現(xiàn)代微生物生態(tài)學

關于現(xiàn)代微生物生態(tài)學第1頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五現(xiàn)代生態(tài)學的研究領域現(xiàn)代生態(tài)學要回答和解決的主要問題微生物生態(tài)系統(tǒng)多樣性微生物生態(tài)學研究方法傳統(tǒng)方法分子生物學方法微生物酶活性測定第2頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五1現(xiàn)代生態(tài)學的研究領域生態(tài)系統(tǒng)中種群規(guī)模的調(diào)控生物生產(chǎn)力的利用和保護研究人工生物群落的穩(wěn)定性和提高生產(chǎn)力環(huán)境污染防治城市生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)學和人類生態(tài)學的研究和建設第3頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五2現(xiàn)代生態(tài)學要研究與解決的主要問題能源短缺問題環(huán)境污染問題防止自然生態(tài)系統(tǒng)的萎縮、保護森林，防止沙漠化等城市有機廢棄物的處理及綜合利用的生態(tài)工程建立高產(chǎn)高效、持續(xù)發(fā)展的生態(tài)農(nóng)業(yè)和企業(yè)化生態(tài)工廠。如：白色農(nóng)業(yè)生命活動密切相關元素、化合物及生態(tài)效應與人體健康關系。海洋資源的生態(tài)調(diào)查、開發(fā)利用、保護的研究第4頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五3微生物生態(tài)系統(tǒng)多樣性陸生微生物生態(tài)系統(tǒng)水生微生物生態(tài)系統(tǒng)大氣微生物生態(tài)系統(tǒng)根系微生物生態(tài)系統(tǒng)腸道(消化道)微生物生態(tài)系統(tǒng)極端環(huán)境微生物生態(tài)系統(tǒng)活性污泥微生物生態(tài)系統(tǒng)“生物膜”微生物生態(tài)系統(tǒng)第5頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五海洋古菌的分布海洋真細菌的分布海洋真菌的分布海洋真核微藻的分布海洋病毒的分布海洋微生物的分布第6頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五海洋古菌的分布古菌的絕對數(shù)量大約占微型浮游生物的2%。表層海水中多為廣域古菌，而在150米深以下的水域中則以泉古菌為主。浮游古菌的分布還受到季節(jié)、海水溫度和海流等環(huán)境因素影響。不同海域、不同深度的沉積物中古菌分布不均。同一海域沉積物中，影響古菌分布的主要因素是有機物。海底火山口主要分布為泉古菌，少量為廣古菌。海底熱泉口主要分布嗜熱古菌（典型類群為熱網(wǎng)菌屬Pyrodictium和火葉菌屬Pyrolobus）。海洋浮游古菌沉積物中古菌特殊生境古菌第7頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五大多數(shù)古菌難以分離培養(yǎng)，主要利用分子生物學技術進行多樣性研究。近幾年在沿岸水域發(fā)現(xiàn)海洋古菌群Ⅰ和海洋古菌群Ⅱ，在不透光層以下海域發(fā)現(xiàn)海洋古菌群Ⅲ，在深海海水中發(fā)現(xiàn)海洋古菌群Ⅳ。泉古菌目廣古菌目第8頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五第9頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五ThemarinespongeAxinellamexicanaanditsarchaealsymbiont,Cenarchaeumsymbiosum.3A.,AxinellamexicanaabrightreddemospongefoundofftheCaliforniacoast.3C.,FISHexperimentshowingC.symbiosumpopulationpresentinthespongetissues(ingreen).ManyoftheC.symbiosumcellsarevisiblydividing.第10頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五海洋真細菌的分布海洋浮游細菌分布受可利用有機物、季節(jié)、深度、鹽度、及葉綠素濃度影響較大而區(qū)域性差異影響較小。沉積物中的海洋細菌分布表現(xiàn)區(qū)帶化特征。海洋浮游細菌主要屬于α-變形菌綱、γ-變形菌、擬桿菌綱等。海底沉積物中酸桿菌門、α-變形菌綱、γ-變形菌、δ-變形菌綱、擬桿菌綱等多種類型菌種。近年來，不斷有從海洋中新類群的發(fā)現(xiàn)。海洋細菌第11頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五海洋真細菌的分布浮游放線菌是海洋放線菌的重要組成部分，數(shù)量處于中等豐度水平，相關報道較少。海洋沉積物中最重要的真細細類群。其中淺海區(qū)以鏈霉菌為主，也有較多游動放線菌；而深海區(qū)沉積物中的優(yōu)勢放線菌為小孢囊菌和諾卡氏菌。無脊椎動物及海洋植物的表面或體內(nèi)存在著相當部分的海洋放細線菌，研究得較多的是海綿。海洋放線菌第12頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五海洋真細菌的分布迄今為止發(fā)現(xiàn)的海洋藍細菌主要屬于原綠球藻屬（Prochlorococcus）和聚球藻屬（Synechococcus）。是海洋初級生產(chǎn)者的重要組成聚球菌分布于熱帶和溫帶海域。粒徑為0.5-1.5um。通常比其消費者微型原生動物至少高一個數(shù)量級，足以作為微型原生動物的重要食物源。對總初級生產(chǎn)力的貢獻在世界大多數(shù)海區(qū)為20-60％原綠球菌(Prochlorococcus)分布廣泛。粒徑為0.4-0.8um。豐度大于聚球菌，對總初級生產(chǎn)力的貢獻約為50%海洋藍細菌第13頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五海洋真菌的分布木生真菌藻體真菌紅樹林真菌海草真菌寄生動物體真菌海底沉積物真菌存在于漂流木、沉積木。多數(shù)為子囊菌。其分布特點為熱帶海域和淺海較廣泛。種類與豐度受季節(jié)及附著基質(zhì)影響。生活方式為腐生、寄生或共生。海藻及其代謝物對其分布影響顯著。如含單寧酸的馬尾藻真菌極少；紅藻上有數(shù)量較多的酵母菌而褐藻相對較少，因后者分泌酚類。多數(shù)為腐生，能分解紅樹的枯枝敗葉，為海洋提供有機物碎片。多棲于海草的葉部和根部，數(shù)量少。寄生于動物的外骨骼及腸道等。發(fā)現(xiàn)不同海域沉積物中都有真菌，但鑒定的很少。第14頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五海洋真核微藻的分布寒帶種：最適溫度小于4℃。小于0℃左右為寒帶種；0℃-4℃來亞寒帶種。

溫帶種：最適溫度4℃-20℃

。4℃-12℃為冷溫帶種12℃-20℃為暖溫帶種。

熱帶種：最適溫度大于20℃

。20℃-25℃為亞熱帶種；大于25℃為熱帶種。主要影響因子為光強。分喜光藻與適陰藻。海底的分布與沉積物的組成及大小相關，含沙粒的多于泥濘。雙峰模式：溫帶海域春、秋各有一個高峰（受光強、營養(yǎng)鹽影響）。單峰模式：寒帶海域春季一高峰；某些溫帶海域（受徑流影響）。水平模式：多見熱帶海域（季節(jié)不明顯）水平分布垂直分布季節(jié)變化第15頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五海洋病毒的分布季節(jié)、水深、光密度、溫度、鹽度等理化因子影響海洋浮游病毒的分布。

赤潮發(fā)生期病毒豐度驟增。

豐度隨宿主變化而變化。病毒豐度與宿主豐度間的比值（virus-to-bacteriumratio,VBR）是研究病毒侵染對水生菌群影響的重要參數(shù)。底棲病毒豐度大于浮游病毒豐度。VBR也大于浮游病毒沉積層深度增加病毒豐度及VBR都降低。浮游病毒底棲病毒第16頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五4.1微生物生態(tài)學研究中的傳統(tǒng)方法樣品的采集微生物菌量計數(shù)富集培養(yǎng)和菌種分離最大或然值法活菌計數(shù)法第17頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五4.2微生物生態(tài)學研究中的分子生物學方法核酸探針雜交技術PCR特異性擴增技術rRNA基因同源性分析方法第18頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五核酸探針雜交技術核酸雜交技術快速，能靈敏地探測出環(huán)境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度測定法可直接比較核酸雜交所得到的陽性條帶或斑點就能得出定量的結(jié)果，從而反映出相關微生物的存在及功能。標記核苷酸探針可直接用來探測溶液中、固定在膜上或細胞或組織內(nèi)的同源核酸序列。探針可以是長探針(100-1000bp)，也可以是短的寡核苷酸(10-50bp)。雜交方式可以是菌落雜交、狹縫雜交或原位雜交。第19頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五菌落雜交該法可從大量細菌中篩選含特異的DNA序列及基因工程重組體。雜交探針不僅可以鑒定細菌克隆也可以鑒定噬菌體形成的噬菌斑。

首先將克隆或噬菌斑轉(zhuǎn)移到纖維素膜或尼龍膜上，去掉所有的殘留物，只留下DNA，這種處理同時導致了DNA變性，使雙鏈的氫鍵斷裂形成單鏈分子。通過80℃短時間處理，將DNA分子固定在膜上（纖維素膜）；對于尼龍膜需要進行紫外交聯(lián)，通過糖-磷酸中樞將分子連接到膜上。

標記探針，加熱變性，加入到雜交膜上進行雜交，然后洗去未結(jié)合的探針，干燥，接合探針的位置就可以檢測出來。第20頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五斑點雜交或狹縫雜交法

基本過程：

將變性的DNA或RNA直接點到固相支持濾膜上→用標記探針與之雜交→自顯影或顯色反應→檢測雜交信號→分析結(jié)果。

優(yōu)點：簡便、快速、靈敏、樣本用量少；

缺點：特異性不高，有一定比例的假陽性。

用途：檢測樣本中存在的微量DNA或RNA第21頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五原位雜交

將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而檢測特異的DNA或RNA序列。

細胞原位雜交

組織切片原位雜交

DNA-DNARNA-DNA

三類雜交

RNA-RNA

該法優(yōu)點：

不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態(tài)，因而更能準確地反映組織細胞的功能狀態(tài)。有第22頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五PCR特異性擴增技術在環(huán)境檢測中，靶核酸序列往往存在于一個復雜的混合物中，且含量極低，若探測這種復雜群體中特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。PCR技術使靶序列放大幾個數(shù)量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。PCR常與其他技術結(jié)合起來使用，如RT-PCR，competitivePCR、nestedPCR、RAPD、ARDRA等。第23頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五

第一步：第一對引物結(jié)合。第一對引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點的片段上并擴增多種產(chǎn)物。第二步：第二套引物對第一輪PCR擴增的產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增。由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。NestedPCR

第24頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五competitivePCR是一種定量PCR（quantitativePCR），通過向PCR體系中加入人工構(gòu)建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板作定量研究。靶基因與參考標準在同一反應管中共同擴增，但參照標準通常是一段人工合成的模板而不是內(nèi)源性基因。競爭PCR必須構(gòu)建一個內(nèi)部標準，此標準能與靶基因競爭聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物結(jié)合位點，其擴增產(chǎn)物能通過電泳或高效液相色譜(HPLC)等方法區(qū)分開來。對競爭性模板作系列稀釋后加入到恒量的樣品DNA中進行PCR，靶基因的量取決于所添加的競爭性DNA片段的量，使兩者的PCR終產(chǎn)物有相等摩爾數(shù)。

competitivePCR第25頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五用那些對某一特定基因的非特異性的引物來擴增某些片段。RAPD分析用于探測含有混合微生物種群的各種生物反應器中的微生物多樣性。其分析得到的基因組指紋圖譜在比較一段時間內(nèi)微生物種群的變化以及比較小試規(guī)模和中試規(guī)模的反應器方面是有用的。但不足以用來估測群落的微生物多樣性。RAPD(randomlyamplifiedpolymorphicDNA)第26頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五rRNA基因分析方法rRNAapproach是綜合應用多項分子生物技術對細胞中rRNA基因進行分析，從而揭示微生物多樣性。所使用的技術主要包括環(huán)境樣品中DNA的提取、引物及探針的設計、PCR擴增、梯度膠電泳（主要是DGGE和TGGE）、限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)型（RFLP）、基因文庫的篩選、序列測定、序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建、斑點雜交和全細胞原位雜交及巢式雜交等。第27頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五微生物樣品基因組DNA的提取16srRNA基因片段的獲得（pcr）16srRNA基因片段的分析16srRNA基因分析步驟第28頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五腸道微生物樣品基因組DNA的提取rRNA的含量很高，易于獲得較多的模板，但是RNA易降解，因此一般研究多采用提取細胞總DNA。腸道環(huán)境中存在的細菌種類繁多，形態(tài)及性質(zhì)各異，必須盡可能無選擇性地裂解腸道細菌細胞以得到代表性的核酸分子。菌體細胞裂解常用方法酶法化學法機械法目前認為最可靠的方法是：溶菌酶配合微珠振蕩裂解，使腸道混合微生物的DNA充分釋放，再用酚-氯仿抽提總DNA。第29頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五16srRNA基因片段的獲得16SrRNA通用引物進行PCR擴增的一般程序94~96℃預變性2~5min94~95℃變性30~60s45~55℃退火60s68~72℃延伸2~4min

最后68~72℃延伸6~10min

缺點：可能出現(xiàn)嵌合產(chǎn)物和擴增偏嗜性現(xiàn)象。第30頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五16srRNA基因片段的分析1）將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體上進行測序，與16SrRNA數(shù)據(jù)庫中序列比較，確定其進化樹中位置，從而鑒定樣品中可能存在的微生物種類。16SrRNA基因片段的分析方法特點：該方法獲得信息最全面，但在樣品復雜情況下測序工作繁重。主要應用：單株菌的鑒定；兩種菌的同源性比較，確定其歸屬。2）16SrRNA基因片段的多態(tài)性分析（又叫DNA遺傳指紋圖譜技術）。經(jīng)PCR后其產(chǎn)物為序列等長但不同源的DNA混合物，常用DGGE、TGGE等手段分離?；旌衔镏行蛄械亩鄻有院筒煌蛄械呢S度在一定程度上反映原始樣品中微生物種群的多樣性和不同物種的豐度。特點：PCR過程中的堿基插入等造成錯誤主要應用：微生物群體多樣性；微生物種群動態(tài)分析等。第31頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五3）通過16SrRNA種屬特異性的探針與PCR產(chǎn)物雜交以獲得微生物組成信息。此外，探針也可以直接與樣品進行原位雜交，通過原位雜交不僅可以測定微生物豐度，且能分析它們的空間分布16SrRNA基因片段的分析方法特點：簡單快速。主要應用：快速驗證其它方法可能出現(xiàn)的假陰陽性；混合物中釣取已知特定種類。4）對PCR產(chǎn)物進行RFLP或T-RFLP。將PCR產(chǎn)物酶切，通過觀察酶切電泳圖譜、數(shù)值分析，確定微生物基因的核糖體型，再同核糖體數(shù)據(jù)庫中的已有數(shù)據(jù)進行比較分析。主要應用：微生物組成和不同微生物的種屬關系分析。第32頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五樣品的采集土壤和污泥樣品的采集一般不要求無菌操作。而應當注意樣品的深度。水體樣品的采集，應視水體清潔程度而定，或直接采集或用濾紙過濾濃縮（要求容器和過濾器無菌及無菌操作）空氣樣品的采集：要求在無菌操作下進行濾紙過濾生物體上的樣品采集，要求取下一定量的組織，用無菌溶液把其中的微生物洗滌下來。第33頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五富集培養(yǎng)和菌種分離用一定的選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，把樣品中所含的特殊微生物數(shù)量得到提高。一般進行2~3次富集培養(yǎng)分離通常還是采用與富集相同的培養(yǎng)基進行劃線分離挑取單菌落再進行2~3次的純化。第34頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五最大或然值法（MPN）適用于測定在一個混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢，但卻具有特殊生理功能的類群

。菌液經(jīng)多次10倍稀釋后，然后每個稀釋度取3—5次重復接種于適宜的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后，將有菌液生長的最后3個稀釋度（即臨界級數(shù)）中出現(xiàn)細菌生長的管數(shù)作為數(shù)量指標，由最大或然數(shù)表上查出近似值，再乘以數(shù)量指標第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)，即為原菌液中的含菌數(shù)。應注意兩點：菌液稀釋度選擇要合適，原則是最低稀釋度的所有重復都應有菌生長，而最高稀釋度的所有重復無菌生長。每個接種稀釋度必須有重復，重復次數(shù)可根據(jù)需要和條件而定，一般3—5個重復。第35頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五例1：如某一細菌在稀釋法中的生長情況如下；

稀釋度

10-3

10-4

10-5

l0-6

10-7

10-8

重復數(shù)

5

5

5

5

5

5

出現(xiàn)生長的管數(shù)

5

5

5

4

1

0其數(shù)量指標為“541”，查最大或然數(shù)表得近似值17，然后乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)即每毫升原菌液含活菌數(shù)為l700000個。

確定數(shù)量指標：不管重復次數(shù)如何，都是3位數(shù)字，第一位數(shù)字必須是所有試管都生長微生物的某一稀釋度的培養(yǎng)試管，后兩位數(shù)字依次為以下兩個稀釋度的生長管數(shù)，如果再往下的稀釋仍有生長管數(shù)，則可此數(shù)加到前面相鄰的第三位數(shù)上即可。例2：如某一微生物生理群稀釋培養(yǎng)記錄為：

稀釋度

l0-1

10-2

10-3

l0-4

10-5

10-6

重復數(shù)

4

4

4

4

4

4

出現(xiàn)生長的管數(shù)

4

4

3

2

1

0數(shù)量指標為“433”，查表得近似值為30，則每毫升原菌液中含活菌30×102個。第36頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五附表23-1幾種主要微生物生理群MPN計數(shù)法一覽表微生物生理群培養(yǎng)基常用稀釋度常用重復次數(shù)培養(yǎng)時間(天)主要檢查方法氨化細菌蛋白胨氨化培養(yǎng)基0-6—10-947根據(jù)培養(yǎng)液加奈氏試劑后是否出現(xiàn)棕色或褐色，確定是否產(chǎn)生氨。亞硝酸細菌銨鹽培養(yǎng)基0-2—10-7314根據(jù)培養(yǎng)液加格利斯試劑Ⅰ及Ⅱ的反應，出現(xiàn)絳紅色證明有NO-2生成；或在培養(yǎng)中加鋅碘淀粉試劑及體積比值為20%的H2SO4，若出現(xiàn)藍色，證明有NO-3生成。硝酸細菌亞硝酸鹽培養(yǎng)基0-2—10-6314根據(jù)培養(yǎng)液加入濃硫酸及二苯胺試劑后，是否出現(xiàn)藍色，確定是否有NO-3生成。反硝化細菌反硝化細菌培養(yǎng)基0-4—10-8314根據(jù)杜氏小管有無氣體，確定有無N2生成；利用格利斯試劑Ⅰ及Ⅱ和二苯胺試劑、濃硫酸檢測有無NO-2生成及有無NH3存在，判斷反硝化作用進行情況。好氣性自生固氮菌阿須貝無氮培養(yǎng)基0-2—10-637-14根據(jù)培養(yǎng)液表面與濾紙接觸處有無褐色或粘液狀菌膜生成，判斷有無好氣性自生固氮菌生長。好氣性纖維素分解菌赫奇遜噬纖維培養(yǎng)基0-1—10-5314根據(jù)各試管中濾紙條上有無黃色或桔黃色菌斑出現(xiàn)及濾紙斷裂狀況，確定有無好氣性纖維素分解細菌的生長。厭氣性纖維素分解菌嫌氣性纖維素分解細菌培養(yǎng)基0-1—10-5314-21根據(jù)各試管中濾紙條上有無穿洞、破裂、完全分解情況，確定有無嫌氣性纖維素分解細菌的生長。硫化細菌硫化細菌培養(yǎng)基0-2—10-8321-23在每管培養(yǎng)液中加入10g/L的BaCL2溶液2滴，如有白色沉淀出現(xiàn)，則證明有硫化菌活動。反硫化細菌斯塔克反硫化細菌培養(yǎng)基0-2—10-7321-30根據(jù)培養(yǎng)液試管底部、管壁有無黑色沉淀出現(xiàn)，判斷有無反硫化細菌活動。第37頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五白色農(nóng)業(yè)白色農(nóng)業(yè)是指微生物資源產(chǎn)業(yè)化的工業(yè)型新農(nóng)業(yè)，包括高科技生物工程的發(fā)酵工程和酶工程。白色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境高度潔凈，生產(chǎn)過程不存在污染，其產(chǎn)品安全、無毒副作用。目前白色農(nóng)業(yè)的研究應用領域包括：微生物食品；微生物飼料；微生物肥料；微生物農(nóng)藥、獸藥；微生物能源；微生物生態(tài)環(huán)境保護劑等。第38頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五自然界中微生物酶活性測定水解酶類活性測定蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、脫氫酶活性的測定微生物呼吸率測定第39頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五第40頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五Synechococcuscoloniesarefoundonlyinsaltwater,andcontributeabout25%ofprimaryproductioninpelagicwaters.第41頁，共46頁，2023年，2月20日，星期五Prochlorococcusmarinus,atinyglobularcyanobacterium.Thistypeoforganismisextremelyabundantinth