A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選

實驗內(nèi)容

1.PCR產(chǎn)物與T載體的連接

2.感受態(tài)細(xì)胞的制備，

連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!實驗一、PCR產(chǎn)物與T載體的連接A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!Tvector1μl10×ligationbuffer1μlPCR回收產(chǎn)物7μlT4DNALigase1μl輕彈管底混合，離心機甩一下，置25oC水浴1~2h。連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化，也可以置-20oC保存?zhèn)溆谩＃ǖ蜏剡B接效果比室溫好）。1.連接反應(yīng)A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!2.TA克隆原理TagDNA聚合酶的一個功能：使PCR產(chǎn)物的3`端突出一個A。3`

AA3`5`5`3`

TT3`5`5`商業(yè)設(shè)計的T載體：在3`端多出一個T。兩者的粘性末端可以互補配對。應(yīng)用時避免反復(fù)凍融，防止T的斷裂丟失。如果與T載體連接后主要以自身環(huán)化為主，要考慮T可能已經(jīng)丟失。A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!實驗二、感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!2.注意事項：1）感受態(tài)細(xì)胞的膜已經(jīng)很脆，應(yīng)該超低溫保存。

如果反復(fù)凍融會使細(xì)胞活力受影響，而且細(xì)胞膜的變化可能復(fù)原，由感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)回轉(zhuǎn)到普通細(xì)胞狀態(tài)，失去接受外源DNA的能力。2）無菌操作。在火焰附近操作，火焰附近是無菌區(qū)。各種器具均需消毒。A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!無菌超凈工作臺A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!5）棄上清，除凈剩余液體，然后加入100ul冰冷的100mmol/LCaCl2致敏液懸浮細(xì)胞，冰浴5分鐘。6）6000rpm，離心5分鐘，回收細(xì)胞，棄上清，加入100ul冰冷100mmol/LCaCl2溶液，懸浮細(xì)胞。7）4oC可保存1-2周；長期保存，可加甘油至終濃度為15%，置-70oC備用。注意：（無菌操作）4）

取1ml菌液冰浴5min，然后6000rpm，離心5min，收集菌體。A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!

4）6,000rpm，離心10秒鐘，倒掉上清，用剩余的約200lLB培養(yǎng)液重懸菌體。5）將殘存菌液輕輕混勻，鋪于含有氨基芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上涂勻，室溫放置5-10min，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)14-16小時。注意事項：轉(zhuǎn)化后的平皿面朝下放置：防止水蒸氣形成的水滴影響細(xì)菌單菌落的形成。A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!其他說明：1）

連接反應(yīng)的關(guān)鍵是目的基因片段與載體的比例，一般片段與載體比例為2:1或3:1（摩爾比），根據(jù)片段大小決定比例。2）平端連接平端連接通常需要先將載體的5端磷酸去掉，然后再進(jìn)行連接，這樣可以防止載體的自身環(huán)化。當(dāng)載體的5端磷酸去掉后，片段與載體的連接就會留下一個缺口，連接酶由于載體5端缺乏磷酸而無法形成磷酸二酯鍵，轉(zhuǎn)化入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酶會將缺乏的磷酸基團加上，再形成磷酸二酯鍵。A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!

培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌在低滲CaCl2

存在的情況下，細(xì)菌變得膨脹而易于外源基因的導(dǎo)入。另外，鈣離子溶液處理的細(xì)胞對外源DNA的攝取能力增強。1.感受態(tài)細(xì)胞制備原理A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!無菌操作的注意事項

槍頭、EP管、試管、平皿等，各種試劑都是經(jīng)過高壓滅菌后在超凈臺中專用的，但加樣器需要自帶。取飯盒中的槍頭、EP管時，都要用在酒精燈上燒灼后的鑷子夾取。燒瓶、試管、玻璃棒等玻璃器具，使用前和蓋蓋兒前要在酒精燈上燒灼一下瓶口。塑料制品，如槍頭和EP管不能用酒精燈燒灼。手臂盡量不要在敞開的容器上方移動，以免落入雜菌。超凈臺事先要打開紫外燈照射至少20min進(jìn)行消毒，使用時要打開風(fēng)機，。操作前要用酒精擦拭手臂或帶手套。（超凈臺內(nèi)操作）A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!1）將大腸桿菌在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37oC12-16小時。2）

次日從瓊脂平板上取一單菌落于2mlLB培養(yǎng)基中，37oC，225rpm速度震蕩培養(yǎng)12-16小時。3）

取1ml上述培養(yǎng)物接種于100mlLB培養(yǎng)基中，37oC，225rpm的速度震蕩培養(yǎng)直至OD值為0.5左右(約3小時)。

（上述1－3步驟已經(jīng)由實驗室完成）水浴搖床3.感受態(tài)細(xì)胞的制備過程A連接,感受態(tài)細(xì)胞制備,轉(zhuǎn)化及篩選共15頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!1）將200l感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，然后加入3lDMSO,混合后，加入10l連接反應(yīng)液(含重組質(zhì)粒),

溫和混勻，置冰上10分鐘。

(目的：防止細(xì)胞被脹破。)

2）42oC，45秒，然后迅速放回冰中1-2分鐘。1.轉(zhuǎn)化的實驗步驟3）加入1ml