儀器分析課件高效液相色譜法詳解

儀器分析課件高效液相色譜法詳解演示文稿當前1頁，總共71頁。（優(yōu)選）儀器分析課件高效液相色譜法當前2頁，總共71頁。16-1概述

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。當前3頁，總共71頁。16-1-1高效液相色譜法

在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的?，F(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典色譜有較高的效率和實現(xiàn)自動化操作。

經(jīng)典液相色譜：流動相常壓輸送，所用固定相柱效低，分析周期長。

現(xiàn)代液相色譜：高壓輸送，柱效大大提高，同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)監(jiān)測。高效液相色譜法具有分析速度快，分離效能高，實現(xiàn)了自動化等特點。又稱為現(xiàn)代液相色譜法、高壓液相色譜法或高速液相色譜法。當前4頁，總共71頁。

和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相---固定相和流動相組成。液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動相是各種溶劑。16-1-2液相色譜分離原理及分類當前5頁，總共71頁。

被分離混合物由流動相液體推動進入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進行分離。

色譜分離的實質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。當前6頁，總共71頁。

根據(jù)分離機制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化學(xué)鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。當前7頁，總共71頁。

它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進行比較：當前8頁，總共71頁。

高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達103cm·min-1。高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法：當前9頁，總共71頁。

例如分離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3·h-1，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。當前10頁，總共71頁。

（l）兩者應(yīng)用范圍不同。氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20％。對于占有機物總數(shù)近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。

高效液相色譜法與氣相色譜法：當前11頁，總共71頁。（2）液相色譜能完成難度較高的分離工作，因為：

①氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過程，與樣品分子無親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中，流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動相，增大分離的選擇性。當前12頁，總共71頁。

②液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜等，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。當前13頁，總共71頁。

（3）由于液體的擴散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴張可以忽略不計。（4）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復(fù)雜，價格昂貴。在實際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補充的。當前14頁，總共71頁。

綜上所述，高效液相色譜法具有高柱效，高選擇性，分析速度快，靈敏度高，重復(fù)性好和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴格，這是它的主要缺點。當前15頁，總共71頁。16-2高效液相色譜儀當前16頁，總共71頁。當前17頁，總共71頁。當前18頁，總共71頁。當前19頁，總共71頁。當前20頁，總共71頁。

高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見圖16-2，一般可分為5個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)和記錄系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。當前21頁，總共71頁。16-2-1高壓輸液系統(tǒng)（1）溶劑貯存器（2）高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10m），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。當前22頁，總共71頁。（3）梯度洗脫裝置梯度洗脫就是在分離過程中使用兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH或離子強度相應(yīng)的變化，以達到提高分離效果，縮短分析時間的目的。當前23頁，總共71頁。外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。當前24頁，總共71頁。梯度洗脫的實質(zhì)是通過不斷的變化流動相的強度，來調(diào)整混合試樣中各組分的k’值，使所有譜帶都以最佳平均k’值通過色譜柱。它在液相色譜分離中所起的作用相當于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k’值的變化是通過改變?nèi)軇┑臉O性、pH和離子強度來實現(xiàn)的，而不是借助改變溫度來實現(xiàn)的。當前25頁，總共71頁。16-2-2進樣系統(tǒng)

通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：當前26頁，總共71頁。16-2-3

分離系統(tǒng)

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。當前27頁，總共71頁。16-2-4液相色譜檢測器

作用---用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。表16-1當前28頁，總共71頁。16-3液固色譜法

液-固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附能力的差異來進行分離的，也稱液固吸附色譜。當前29頁，總共71頁。16-3-1吸附機理

當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保留（就要取代數(shù)目相當?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓肿樱┯谑?，在固定相表面發(fā)生競爭吸附:

Xm+nSad==Xad+nSm

Xm和Xad分別表示在溶劑中和被吸附的溶質(zhì)分子，Sad和Sm表示被吸附劑所吸附和在流動相中游離的溶劑分子，n表示吸附X分子所需要解吸的S分子數(shù)目。當前30頁，總共71頁。當吸附劑對溶質(zhì)分子的吸附能力大于對溶劑分子的吸附能力時，溶質(zhì)分子就吸附在吸附劑上，而將溶劑分子脫附；反之，溶質(zhì)分子脫附。顯然，溶質(zhì)分子的吸附能愈大，則保留值愈大；反之，保留值小或不被保留。當前31頁，總共71頁。吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和物理化學(xué)性質(zhì)，試樣的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。組分與吸附劑性質(zhì)近似時，易被吸附，呈現(xiàn)高的保留值；當組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時，易于吸附。從而使吸附色譜成為分離幾何異構(gòu)體的有效手段；不同的官能團具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對同系物沒有選擇性，不能用該法分離相對分子質(zhì)量不同的同系物。當前32頁，總共71頁。16-3-2液固色譜固定相固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見的就是活性炭。極性吸附劑又分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧酸和吡咯衍生物。最常用的是硅膠，其次是氧化鋁。很多薄層色譜和經(jīng)典色譜是用硅膠進行分離的。現(xiàn)代液相色譜中硅膠不僅作為液固吸附色譜固定相，還可作為液液分配色譜的載體和鍵合相色譜填料的基體。表16-2。當前33頁，總共71頁。16-3-3液固色譜流動相液相色譜的流動相必須符合下列條件：（1）能溶解試樣，但不能與試樣發(fā)生反應(yīng)；（2）與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)；（3）黏度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效；（4）應(yīng)與所用檢測器相匹配，例如利用紫外檢測器時，溶劑要不吸收紫外光；（5）容易精制、純化，毒性小，不易著火，價格盡量便宜等。當前34頁，總共71頁。選擇流動相的基本原則是極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用低極性流動相。為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果試樣組分的分配比值范圍很廣，則采用梯度洗脫。當前35頁，總共71頁。16-3-4應(yīng)用

液固色譜最適宜分離那些溶解在非極性溶劑中、具有中等相對分子質(zhì)量且為非離子型的試樣。特別適用于分離異構(gòu)體。當前36頁，總共71頁。16-4液液色譜法16-4-1分離原理

液液色譜又稱液液分配色譜，分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。分配系數(shù)小的組分，保留值小，先流出柱。與氣相色譜不同的是，流動相的種類對分配系數(shù)有較大的影響。當前37頁，總共71頁。16-4-2固定相液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類。（1）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；（2）全多孔型載體由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑為30-50μm的多孔型顆粒（3）全多孔型粒子載體由nm級的硅膠粒子堆積而成，又稱堆積硅珠，載體粒度為5-10μm，由于顆粒小，所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體。當前38頁，總共71頁。

由于液液色譜中流動相參與選擇競爭，因此，對固定相選擇較簡單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題。例如，最常用的強極性固定液β，β′-氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈?。當?9頁，總共71頁。

為了更好解決固定液在載體上流失問題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機基團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進行的。當前40頁，總共71頁。16-4-3流動相在液液色譜中為了避免固定液的流失。對流動相的一個基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。當前41頁，總共71頁。

如果采用極性物質(zhì)作為固定相，非極性溶劑作流動相（流動相的極性小于固定相的極性），稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用非極性物質(zhì)為固定相，極性溶劑為流動相（流動相的極性大于固定相的極性），稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，例如適于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物，其流出順序與正相色譜恰好相反。

當前42頁，總共71頁。16-5化學(xué)鍵合相色譜法采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。它是由液相色譜發(fā)展起來的，但因分離機制和固定相特性方面都與液液色譜涂層有差別，另外也因化學(xué)鍵合相色譜在現(xiàn)代液相色譜中占有重要地位，所以一般不宜將化學(xué)鍵合相色譜稱為液液色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。當前43頁，總共71頁。根據(jù)鍵合相與流動相之間相對極性的強弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。在極性鍵合相色譜中，由于流動相的極性比固定相極性要小一些，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的反相色譜系指非極性鍵合相色譜。當前44頁，總共71頁。16-5-1化學(xué)鍵合固定相法化學(xué)鍵合固定相一般采用硅膠（薄殼型或全多空微粒型）為基體，在鍵合反應(yīng)之前，要對硅膠進行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機物或有機硅化物起反應(yīng)，制備化學(xué)鍵合固定相。鍵合相可分為下列四種鍵型：當前45頁，總共71頁。（l）硅酸酯（≡Si一OR）鍵合固定相

它是最先用于液相色譜的鍵合固定相。用醇與硅羥基發(fā)生酯化反應(yīng)：

≡Si－OH＋ROH→≡Si－OR＋H2O

由于這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性，但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動相。一般用極性小的溶劑，分離極性化合物。當前46頁，總共71頁。（2）≡Si－C或Si-N共價鍵合固定相共價鍵鍵合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點是格氏反應(yīng)不方便；當使用水溶液時，必須限制pH在4～8范圍內(nèi)。當前47頁，總共71頁。（3）硅烷化（≡Si-O-Si-C）鍵合固定相

這類鍵合固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機溶劑的優(yōu)點。能在70℃以下，pH=2～9范圍內(nèi)正常工作，是目前應(yīng)用最廣泛的鍵合相。當前48頁，總共71頁。16-5-2反相鍵合相色譜法此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C18H37、硅膠-苯基等；流動相是采用極性較強的溶劑，如甲醇、乙睛-水、水和無機鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；當前49頁，總共71頁。關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強的疏水特性。當用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團的有機化合物時：當前50頁，總共71頁。

一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。當前51頁，總共71頁。當前52頁，總共71頁。反相色譜應(yīng)用非常廣泛，自1976年以來，高效液相色譜分離任務(wù)的60%-80%是用反相來完成的。反相色譜具有通用型液相色譜的特點。常規(guī)反相色譜技術(shù)，不僅可以分離不同類型的化合物，尤其適于分離同系物，非極性及極性較弱的化合物，例如多環(huán)芳烴等低極性化合物?？刂齐x子化技術(shù)，用流動相加入緩沖溶液或改變pH的方法，分離不離子化或弱離子化的體系。當前53頁，總共71頁。16-5-3正相鍵合相色譜法此法是以極性的有機基團，CN、NH2、雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為流動相，分離極性化合物。當前54頁，總共71頁。

此時，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動相極性的增加而降低。這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。當前55頁，總共71頁。16-5-4離子性鍵合相色譜法當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團，如-SO3H，-CH2NH2、－COOH、-CH2N（CH3）等時，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。當前56頁，總共71頁?；瘜W(xué)鍵合相色譜的優(yōu)點：適用于分離所有類型的化合物。一方面通過控制化學(xué)鍵合反應(yīng)，可以把不同的有機基團鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過改變流動相的組成和種類來有效的分離非極性、極性和離子型化合物。由于鍵合到載體上的基團不易被剪切而流失，不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。當前57頁，總共71頁。鍵合固定相對不太強的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。這類固定相柱效高，使用周期長，分析重現(xiàn)性好。當前58頁，總共71頁。當前59頁，總共71頁。16-6離子交換色譜法（IEC）

離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分離的。

其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。16-6-1分離原理當前60頁，總共71頁。當待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：陽離子交換：R-SO3H+M+=R-SO3M+H+

陰離子交換：R-NR4OH+X-=R-NR4X+OH-

平衡常數(shù)K值越大，表示組分的離子與離子交換樹脂的相互作用越強。由于不同的物質(zhì)在溶劑中解離后，對離子交換中心具有不同的親和力，因此，具有不同的平衡常數(shù)。親和力大的，在柱中的停留時間長，具有高的保留值。當前61頁，總共71頁。16-6-2固定相常用的固定相為離子交換樹脂。目前常用的離子交換樹脂分為三種型式，一是常見的純離子交換樹脂；二是玻璃珠等硬芯子表面涂一層樹脂薄層構(gòu)成的表面層離子交換樹脂，具有很高的柱效，但柱容量不大；三是大孔徑網(wǎng)絡(luò)樹脂，適用于非水溶液中物質(zhì)的分離，因為它們的孔徑和內(nèi)表面積大，不需要溶脹，便可滿意地使用。當前62頁，總共71頁。按結(jié)合的基團不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂具有與試樣中陽離子交換的基團，又可分為強酸性和弱酸性樹脂。陰離子交換樹脂具有與試樣中陰離子可交換的基團，又可分為強堿性和弱堿性。表16-6.當前63頁，總共71頁。16-6-3流動相最常用的是水緩沖溶液，有時也使用有機溶劑如甲醇，或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提供特殊的選擇性，并改善試樣的溶解度。所用的緩沖溶液，通常由下列化合物配制：鈉、鉀、銨的檸檬酸鹽，磷酸鹽，甲酸鹽與其相應(yīng)的酸混合成酸性緩沖溶液或氫氧化鈉混合成堿性緩沖溶液等。當前64頁，總共71頁。16-6-4應(yīng)用主要是用來分離離子或可解離的化合物。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例