a)G(k)G(k)A(a)ReplicationerrorIncorporationerror5-BrU(k)5-BrU(e)63當(dāng)前63頁，總共149頁。5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)GCreplicationerrorA/T

G/CincorporationerrorG/CA/TInDNABrU(k)>BrU(e)(normal)(isoform)BrU(k)

BrU(e)難易AGGATCCT>64當(dāng)前64頁，總共149頁。HNO2(NitrousacidNA)引起氧化脫氨反應(yīng),氨基變?yōu)橥鵥)DNA分子上堿基的化學(xué)修飾導(dǎo)致堿基錯(cuò)誤配對(duì)ACGInosineCUracilAXanthineCdeamination

HNO2黃嘌呤次黃嘌呤65當(dāng)前65頁，總共149頁。ATHNO2ITICGC復(fù)制復(fù)制ATGC轉(zhuǎn)換66當(dāng)前66頁，總共149頁。

DNA分子上堿基的化學(xué)修飾導(dǎo)致堿基錯(cuò)誤配對(duì)C(i)A(a)HNHHOC(a)HAHNHHHOHNHHOHNHHOHNHHONHNH2OH(HydroxylamineHA羥胺)對(duì)C具有專化性，并特異地誘發(fā)G?CA?T67當(dāng)前67頁，總共149頁。GCNH2OHGChACh復(fù)制復(fù)制GCAT轉(zhuǎn)換AT68當(dāng)前68頁，總共149頁。烷基化試劑的致突變作用EMS(甲磺酸乙酯Ethylmethanesulfanate)CH3—S—O--CH2CH3OOMMSCH3—S—O--CH3OOSM(SulfurMustardsgas硫芥子氣)HSCH2CH2ClCH2CH2Cl69當(dāng)前69頁，總共149頁。70當(dāng)前70頁，總共149頁。誘變效應(yīng):使堿基多處發(fā)生烷化，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)變異烷基化位點(diǎn)主要在G的N-7位和A的N-3位，A的N-7位也可以烷基化。烷基化的結(jié)果有兩種：一是使G不再與C配對(duì)，而與T配對(duì)，造成G?CA?T的轉(zhuǎn)換GCG(7)T烷基化復(fù)制AT71當(dāng)前71頁，總共149頁。GCG*C烷基化去嘌呤C第二輪復(fù)制GCAT和TACG和轉(zhuǎn)換顛換二是減弱N9位上的N-糖苷鍵，產(chǎn)生去嘌呤作用。大部分無嘌呤位點(diǎn)都可以被無嘌呤內(nèi)切酶系統(tǒng)修復(fù)，但有時(shí)復(fù)制在修復(fù)之前進(jìn)行，則在無堿基的位置上可以插入任何一個(gè)堿基，在第二輪復(fù)制之后，G?C對(duì)可以變?yōu)槿魏螇A基對(duì)G?C，C?G，A?T，T?A，既有轉(zhuǎn)換又有顛換72當(dāng)前72頁，總共149頁。c)嵌合劑的致突變作用AO(吖啶橙AcridineOrange)扁平分子EB(溴化乙錠EthidiumBromide)嵌合劑的分子大小與DNA的堿基對(duì)大小差不多，可以嵌合到DNA的堿基對(duì)之間，原來相鄰的兩個(gè)堿基對(duì)分開一定的距離，含有嵌合劑的DNA在下一輪復(fù)制時(shí)，可以隨機(jī)插入一個(gè)堿基，偶爾也有兩個(gè)（插入突變）。有時(shí)發(fā)生很低頻率的單堿基缺失突變，這些突變都會(huì)引起閱讀框的改變。73當(dāng)前73頁，總共149頁。TACGAATCGGGTATTATGCTTAGCCCATAATACGAATCGGGTATTATGCTTAGCCCATAACG染料分子嵌入復(fù)制插入一個(gè)堿基對(duì)移碼突變74當(dāng)前74頁，總共149頁。插入分子引起移碼突變75當(dāng)前75頁，總共149頁。76當(dāng)前76頁，總共149頁。7.3.3突變熱點(diǎn)(hotspotofmutation)任何一種生物的各個(gè)基因自發(fā)突變的頻率是一定的不同基因DNA序列不同形成特定排列的突變熱點(diǎn)頻率不同玉米R(shí)粒色I(xiàn)色素抑制基因Pr紫色Su非甜Y黃色子粒Sh飽滿子粒492×10-6106×10-611×10-62.4×10-62.2×10-61.2×10-677當(dāng)前77頁，總共149頁。a)m5C5-甲基胞嘧啶的存在是突變熱點(diǎn)形成的最主要原因U（突變率很低）（可以被尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)修復(fù)）C

deaminationm5CTdeaminationG若發(fā)生在模板鏈上，很快引起突變；若發(fā)生在DNA復(fù)制期間的新生鏈上，可被錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)；若發(fā)生在DNA非復(fù)制期，由于DNA兩條鏈的甲基化程度相同，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)失去判別標(biāo)準(zhǔn)，只能隨機(jī)的切除一個(gè)，因此有一半的可能性發(fā)生突變。78當(dāng)前78頁，總共149頁。b)DNA中的repetitiveseq./palindromicseq.e.g.Lac.OperonCTGGCTGGCTGG復(fù)制時(shí)，模板鏈與新生鏈間滑動(dòng)錯(cuò)配CTGG序列的缺失突變或插入突變79當(dāng)前79頁，總共149頁。為了保證遺傳信息的高度穩(wěn)定性，生物體在進(jìn)化過程中形成了一系列多步驟的修復(fù)機(jī)制：（1）糾正偶然的復(fù)制錯(cuò)誤的系統(tǒng)，如DNA聚合酶的3’5’的校對(duì)功能；尿嘧啶糖基酶修復(fù)系統(tǒng)；錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（2）能修復(fù)環(huán)境因素（如射線）和體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)造成的DNA分子損傷的系統(tǒng)，如光復(fù)活修復(fù)系統(tǒng)、切除修復(fù)系統(tǒng)、重組修復(fù)系統(tǒng)、SOS修復(fù)系統(tǒng)等（3）對(duì)付外源DNA的入侵：限制－修飾系統(tǒng)（4）基因的回復(fù)突變（5）致死突變（6）密碼的簡并（7）多倍體……7.4生物體保證遺傳穩(wěn)定性的機(jī)制80當(dāng)前80頁，總共149頁。7.4.1復(fù)制過程中的錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制(ξ=10-11)主要作用于復(fù)制過程中和復(fù)制完成后的較短時(shí)間內(nèi)，所要修復(fù)的錯(cuò)誤堿基已經(jīng)存在于新生DNA鏈的內(nèi)部，稱為復(fù)制修復(fù)（1）錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(Mismatchrepairsystem)DNA聚合酶將極少數(shù)錯(cuò)誤堿基遺留在DNA鏈上而未進(jìn)行糾正的頻率為10－8即108個(gè)堿基中有一個(gè)堿基是不配對(duì)的錯(cuò)誤堿基；實(shí)際測(cè)得的突變頻率為10－10或10－11由于DNA的完整性和精確性是生命的根本所在，因而在細(xì)胞中演化出另一個(gè)修復(fù)系統(tǒng)叫錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)，給予第二次糾正錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)81當(dāng)前81頁，總共149頁。腺嘌呤的的甲基化是錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)志，這一標(biāo)志有三個(gè)特征：在DNA中，天然的甲基化堿基有兩種，N6-甲基腺嘌呤(m6A)和5－甲基胞嘧啶(m5C)，m5C與識(shí)別無關(guān)。（1）具有堿基序列特異性，m6A一般包含在GATC序列中（2）沿新生DNA鏈有一個(gè)甲基化的梯度，靠近復(fù)制叉處的甲基化程度最小（3）親本鏈上的甲基化程度高而且均一根據(jù)以上特征，此系統(tǒng)就可以識(shí)別模板鏈和新生鏈，從而糾正新生鏈上的錯(cuò)配堿基錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)受甲基化的引導(dǎo)82當(dāng)前82頁，總共149頁。（1）錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(Mismatchrepairsystem)DNApolymeraseligaseMCE(mismatchcorrectenzyme,錯(cuò)配校正酶)由3subunits

mutH,L,S組成Scanning新生鏈中錯(cuò)配堿基識(shí)別新生鏈中未m6A的GATC序列酶切含錯(cuò)配堿基的新生DNA區(qū)段H亞基L亞基S亞基83當(dāng)前83頁，總共149頁。MCEscanningDNA中的GATC(palindromicseq.)為m6A甲基化敏感位點(diǎn)平均每2kb左右有一GATCseq.3’

-CCTAGCTAG

5’5’TGATCGATC

3’3’5’少梯度多（m6A）新生鏈84當(dāng)前84頁，總共149頁。MCEscanningendonucleasePolymeraseligaseGATC

GATCCTAGCTAGTCGATC

GATCCTAGCTAGTGATC

GATCCTAGCTAGTA85當(dāng)前85頁，總共149頁。（2）ungsystem(尿嘧啶-N-糖基酶系統(tǒng))尿嘧啶有兩種來源：(1)生物體內(nèi)自身存在的U，生物體內(nèi)有dUTPase，但仍有少數(shù)的dUTP滲入DNA鏈中，發(fā)生A?U配對(duì)，DNA聚合酶III的校對(duì)功能無法識(shí)別它。(2)細(xì)胞內(nèi)C脫氨氧化生成的U。兩種來源的U都可以通過該系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)包括尿嘧啶－N－糖基酶AP內(nèi)切核酸酶（無嘌呤內(nèi)切核酸酶）DNA聚合酶DNA連接酶尿嘧啶－N－糖基酶：能準(zhǔn)確識(shí)別新生鏈中的U，并將其切除無嘌呤內(nèi)切核酸酶：切除鄰近核苷酸形成缺口86當(dāng)前86頁，總共149頁。（2）ungsystem(尿嘧啶-N-糖基酶系統(tǒng))TAGCATCGTAGCA

CGUTAGCung-aseGCUAUTAGCACGApurinase(內(nèi)切酶)TAGCATCGDNApolligase87當(dāng)前87頁，總共149頁。7.4.2DNA的損傷修復(fù)機(jī)制造成DNA損傷的因素電離輻射紫外線烷化劑氧化劑…損傷類型胸腺嘧啶二聚體研究得最清楚當(dāng)有胸腺嘧啶二聚體的DNA作為模板進(jìn)行復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶將兩個(gè)A聚合上去，但由于不能很好地形成氫鍵，由3’5’的校對(duì)功能將之水解。此事件反復(fù)發(fā)生，從而造成空耗，即大量的的dATP被分解，而DNA復(fù)制則毫無進(jìn)展。由于蛋白質(zhì)在不斷合成，而DNA不能合成，因此細(xì)胞不能分裂，出現(xiàn)細(xì)絲狀的所謂蛇形細(xì)胞，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。88當(dāng)前88頁，總共149頁。一、嘧啶二聚體的產(chǎn)生類型：TT二聚體（）、CC二聚體（）、CT二聚體（）TTCCCT相鄰的胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚體CCCCCCCC89當(dāng)前89頁，總共149頁。對(duì)于胸腺嘧啶二聚體主要有5種修復(fù)途徑：

(1)光修復(fù)(2)切除修復(fù)(3)重組修復(fù)(4)SOS修復(fù)(5)二聚體糖基酶修復(fù)90當(dāng)前90頁，總共149頁。phR471aa（1）光修復(fù)TTAATT-AATTAATT-AA

發(fā)生在DNA復(fù)制前；無誤修復(fù)

400nmBluelight&phRgene(photo-reactivationenzyme，光復(fù)活酶，471aa)可見光激活光復(fù)活酶已在細(xì)菌、酵母菌、原生動(dòng)物、藻類、蛙、鳥類、哺乳動(dòng)物中的有袋類以及人的淋巴細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)此修復(fù)功能主要是低等生物的一種修復(fù)方式91當(dāng)前91頁，總共149頁。(2)切除修復(fù)廣泛存在于原核生物和真核生物中，也是人類的主要修復(fù)方式人類的色素性干皮病是由常染色體上的隱性基因控制的一種稀有遺傳疾病?；颊邔?duì)陽光極為敏感，皮膚癌的發(fā)病率很高原因：切除修復(fù)系統(tǒng)失去功能發(fā)生在復(fù)制前無誤修復(fù)UvrA,B,Cgene

Endonucleases(核酸內(nèi)切酶)Exonuclease(核酸外切酶)DNApolLigase92當(dāng)前92頁，總共149頁。切割刪除切除修復(fù)93當(dāng)前93頁，總共149頁。核苷酸切除修復(fù)94當(dāng)前94頁，總共149頁。E.coli存活%U.V劑量w.t.UvrA+RecA+RecA+

uvra-reca-uvra-Rec-Agene以某種方式參與DNA損傷修復(fù)(3)重組修復(fù)95當(dāng)前95頁，總共149頁。★Rec-A.gene以某種方式參與DNA損傷修復(fù)?Rec修復(fù)系統(tǒng)比切除修復(fù)系統(tǒng)更有效

目前知道

?Uvr系統(tǒng)負(fù)責(zé)切除二聚體?Rec系統(tǒng)負(fù)責(zé)消除沒有被切除的二聚體可能造成的后果96當(dāng)前96頁，總共149頁。發(fā)生在復(fù)制后；易錯(cuò)修復(fù)重組修復(fù)負(fù)責(zé)消除那些未被切除的二聚體可能造成的可怕后果在重組修復(fù)過程中，二聚體并未除去，而是經(jīng)過多次復(fù)制后，二聚體被稀釋，不妨礙正常代謝所需酶在正常的細(xì)胞中就存在：

RecA、RecBCD蛋白；DNApolymerase；ligaseRecA蛋白具有催化DNA分子之間的同源聯(lián)會(huì)和交換單鏈的功能97當(dāng)前97頁，總共149頁。RecombinativeRepair(strandtransferrepair)復(fù)制修復(fù)過程：含有二聚體的損傷DNA仍能復(fù)制，但子代DNA鏈在損傷的對(duì)應(yīng)部位出現(xiàn)缺口，通過DNA分子間的重組，從完整的親代鏈上把具有相應(yīng)堿基序列的片段轉(zhuǎn)到子鏈的缺口處，然后再聚合核苷酸填補(bǔ)親代鏈的缺口98當(dāng)前98頁，總共149頁。發(fā)生在復(fù)制后；易錯(cuò)修復(fù)SOS修復(fù)系統(tǒng)的存在是紫外線誘發(fā)突變的主要原因SOS修復(fù)是一種旁路系統(tǒng)，允許新生的DNA鏈越過TT而生長，代價(jià)是保真度的極大降低，是一個(gè)錯(cuò)誤潛伏的過程其原則是：喪失某些信息而存活總比死亡好當(dāng)SOS修復(fù)系統(tǒng)被活化后，校對(duì)系統(tǒng)大大喪失了識(shí)別雙螺旋結(jié)構(gòu)變形的能力，結(jié)束了空耗過程，而使復(fù)制繼續(xù)前進(jìn)SOS系統(tǒng)的酶只有細(xì)胞受到損傷時(shí)才出現(xiàn)(4)SOS修復(fù)^99當(dāng)前99頁，總共149頁。（2）SOS修復(fù)機(jī)制SOS修復(fù)－－無模板指導(dǎo)的DNA復(fù)制大劑量的紫外線照射，大量的二聚體產(chǎn)生SOS系統(tǒng)誘導(dǎo)，錯(cuò)誤潛伏的復(fù)制超越二聚體而進(jìn)行錯(cuò)誤堿基100當(dāng)前100頁，總共149頁。SOS修復(fù)系統(tǒng)涉及的2個(gè)基因：

recA：編碼RecA蛋白，該蛋白具有三種主要的生物化學(xué)活性：一是重組活性；二是單鏈DNA結(jié)合活性；三是蛋白酶活性。在細(xì)胞內(nèi)，DNA合成正常進(jìn)行時(shí)，RecA蛋白沒有蛋白酶活性，只有在DNA受到損傷或DNA復(fù)制受抑制時(shí)RecA蛋白才有活性。RecA蛋白在細(xì)胞中有少量存在

lexA：編碼LexA蛋白，是一種阻遏蛋白。該蛋白結(jié)合在SOS系統(tǒng)中各基因的操作子上，阻遏SOS基因的活性101當(dāng)前101頁，總共149頁。300XDNAdamagedSignal單鏈DNA、寡聚核苷酸RecAcleavesLexASOSUmuCmutationBeforeinducing.LexA-pRec-A,UmuC…11genesNeg.repressionU.V.damageDNASignal(S.S.DNAtailor5NtS.S.DNA)RecA高效表達(dá)目的基因表達(dá)目的基因被LexA阻遏lexA基因被LexA蛋白部分阻遏recA被LexA蛋白部分阻遏lexA表達(dá)但產(chǎn)物無活性機(jī)制正常生理狀態(tài)當(dāng)DNA的損傷被修復(fù)，DNA的復(fù)制難關(guān)渡過后，RecA的高效表達(dá)也停止，LexA的負(fù)控制機(jī)制重新被啟動(dòng)，SOS修復(fù)系統(tǒng)關(guān)閉。102當(dāng)前102頁，總共149頁。RecA在SOS修復(fù)反應(yīng)中起核心作用RecA與LexA組成調(diào)控環(huán)路DNA損傷SOSRecA受LexA的部分抑制103當(dāng)前103頁，總共149頁。當(dāng)DNA復(fù)制受阻/DNAdamaged能量大量消耗細(xì)胞內(nèi)原少量表達(dá)的RecA-p與S.S.DNA結(jié)合激活RecA-p的proteinase活性修復(fù)損傷LexA-p降解RecA-p高效表達(dá)300timesupSOSopen當(dāng)DNA正常復(fù)制時(shí)（無復(fù)制受阻，無DNA損傷，無TTdimer）RecA-p不表現(xiàn)proteinase活性104當(dāng)前104頁，總共149頁。當(dāng)DNA復(fù)制度過難關(guān)后SOSrepair是一種error-prone(傾向差錯(cuò))極強(qiáng)的修復(fù)機(jī)制是進(jìn)化中形成的“竭盡全力，治病救人”的措施（正常狀態(tài)下，SOS是關(guān)閉的）RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff105當(dāng)前105頁，總共149頁。（5）突變的形成DNA未經(jīng)修復(fù)經(jīng)過修復(fù)/校正突變/死亡傾向差錯(cuò)修復(fù)(重組修復(fù)，SOS）避免差錯(cuò)修復(fù)(光修復(fù)，切補(bǔ)修復(fù))形成突變不形成突變DNAdamaged/mispairing物理誘變，化學(xué)誘變，自發(fā)突變是突變發(fā)生的前提106當(dāng)前106頁，總共149頁。

R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制破壞外源DNA使之迅速降解7.4.3限制與修飾系統(tǒng)

(restrictionandmodificaion)?菌體限制修飾系統(tǒng)中的限制性內(nèi)切酶能將外來DNA切斷?菌體本身的DNA可受甲基化酶的保護(hù)（m6A、m5C）

兩者稱為限制-修飾作用107當(dāng)前107頁，總共149頁。以大腸桿菌為例，在K株和B株中都含有各自不同的限制――修飾系統(tǒng)，兩種不同來源的－噬菌體（lK和lB）長期寄生于各自的宿主細(xì)胞中，宿主細(xì)胞內(nèi)的甲基化酶已將其染色體DNA和噬菌體DNA特異性的保護(hù)，封閉了自身所產(chǎn)生的限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，故它們?cè)诟腥鞠鄳?yīng)的宿主細(xì)胞（K株和B株）時(shí)DNA不被降解，因此感染頻率很高。當(dāng)它們分別感染其他宿主細(xì)胞時(shí)，由于沒有特異性的保護(hù)作用，入侵的DNA分子被宿主細(xì)胞的限制性內(nèi)切酶切割降解，從而感染頻率急劇下降，普遍能低一或幾個(gè)數(shù)量極。

108當(dāng)前108頁，總共149頁。修飾的(B)大腸桿菌B限制作用(10-4)限制作用(10-4)大腸桿菌K

修飾的(K)11大腸桿菌寄主控制的限制修飾系統(tǒng)數(shù)字是生長在不同寄主中的噬菌體的成斑率細(xì)菌借助限制－修飾系統(tǒng)區(qū)別自己的DNA和外源DNA109當(dāng)前109頁，總共149頁。自己DNA:限制模式相同的DNA同株系的不同個(gè)體DNA、寄生于其中的質(zhì)粒和噬菌體居民DNA(residentDNA)：同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的不同類型的DNA包括細(xì)胞DNA，質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA等110當(dāng)前110頁，總共149頁。(2)細(xì)菌中三種不同類型的限制修飾酶目前已經(jīng)鑒定出有三種不同類型的核酸內(nèi)切限制酶，即I型酶、II型酶和III酶。II型酶由于其核酸內(nèi)切酶活性和甲基化作用活性是分開的，而且核酸內(nèi)切酶作用又具有序列特異性，所以在基因克隆中有特別廣泛的用途。限制性內(nèi)切酶：準(zhǔn)確裁剪DNA分子的工具111當(dāng)前111頁，總共149頁。II類限制性核酸內(nèi)切酶是Smith等人于1968年在流感嗜血桿菌d型菌株中發(fā)現(xiàn)的。該類酶是一種分子量較小的單體蛋白，其雙DNA的識(shí)別與切割活性僅需要Mg2+，且識(shí)別與切割位點(diǎn)的序列大都具有嚴(yán)格的特異性，因而在DNA重組實(shí)驗(yàn)中廣泛使用。

目前已分離出400余種II類限制性核酸內(nèi)切酶，鑒定識(shí)別及切割位點(diǎn)的有300多種，商品化的酶NEB（NewEnglandBiolabs）公司品種最多，達(dá)220余種，其中在DNA重組實(shí)驗(yàn)中常用的有20多種。

112當(dāng)前112頁，總共149頁。限制性內(nèi)切酶的類型113當(dāng)前113頁，總共149頁。114當(dāng)前114頁，總共149頁。II型核酸內(nèi)切酶的基本特性：絕大多數(shù)的II型核酸內(nèi)切酶都能識(shí)別由4～8個(gè)核苷酸組成的核苷酸序列（識(shí)別序列），識(shí)別序列具有回文結(jié)構(gòu)，如EcoRI(5’-GAATTC-3’)、PstI(5’-CTGCA-3’)等115當(dāng)前115頁，總共149頁。116當(dāng)前116頁，總共149頁。同裂酶(isoschizomers)：有些II型核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)的序列相同，但切點(diǎn)不一定相同，這些酶稱為同裂酶。如：HpaII和MspI是一對(duì)同裂酶，靶序列是CCGGHpaII--CCGG--MspI--GGCC--XmaI--C↓CCGGG--SmaI--CCC↓GGG--117當(dāng)前117頁，總共149頁。GGATCCCCTAGG同尾末端酶BglIIIBamHIAGATCTTCTAGA

GATCCGATCTAGAGATCCTCTAGG

同尾酶(isocaudamer)：有些II型核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生的DNA粘性末端相同、識(shí)別位點(diǎn)的序列不一定相同，這些酶稱為同尾酶如BamHI、BclI、BalII、Sau3AI和XhoII118當(dāng)前118頁，總共149頁。核酸內(nèi)切酶的命名法酶的基本名稱：屬名的第一個(gè)字母（大寫），種名的第一，二個(gè)字母（小寫）。如大腸桿菌(Escherichiacoli)，用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示用一個(gè)寫在右下方的標(biāo)注字母代表菌株或型，如Ecok大寫的羅馬數(shù)字，來區(qū)分同種微生物中不同限制與修飾體系的內(nèi)切酶，如流感嗜血菌Rd菌株的幾個(gè)限制修飾體系分別表示為HinI、HinII、HinIII等系統(tǒng)名稱R，M119當(dāng)前119頁，總共149頁。限制性核酸內(nèi)切酶在基因工程屬常用工具酶，主要用于基因物理圖譜的繪制、基因片段的鑒定或獲得、用于雜交的DNA探針的制備等，而酶切的條件控制則是非常重要的。120當(dāng)前120頁，總共149頁。在DNA的酶切反應(yīng)中酶切條件是酶切成功的關(guān)鍵，主要影響因素有：

（1）反應(yīng)溫度

常規(guī)酶切反應(yīng)均在37℃進(jìn)行，但有些酶的最佳反應(yīng)溫度并不是此溫度，如SmaI，最適反應(yīng)溫度為30℃，故最好根據(jù)所選用的酶確定反應(yīng)溫度。當(dāng)采用聯(lián)合酶切進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)尤其要注意選擇的反應(yīng)溫度是否都滿足兩者的要求，如果有一個(gè)酶的最適溫度不符，建議分步酶切

121當(dāng)前121頁，總共149頁。（2）緩沖體系

廠商提供的限制性核酸內(nèi)切酶有其相對(duì)應(yīng)的緩沖液，一般的緩沖液種類為4-10種左右，按鹽離子濃度可分為三大類：高鹽、中鹽和低鹽。緩沖液配制為10×的母液，酶切時(shí)稀釋10倍。常規(guī)酶切中均選用最佳緩沖液進(jìn)行酶切反應(yīng)，但聯(lián)合酶切時(shí)，根據(jù)廠商提供的聯(lián)合酶切的緩沖液選擇表（寶生物工程公司）選擇緩沖液或采用萬能緩沖液（Promega）

122當(dāng)前122頁，總共149頁。3）反應(yīng)時(shí)間

常規(guī)酶切反應(yīng)時(shí)間為1.5小時(shí)，但可根據(jù)酶切對(duì)象和酶的用量將保溫時(shí)間延長2～3小時(shí)，有時(shí)甚至可以過夜。一般來說，在DNA量固定的前提下，長時(shí)間酶切所需的酶量可適當(dāng)減少，所以在大劑量酶切DNA時(shí)，可以考慮酶切過夜。另對(duì)特殊實(shí)驗(yàn)，如對(duì)基因組DNA進(jìn)行部分酶切，則在酶量投入一定的前提下，減少反應(yīng)時(shí)間降低對(duì)DNA切割的程度。

123當(dāng)前123頁，總共149頁。（4）加入酶量

在底物（DNA）一定的條件下，酶量投入越多則酶切效果越好。但實(shí)驗(yàn)中常常出現(xiàn)酶量加入過多酶切效果卻反而差的現(xiàn)象，這主要是酶的儲(chǔ)存液中含有50％的甘油，但酶量加入過多，超過酶反應(yīng)體系的10％時(shí)，過多的甘油抑制了限制性內(nèi)切酶活性。因此，在酶切反應(yīng)時(shí)，酶量的加入原則：不超過反應(yīng)總體積的10％，在能切開的條件下加入越少越好（可減少酶的Star活性）。124當(dāng)前124頁，總共149頁。（5）DNA純度

在滿足上述條件下影響酶切效果的主要因素是DNA的純度，DNA樣品中蛋白含量過高、有機(jī)溶劑（苯酚或氯仿）的殘留、高濃度的RNA等。另外DNA濃度過高也會(huì)導(dǎo)致酶切失敗，一般DNA的質(zhì)量濃度在1mg/ml體系中能取得好的酶切效果。當(dāng)發(fā)生不明原因的酶切失敗時(shí)，常用的解決方法是采用稀釋酶切，即將酶切體系放大（如從15ul-->30ul），將雜質(zhì)相對(duì)濃度稀釋，這樣不需多增加酶量就能取得較好的酶切效果

125當(dāng)前125頁，總共149頁。酶切方式可分為部分酶切與完全酶切：

（1）部分酶切

指的是同一DNA片段上的位點(diǎn)有些被切開而另一些未被切開，此法主要用于基因的克隆。在某些基因內(nèi)部可能有此酶的切點(diǎn)，用完全酶切進(jìn)行克隆時(shí)難以得到完整基因。部分酶切實(shí)施方法：a）在不同的時(shí)間從同一個(gè)酶反應(yīng)管中取樣終止反應(yīng)，利用時(shí)間控制酶切程度，該方法比較繁瑣，不易掌握得恰到好處；b）固定酶切的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，控制酶的投入量，一般是在反應(yīng)管中加入不等量稀釋的酶，利用不同酶濃度控制酶切程度，該方法因易控制而被廣泛應(yīng)用。

（2）完全酶切

適用于除目的基因克隆以外的絕大多數(shù)DNA操作，例如載體的切割，酶切圖譜的制作，基因的鑒定與DNA片段的分離等。

126當(dāng)前126頁，總共149頁。在DNA重組實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常會(huì)用雙酶切（甚至是3個(gè)酶切鑒定）鑒定重組子或獲得不同粘性末端的DNA片段，而在廠商提供的聯(lián)合酶切緩沖液表中并不包括所有類型的酶，即使提供了“萬能緩沖液”，有些酶的聯(lián)合酶切也不一定能取得比較好的效果。解決方法：

（1）分步酶切法

對(duì)將進(jìn)行的兩種酶的酶切采用分步的方法，即先選擇一個(gè)酶，采用此酶的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行酶切，然后選用第二個(gè)酶進(jìn)行最佳反應(yīng)。此方法通用性較強(qiáng)，聯(lián)合酶切也比較完全，但較耗時(shí)。

（2）

同步酶切法

取兩種酶的最佳緩沖液各50％加入到酶切反應(yīng)體系中，并同時(shí)加入兩種酶進(jìn)行反應(yīng)。特別是對(duì)不同廠商提供的酶進(jìn)行聯(lián)合酶切時(shí)，即可節(jié)約時(shí)間也可取得比較好的酶切效果。

127當(dāng)前127頁，總共149頁。酶切失敗的原因及處理辦法

酶切失敗主要表現(xiàn)為兩方面：

（1）不完全酶切甚至是DNA基本未發(fā)生酶切；主要原因有：a）緩沖體系不合適，可進(jìn)行重新酶切；b）酶量加入過多而導(dǎo)致甘油抑制酶活，可將反應(yīng)體系適當(dāng)稀釋；c）DNA樣品雜質(zhì)含量高，可采用稀釋酶切或?qū)NA樣品重新抽提后酶切

（2）DNA被降解（不成帶狀）；主要原因是DNA樣品中含有痕量的DNA酶，建議重新抽提除去DNA酶。

128當(dāng)前128頁，總共149頁。BamHISacIBamHI/SacI雙酶切BamHI/SacI雙酶切BamHISacI連接PCR產(chǎn)物

129當(dāng)前129頁，總共149頁。7.4.4基因的回復(fù)突變（backmutation/reversemutation）(1)回復(fù)突變的概念野生型突變體mutation(lowF.)backmutation(verylowF.)(2)抑制突變的概念突變體所失去的野生型性狀通過第二次突變得到回復(fù)，第二次突變稱為回復(fù)突變第二點(diǎn)回復(fù)突變并沒有真正改變正向突變的DNA的堿基序列，只是正向突變的突變效應(yīng)被抑制了，因此第二點(diǎn)回復(fù)突變又稱為抑制突變抑制突變分為兩類：A.基因內(nèi)抑制突變(intragenicsuppresor)B.基因間抑制突變(intergenicsuppresor)130當(dāng)前130頁，總共149頁。間接抑制突變:不恢復(fù)正向突變基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能，而是通過改變其它蛋白質(zhì)的性質(zhì)或表達(dá)水平而補(bǔ)償原來突變?cè)斐傻娜毕?，從而恢?fù)野生型

野生表型恢復(fù)作用的性質(zhì)直接抑制突變:通過恢復(fù)或部分恢復(fù)原來突變基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的功能而恢復(fù)野生表型131當(dāng)前131頁，總共149頁。A.基因內(nèi)抑制突變抑制突變發(fā)生在正向突變的基因中錯(cuò)義突變和移框突變都可以被基因內(nèi)另一位點(diǎn)的突變所抑制由于處于同一基因中，正向突變和抑制突變一般緊密連鎖，因此常把基因內(nèi)抑制突變當(dāng)成真正的原點(diǎn)回復(fù)突變錯(cuò)義突變?cè)斐梢吧捅硇偷膯适В糠衷蛟谟谟绊懙降鞍踪|(zhì)的空間結(jié)構(gòu)(正負(fù)電荷、疏水作用)132當(dāng)前132頁，總共149頁。a、靜電作用錯(cuò)義突變的基因內(nèi)抑制突變133當(dāng)前133頁，總共149頁。b、疏水作用錯(cuò)義突變的基因內(nèi)抑制突變134當(dāng)前134頁，總共149頁。移框突變的抑制突變(基因內(nèi)第二點(diǎn)的插入或缺失)135當(dāng)前135頁，總共149頁。B.基因間抑制突變正向突變的無義突變、錯(cuò)義突變和移框突變都可以被另一基因上的突變所抑制，這些抑制突變分別稱為無義抑制突變、錯(cuò)義抑制突變和移框抑制突變抑制突變發(fā)生在tRNA基因或與tRNA功能有關(guān)的基因上，這些基因又稱為抑制基因抑制tRNA：能抑制正向突變表型的突變了的tRNA抑制tRNA是自發(fā)突變或誘發(fā)突變的結(jié)果，而不是細(xì)胞對(duì)于無義突變應(yīng)答的產(chǎn)物。抑制突變發(fā)生在正向突變基因外其它的基因中136當(dāng)前136頁，總共149頁。在編碼蛋白質(zhì)的基因中，無義突變的發(fā)生頻率很高，如AAG、CAG、GAG、UCG、UGG、UAC、UAU中任何一個(gè)密碼子都可以通過一次堿基替代突變而產(chǎn)生無義密碼子，使肽鏈合成提前終止

無義密碼子有三種UAG、UAA和UGA，相應(yīng)的無義抑制突變也有三種：

琥珀型抑制突變：產(chǎn)生識(shí)別UAG的抑制tRNA的基因赭石型抑制突變：