昆蟲(chóng)酚氧化酶的研究進(jìn)展綜述,昆蟲(chóng)學(xué)論文

昆蟲(chóng)酚氧化酶的研究進(jìn)展綜述,昆蟲(chóng)學(xué)論文昆蟲(chóng)酚氧化酶〔phenoloxidase,PO〕是一種含銅離子結(jié)合位點(diǎn)的氧化酶[1],可催化2類(lèi)反響：一是催化單酚的加氧化作用，生成聯(lián)苯酚；二是催化聯(lián)苯酚的氧化作用，生成聯(lián)苯醌。在昆蟲(chóng)體內(nèi)酚氧化酶可催化天然底物--酪氨酸的氧化反響，產(chǎn)生二羥基苯丙氨酸即多巴〔dopa〕，多巴經(jīng)脫氨或脫羧構(gòu)成多巴醌〔dopaquinone〕或多巴胺〔dopamine〕，在一系列酶的作用下構(gòu)成黑素〔melanin〕[2].1昆蟲(chóng)酚氧化酶的功能昆蟲(chóng)酚氧化酶在免疫應(yīng)答、異源物包囊經(jīng)過(guò)中起關(guān)鍵作用。昆蟲(chóng)存在2種不同類(lèi)型的包囊作用：細(xì)胞型包囊〔cellularencapsulation〕和黑素型包囊〔melanoticencapsulation〕[3].細(xì)胞型包囊主要發(fā)現(xiàn)于血細(xì)胞數(shù)目較多的昆蟲(chóng)如鱗翅目中：首先由粒細(xì)胞〔granularcells〕和漿細(xì)胞〔plasmatocytes〕包裹外源物，構(gòu)成一個(gè)由數(shù)層細(xì)胞組成的包囊，然后包囊內(nèi)部發(fā)生黑素化并殺死被包裹的入侵有機(jī)體[4].黑素型包囊主要發(fā)現(xiàn)于血細(xì)胞數(shù)目較少的雙翅目昆蟲(chóng)中，透明物質(zhì)〔可能是活性酚氧化酶〕和黏性蛋白首先包被外源物質(zhì)外表，然后酚氧化酶催化酪氨酸生成黑素，黑素再與包被物交聯(lián)構(gòu)成膜鞘[5].當(dāng)昆蟲(chóng)受傷時(shí)，創(chuàng)傷處會(huì)出現(xiàn)深色色素區(qū)，這是由于酚氧化酶在傷口處將酚氧化成醌，最終構(gòu)成黑素所致。黑素能夠?qū)⒀馨湍Y(jié)作用〔coagulation〕產(chǎn)生的凝膠類(lèi)物質(zhì)進(jìn)一步硬化、黑化，堵塞傷口防止血淋巴流失，并阻止入侵的微生物乘機(jī)進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)，由此對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保衛(wèi)作用[6].酚氧化酶還介入昆蟲(chóng)外骨骼的鞣化和骨化。該酶與乙?；竻f(xié)同作用產(chǎn)生昆蟲(chóng)表皮鞣化、骨化的關(guān)鍵物質(zhì)--N-乙酰多巴胺。N-乙酰多巴胺的芳香環(huán)和支鏈都可介入表皮蛋白質(zhì)交聯(lián)。鞣化是通過(guò)表皮蛋白質(zhì)的氮原子與芳香環(huán)活化位點(diǎn)共價(jià)連接；而骨化則利用N-乙酰多巴胺活化的支鏈同表皮蛋白質(zhì)連接[7].酚氧化酶是昆蟲(chóng)應(yīng)對(duì)外源物入侵的免疫防御屏障，也是黑素合成、傷口愈合與外骨骼硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究酚氧化酶對(duì)于闡釋昆蟲(chóng)免疫防御機(jī)制，理解蝗蟲(chóng)體內(nèi)的免疫和生理、生化經(jīng)過(guò)具有重要意義。2昆蟲(chóng)酚氧化酶的激活多數(shù)昆蟲(chóng)酚氧化酶以無(wú)活性的酶原形式--酚氧化酶原〔prophenoloxidase,PPO〕，存在于昆蟲(chóng)血淋巴、中腸和表皮等組織。當(dāng)病原微生物入侵時(shí)，昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)通過(guò)絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)途徑切除酚氧化酶原N-端50多個(gè)氨基酸，使其成為活化的酚氧化酶，介入機(jī)體的免疫防御反響。詳細(xì)激活途徑在幾種形式生物假如蠅、煙草天蛾和赤擬谷盜中相對(duì)清楚明晰。下面以煙草天蛾酚氧化酶原激活途徑為例介紹，見(jiàn)圖1.首先革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)的肽聚糖或真菌的-1,3-葡聚糖與-1,3-葡聚糖辨別蛋白的復(fù)合物，可將血淋巴蛋白酶14前體激活為血淋巴蛋白酶14;接著血淋巴蛋白酶14又將血淋巴蛋白酶21前體剪切激活為血淋巴蛋白酶21;然后血淋巴蛋白酶21又將酚氧化酶原活化蛋白酶2和3的前體水解為酚氧化酶原活化蛋白酶2和3.革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁與C-型凝集素和-1,3-葡聚糖辨別蛋白結(jié)合后可以不經(jīng)血淋巴蛋白酶21而直接激活酚氧化酶原活化蛋白酶2和3前體；最終，酚氧化酶原活化蛋白酶2和3剪切酚氧化酶原得到活化的煙草天蛾酚氧化酶。3昆蟲(chóng)酚氧化酶的調(diào)控酚氧化酶的催化產(chǎn)物--醌衍生物不僅殺死寄生蟲(chóng)和病原菌，對(duì)本身細(xì)胞也有毒害作用。因而酚氧化酶原激活系統(tǒng)遭到嚴(yán)格的調(diào)控。絲氨酸蛋白酶抑制劑-4可抑制血淋巴蛋白酶21活化，絲氨酸蛋白酶抑制劑-1J、-3和-6則抑制酚氧化酶原活化蛋白酶2和3的激活，它們最終都抑制酚氧化酶原的激活[9].實(shí)際上無(wú)論是激活途徑還是抑制效應(yīng)都要?dú)w結(jié)為一點(diǎn)--酚氧化酶原N-端氨基酸的剪切調(diào)控。當(dāng)前，不完全變態(tài)昆蟲(chóng)酚氧化酶原絲氨酸水解級(jí)聯(lián)活化機(jī)制還不明了，蛋白酶剪切位點(diǎn)也無(wú)報(bào)道。昆蟲(chóng)酚氧化酶在黑素合成、體壁硬化和免疫應(yīng)答反響中起關(guān)鍵作用，而酚氧化酶正常行使功能必須經(jīng)過(guò)酶原激活步驟，但不完全變態(tài)昆蟲(chóng)相關(guān)機(jī)制研究幾乎還是空白，從分子水平開(kāi)展不完全變態(tài)昆蟲(chóng)酚氧化酶的激活機(jī)制研究對(duì)于理解酚氧化酶原怎樣行使功能具有重要的理論意義。4昆蟲(chóng)酚氧化酶的研究現(xiàn)在狀況早期的昆蟲(chóng)酚氧化酶研究?jī)H限于初步的酶活測(cè)定和基本理化性質(zhì)研究。通常采用硫酸銨分級(jí)沉淀、離子交換層析、分子排阻層析等方式方法純化酚氧化酶原，再經(jīng)胰蛋白酶或變性劑處理，得到活化的酚氧化酶[8].1999年，Lee等從大黃粉蟲(chóng)〔Tenebriomolitor〕克隆得到了第一個(gè)昆蟲(chóng)酚氧化酶原基因[9].翌年，Hatta等也報(bào)道了黑腹果蠅〔Drosophilamelanogaster〕酚氧化酶原基因。隨后該酶的分子生物學(xué)研究得到長(zhǎng)足發(fā)展，至今已有15種昆蟲(chóng)的酚氧化酶原基因被相繼克隆。多數(shù)昆蟲(chóng)含有2類(lèi)酚氧化酶原基因，即酚氧化酶原1〔prophenoloxidase1,PPO1〕和酚氧化酶原2〔prophenoloxidase2,PPO2〕。但也有例外如：岡比亞按蚊〔Anophelesgambiae〕有6個(gè)酚氧化酶原基因，而瘤姬蜂〔Pimplahypochondria〕有3個(gè)。組織特異性表示出方面，酚氧化酶原基因在岡比亞按蚊的頭、胸、腹和馬氏管[10];成年雌性斯氏按蚊〔Anophelesstephensi〕的脂肪體和體壁[11],棉鈴蟲(chóng)〔Helicoverpaarmigera〕的體壁、血細(xì)胞和中腸均有明顯表示出[12],但騷擾阿蚊〔Armigeressubalbatus〕只能在血細(xì)胞中檢測(cè)到酚氧化酶原基因，而在脂肪體、中腸和卵巢中均未檢測(cè)到[13].這表示清楚不同物種間酚氧化酶原基因的組織表示出存在差異。當(dāng)前，昆蟲(chóng)酚氧化酶研究還主要集中在完全變態(tài)昆蟲(chóng)；而不完全變態(tài)昆蟲(chóng)的相關(guān)研究較少，且大多停留在注射病原或寄生蟲(chóng)后、觀察酚氧化酶活性變化，缺少分子水平的證據(jù)?；认x(chóng)僅3條基因序列報(bào)道：王世貴等從紅褐斑腿蝗〔Diabolocatantopspinguis〕獲得1條2445bp的酚氧化酶原2〔PPO2〕的cDNA序列；從飛蝗中獲得2條2143bp和2471bp的酚氧化酶原〔PPO1和PPO2〕的cDNA序列。還沒(méi)有關(guān)于這3個(gè)基因在mRNA及蛋白水平，不同部位和齡期間差異表示出的報(bào)道。Anas等經(jīng)凝膠層析、離子交換層析、親和層析3步從飛蝗血淋巴中得到分子量為250kDa的酚氧化酶原，并揣測(cè)它是由81kDa亞基組成的三聚體[14];也有報(bào)道指出亞洲飛蝗酚氧化酶原是由78kDa亞基組成的同源二聚體[15].遺憾的是文獻(xiàn)并沒(méi)有提供酚氧化酶原的氨基酸序列信息，因而還不清楚它們是由PPO1還是PPO2組成的。2018年Li等成功解析了煙草天蛾酚氧化酶原的晶體構(gòu)造，這是首例3-型銅蛋白家族酚氧化酶構(gòu)造數(shù)據(jù)[16].它的頒布為酚氧化酶的構(gòu)造研究指明了方向。文章指出煙草天蛾酚氧化酶原為異源二聚體，含有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的3-型雙銅活性中心，每個(gè)銅離子由3個(gè)保守的組氨酸結(jié)合，N-端51位精氨酸殘基為蛋白酶切位點(diǎn)，并揣測(cè)該酶原的N-端電荷和酶構(gòu)造變化在激活經(jīng)過(guò)中起關(guān)鍵作用。5總結(jié)不完全變態(tài)昆蟲(chóng)是昆蟲(chóng)綱的重要成員，但不完全變態(tài)昆蟲(chóng)酚氧化酶原的研究還較為薄弱。根據(jù)果蠅、岡比亞按蚊、赤擬谷盜等完全變態(tài)昆蟲(chóng)的酚氧化酶的生理功能與調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步深切進(jìn)入研究不完全變態(tài)昆蟲(chóng)的酚氧化酶原的激活與調(diào)控規(guī)律，對(duì)于人類(lèi)愈加全面的了解昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)的生理功能及調(diào)控機(jī)制具有重要意義。以下為參考文獻(xiàn)[1]KanostMR,JiangHB,YuXQ.Innateimmuneresponsesofalepidopteraninsect,Manducasexta[J].ImmunologicalReviews,2004,198:97-105.[2]TangH.RegulationandfunctionofthemelanizationreactioninDrosophila[J].Fly〔Austin〕，2018,3:105-111.[3]呂鴻聲。昆蟲(chóng)免疫學(xué)原理[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2008.[4]吳姍，凌爾軍。昆蟲(chóng)細(xì)胞免疫反響中的吞噬、集結(jié)和包囊作用[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2018,52:791-798.[5]劉守柱。昆蟲(chóng)酚氧化酶免疫學(xué)功能及其對(duì)殺蟲(chóng)劑等外來(lái)干擾因子的響應(yīng)[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.[6]BidlaG,Hauling