核酸分離純化經(jīng)典

演示文稿核酸分離純化經(jīng)典版當前1頁，總共41頁。（優(yōu)選）核酸分離純化經(jīng)典版當前2頁，總共41頁。核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎。無論是進行核酸結構還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關系到實驗的成敗。概述當前3頁，總共41頁。一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級結構的完整性1.意義：遺傳信息全部儲存在一級結構之中，核酸的—級結構還決定其高級結構的形式以及和其他生物大分子結合的方式。當前4頁，總共41頁。2.實驗過程中，應注意以下條件及要求：1）減少化學因素對核酸的降解:pH4-102）減少物理因素對核酸的機械剪切力：0-4C

強烈振蕩、攪拌，細胞突置于低滲液中，細胞裂解，反復凍貯等造成的機械剪切力等條件都能明顯破壞大分子量的線性DNA分子，對于分子量小的環(huán)狀質(zhì)粒DNA及RNA分子，威脅相對小一些；另外如高溫加熱，除高溫本身對核酸分子中的化學鍵的破壞作用外，還可能因煮沸帶來液體剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的條件下進行。

（一）保持核酸分子一級結構的完整性當前5頁，總共41頁。3）抑制DNase或RNase的活性：

所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。4）簡化步驟，縮短時間，減少破壞。（一）保持核酸分子一級結構的完整性當前6頁，總共41頁。3.DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：

DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA、檸檬酸鹽絡合Mg2+、Ca2+等離子。(2）陰離于型表面活性劑：

如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。（一）保持核酸分子一級結構的完整性當前7頁，總共41頁。4.RNA酶（RNAase)抑制劑

RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素。(1)皂土（bentonite）作用機制：皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。

（一）保持核酸分子一級結構的完整性當前8頁，總共41頁。(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)

(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。作用機制：與蛋白質(zhì)中His結合使蛋白變性。

使用注意：

DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA時，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。劇毒。（一）保持核酸分子一級結構的完整性4.RNA酶（RNAase)抑制劑當前9頁，總共41頁。（3)肝素（4）復合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)4.RNA酶（RNAase)抑制劑（一）保持核酸分子一級結構的完整性當前10頁，總共41頁。一、核酸分離、純化原則(二)盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度純化的核酸樣品不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑或過高濃度的金屬離子，蛋白質(zhì)、脂類、多糖分子的污染應降低到最低程度；無其它核酸分子的污染，如提DNA分子時，應去除RNA分子。當前11頁，總共41頁。破碎組織細胞提取純化I.材料與方法的選擇II.破碎細胞或包膜－核酸的釋放III.核酸分離、純化IV.核酸的濃縮、沉淀、洗滌,并去除雜質(zhì)

V.核酸的鑒定與保存二、分離提取核酸的主要步驟當前12頁，總共41頁。臨床常見的標本有血液、尿液、唾液、組織及體外培養(yǎng)的細胞等都可作為提取核酸的原料，具體實驗材料的選擇應根據(jù)實驗的目的來確定。不同的研究目的對核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度有不同的要求。需考慮制備核酸所需的時間與成本：簡便快速、安全、經(jīng)濟；應選擇安全的試劑與制備方案：完整性、產(chǎn)量、純度和濃度符合實驗要求。（一）材料與方法的選擇當前13頁，總共41頁。臨床常見的標本有血液、尿液、唾液、組織及體外培養(yǎng)的細胞等都可作為提取核酸的原料，具體實驗材料的選擇應根據(jù)實驗的目的來確定。不同的研究目的對核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度有不同的要求。需考慮制備核酸所需的時間與成本：簡便快速、安全、經(jīng)濟；應選擇安全的試劑與制備方案：完整性、產(chǎn)量、純度和濃度符合實驗要求。（一）材料與方法的選擇當前14頁，總共41頁。DNA和RNA均位于細胞內(nèi)（病毒除外），因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細胞、釋放核酸。（二）細胞的破碎——核酸的釋放當前15頁，總共41頁。破碎細胞的方法有三種：①機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學試劑法：用SDS處理細胞，SDS可溶解細胞膜、核膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并使組織蛋白與DNA分離；③酶解法：加入溶菌酶或蛋白酶，都可使細胞膜破裂，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結合的蛋白質(zhì)，促進核酸分離。（二）細胞的破碎——核酸的釋放當前16頁，總共41頁。注意：1.細胞破碎方法中機械剪切法不能用于基因組DNA的提??；2.非機械法常用化學試劑或酶細胞溶解法。（二）細胞的破碎——核酸的釋放當前17頁，總共41頁。細胞裂解物是含核酸分子的復雜混合物，核酸分子本身可能仍與蛋白質(zhì)結合在一起。核酸與蛋白質(zhì)的結合力主要是正負靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。（三）核酸的分離純化當前18頁，總共41頁。

應該清除的雜質(zhì)主要包括:1.非核酸的大分子污染物蛋白質(zhì)、多糖及脂類物質(zhì)等大分子物質(zhì)

2.非目的的核酸分子分離某一核酸分子時，其它核酸皆為雜質(zhì)

3.加入的有機溶劑和某些金屬離子（三）核酸的分離純化當前19頁，總共41頁。1.加入濃鹽溶液（如NaCl）RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同濃度氯化鈉溶液中的溶解度有顯著區(qū)別。DNA核蛋白在0.14mol/L氯化鈉中溶解度低，但在1–2mol/L氯化鈉中溶解度高；RNA核蛋白在0.14mol/L氯化鈉中溶解度仍有相當大的溶解度。調(diào)節(jié)氯化鈉濃度，可使RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取開來。核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；

核酸分離純化的基本方法當前20頁，總共41頁。2.加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；

核酸分離純化的基本方法當前21頁，總共41頁。3.酚/氯仿抽提細胞裂解后離心分離含核酸的水相，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，混勻后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機相，核酸則被留于上層水相。在含核酸的水相中加入醋酸鉀或醋酸鈉，形成核酸鹽，核酸鹽可被一些有機溶劑沉淀，離心得到的核酸可以用70%乙醇洗滌以除去多余的鹽分，即可獲得一定純度的核酸。

核酸分離純化的基本方法當前22頁，總共41頁。酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。

核酸分離純化的基本方法當前23頁，總共41頁。(1）使用注意酚通常是透明無色的結晶，如果酚結晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。

(2）安全操作

酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。使用酚時應注意

核酸分離純化的基本方法當前24頁，總共41頁。

沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點：

①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度，提高樣品濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。（四）核酸的濃縮、沉淀與洗滌當前25頁，總共41頁。沉淀的方法：常用的鹽類:醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂。常用的有機溶劑:乙醇、異丙醇和聚乙二醇洗滌：核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%～75%的乙醇洗滌去除。（四）核酸的濃縮、沉淀與洗滌當核酸溶液的pH值大于4時，核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài)，它與一價或二價陽離子形成的鹽在許多有機溶劑中不溶解，也不會被有機溶劑變性。DNA不溶于乙醇等有機溶劑，因此可以通過乙醇沉淀來純化和濃縮DNA。當前26頁，總共41頁。核酸沉淀的溫度和時間

一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達到實驗要求。（四）核酸的濃縮、沉淀與洗滌當前27頁，總共41頁。1.核酸的鑒定濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定（五）核酸的鑒定與保存當前28頁，總共41頁。紫外分光光度法：核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結構，可以吸收紫外線，其最大吸收波長為260nm。前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應大于0.25μg/ml。結論：在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。

濃度鑒定（五）核酸的鑒定與保存當前29頁，總共41頁。當前30頁，總共41頁。熒光光度法：核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。熒光強度的強度與溶液中核酸的含量呈正比。

使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液濃度。注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。（五）核酸的鑒定與保存EB與DNA的結合濃度鑒定當前31頁，總共41頁。

紫外分光光度法：主要通過A260與A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染。比值升高或降低均提示制備的核酸純度不佳。純度鑒定（五）核酸的鑒定與保存當前32頁，總共41頁。純度鑒定（五）核酸的鑒定與保存判斷核酸樣品的純度：DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0比值降低：蛋白質(zhì)污染（280）、酚污染（270）比值升高：DNA變性、RNA污染混合污染：比值正常當前33頁，總共41頁。熒光光度法：

EB等熒光染料示蹤的核酸電泳可判定核酸制品的純度。（五）核酸的鑒定與保存純度鑒定當前34頁，總共41頁。瓊脂糖凝膠電泳：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳可判定核酸制品的完整性；根據(jù)電泳條帶的數(shù)目、位置和形狀判定，RNA分子可以通過熒光強度強弱來判定有無降解。基因組DNA如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀。

完整性鑒定（五）核酸的鑒定與保存當前35頁，總共41頁。DNA的降解（五）核酸的鑒定與保存當前36頁，總共41頁。

完整的或降解很少的總RNA電泳圖譜中，原核生物5S、16S、23S三條帶；真核生物：5S和5.8S、18S、28S三條帶；而且三條帶熒光強度應呈特定的比值。沉降系數(shù)大，電泳遷移率低，熒光強度高沉降系數(shù)小，電泳遷移率高，熒光強度低

（五）核酸的鑒定與保存

完整性鑒定當前37頁，總共41頁。28S（或23S）RNA的熒光強度一般約為18S（或16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解；若在點樣孔附近有著色條帶，提示可能存在DNA的污染。（五）核酸的鑒定與保存當前38頁，總共41頁。核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)

溫度：

4℃樣品經(jīng)常使用

-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存

-20℃保存,避免反復凍融保存介質(zhì)：滅菌水

TE緩沖溶液(最常用)：

10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0（五）核酸的鑒定與保存2.核酸的保存——DNA的保存當前39頁，總共41頁。

DNA樣品溶于pH8.0