激光掃描共焦顯微鏡技術

關于激光掃描共焦顯微鏡技術第1頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術及應用ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy第2頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術人眼分辨率： 0.2mm光學顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm第3頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

二、原理激光掃描共焦顯微鏡技術第4頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五原理小結:

Confocal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統在樣品焦平面上掃描，從而產生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術第5頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術第6頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術第7頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術共焦顯微鏡與傳統顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像第8頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術共焦顯微鏡與傳統顯微鏡的區(qū)別2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片conventionalconfocal第9頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術共焦顯微鏡與傳統顯微鏡的區(qū)別3.增加側向分辨率

第10頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術共焦顯微鏡與傳統顯微鏡的區(qū)別4.由于點對點掃描去除了雜散光的影響

第11頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術三.激光掃描共焦顯微鏡的設計特點:1.點照明2.具有照明pinhole和探測pinhole3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦),共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統——逐點掃描成像5.具有多個（四個）熒光通道，可同時探測多個被標記物第12頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術技術指標（LeicaTCSSP2):

1.xy分辨率比傳統顯微鏡小1.4x傳統顯微鏡:Rxy=0.61/NA（0.25m)Confocal:Rxy=0.4/NA（0.18m)2.樣品的最大厚度:取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度 Z軸的最大移動范圍(166m、Z-wide)3.樣品的最小光切厚度:(載物臺最小移動距離為40nm）取決于:物鏡的NA、針孔大小Z軸的最小移動步距:40nm Z軸的分辨率:0.35m

第13頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術4.激光器

Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):361nm

激光器的特點:1)方向性好:激光基本延直線傳播2)單色性好:=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度 集中的。4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合第14頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術5.四個熒光通道,一個透射光通道

即除了可同時采集多標記熒光圖像外 還可以同時采集透射光圖像,但透射光 圖像為非共焦圖像。第15頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡技術

6.掃描速度:slow220lines/s5125122-3秒slow2440lines/s（2：雙向掃描）

medium450lines/s5125121.7秒medium2900lines/sfast1000lines/s

5125120.7秒

1281280.2秒

fast22000lines/s7.掃描密度:

646412812851251210241024

20482048第16頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

激光掃描共焦顯微鏡

技術的應用TheapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy第17頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用功能.1.多熒光標記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.無損傷、連續(xù)光學切片，顯微“CT”3.真正的三維重組4.假三維圖的顯示5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進行光切6.定量分析7.時間序列掃描:xyt、xyzt和xt掃描8.圖像處理9.旋轉掃描10.感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描

第18頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用應用定位、定量三維重組動態(tài)測量

活細胞或組織內游離Ca2+分布和濃度的變化測量 (Mg2+

、Zn+

、Na+

、K+)

自由基的檢測藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量蛋白質的轉位第19頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用活細胞內H+濃度（pH值）的測量線粒體膜電位的測量熒光漂白恢復（FRAP）的測量籠鎖解籠鎖的測量熒光能量共振轉移（FRET）的測量其他應用第20頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用一、定位、定量免疫熒光標記（單標、雙標或三標）的定位、定量：如：細胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋 白的共存與共定位、蛋白與細胞器的 共定位、核轉錄因子轉位和干細胞的 增值、分化細胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI

末端原位雜交-fitc+PI熒光原位雜交：染色體基因定位

第21頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用定位、定量研究中常用熒光探針1.Amine-ReactiveProbes

與抗體耦聯、與配體耦聯、與肽耦聯、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等

Green

Red Fura-redFITC494/518TRITC544/572Cy5650/690(異硫氰基熒光素)(四甲基異硫氰基羅丹明)AlexaFluor488488/530PE565/578(藻紅蛋白)TexasRed595/615(德州紅)Cy3558/568BODIPYFL503/512BODIPYTMR543/569BODIPYTR 592/618

第22頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用1)細胞表面抗原、胞內某種蛋白免役熒光標記：與抗體耦聯,

直標:一抗+熒光探針

間標:

二抗+熒光探針如:微管蛋白tublin(抗tublin抗體+熒光探針)

肌動蛋白actin(Palloidine+熒光探針)2)細胞膜表面受體 配體+熒光探針如:nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)

標記Gm1:霍亂毒素受體霍亂毒素+FITC

第23頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用2.標記細胞器熒光探針1)線粒體

Mitochondria

Rodamin123505/534，可染活細胞，陽離子,可檢測線粒體膜電位,且在多數細胞中停留時間短

JC1

線粒體膜電位低時為單體490/527發(fā)綠光線粒體膜電位高時為多聚體490/590發(fā)紅光可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針MitotrackerGreenFM490/516,染活細胞或固定細胞,

穩(wěn)定不漏出MitotrackerOrangeCMTMRos551/576,(氧化型)MitotrackerOrange還原型,只能染活細胞第24頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用2)溶酶體

Lysosome

中性紅541/640:微偏堿性,可標記溶酶體等酸性器官為非特異性AO:LysoTrackerGreenDND-26504/511,染活細胞LysoTrackerBlueLysoTrackerRed3)內質網

EndoplasmicReticulum

DiOC6484/500:非特異性,較高濃度標記內質網,較低濃度標記線粒體4)高爾基體GolgiapparatusNBDC6-ceramie466/536,可染活或死細胞

第25頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用細胞器的單克隆抗體5)細胞核PIpropidiumiodide536/617DNA/\RNA死細胞碘化丙啶EBethidiumbromide518/617DNA/RNA死細胞Hochest33342

352/461DNAA-T活細胞Hochest33258

352/461DNAA-T活細胞DAPI358/461DNAA-T半通透細胞ChromomycinA3450/470DNAG-CAO500/526DNA活細胞560/650RNATOTO-1514/533DNA 死細胞SYTO11~1620~24488/520活細胞SYTO11~1620~24521/556活細胞SYTO17 621/634 活細胞第26頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五3.GFP綠色熒光蛋白GFP的的發(fā)現：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結合后可產生藍色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經證實在水母體內還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白GFP,后經研究表明，在水母體內Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結合后，水母發(fā)光蛋白產生藍色熒光，GFP在藍光的激發(fā)下，產生綠色熒光。

將外源基因與GFPDNA相連,GFP可作為外源基因的報告基因實時監(jiān)測外源基因的表達.激光掃描共焦顯微鏡應用第27頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用GFP主要應用:

對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態(tài)觀察

可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達,如某種轉錄因子的核轉位、蛋白激酶C的膜轉位等。

GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉染細胞,可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內質網、高爾基體、線粒體等細胞器的結構及病理過程可用于觀察分子的運動（FRAP）蛋白之間的相互作用（FRET）第28頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用三.動態(tài)測量Physiology:細胞內離子動態(tài)變化測量1).游離Ca2+測量

檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結合時不發(fā)熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內，被細胞內酯酶水解后并與胞內游離鈣結合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd,Kd和很多因素有關，如pH、Mg2+、與蛋白的結合、溫度等。細胞內生理Ca2+濃度值(10-100nM)，細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）

第29頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五熒光探針 激發(fā)波長 發(fā)射波長KdFLuo3-AM,K+,dextran506nm 525nm390nM Fluo4 506nm 525nm CalciumGreen-1507nm 530nm190nMCalciumGreen-2 507nm 535nm550nMFurared 420/480nm 637nm140nMOregonGreen488 494nm 520nm 20,000nMCalciumCrimson 583nm602nm328nMIndo-1 356nm405/458nm230nMFura-2 340/380476nm145nM激光掃描共焦顯微鏡應用第30頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五程序化測量：用timelapse中的編程按鈕可進行不同時間序列的掃描測 量。

F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+濃度絕對測量1）單波長公式法Fluo3:530nmKd=450nM[Ca2+]I=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin:細胞內無鈣時的熒光強度(MnCl2)Fmax：細胞內鈣飽和時的熒光強度(A23187)測量時切記細胞內靜息Ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低（F值不低于40）激光掃描共焦顯微鏡應用第31頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五細胞內生理Ca2+濃度值（10-8-10-7M）細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）2）標準曲線法根據儀器條件和負載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA-Ca2+)做標準曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強度3）比例熒光的測量.雙波長(比例熒光：ratio)Indo1(360,420/480),fura2(340/380,440)[Ca2+]I=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光掃描共焦顯微鏡應用第32頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用快速Ca2+變化的測量1.改變掃描速度2.采用雙向掃描3.減少采樣點數(犧牲空間分辨率）4.采用線掃描(xt)第33頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五細胞器的Ca2+測量1.線粒體內游離Ca2+測量

Fluo-3+TMRM(線粒體熒光探針，紅色）2.特異定位的重組水母發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白與Ca2+結合后發(fā)藍光用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體轉染細胞，可測定亞細胞器內的游離Ca2+變化 目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內質網、細胞核內的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測激光掃描共焦顯微鏡應用第34頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五

細胞內游離Ca2+測量的應用鈣的特性1．細胞內外的電化學梯度103-104倍2．細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導致胞內鈣明顯升高3．細胞內鈣為細胞激活“開關”細胞內鈣的生理作用1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯2．神經遞質的釋放3．學習記憶的增強4．卵子受精5．細胞分裂和再生6．細胞調亡7．細胞間通訊激光掃描共焦顯微鏡應用第35頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五8．細胞信號傳導9.DNA合成10.基因表達細胞內鈣超載與疾病1．高血壓、腦缺血、心臟病、內分泌病—胞內鈣濃度異常2．糖尿病、風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化病—胞內鈣濃度增高3．人體缺鈣—骨鈣大量丟失，神經細胞的鈣濃度增高4．老化和老年性癡呆-神經細胞內鈣濃度增高細胞內生理Ca2+濃度值（10-8-10-7M）細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）激光掃描共焦顯微鏡應用第36頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五電刺激引起骨骼肌細胞的Ca2+振蕩激光掃描共焦顯微鏡應用第37頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用pH值的檢測：

BCECF-AM 490nm530nm6.5-7.5

Snarf-1-AM488nm580/640nm

7.0-8.0第38頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五自由基的檢測熒光探針：H2DCF-DA（504nm/529nm）

2-氫，2氯熒光素乙酰乙酸鹽胞外H2DCF-DA擴散入細胞內酯酶脫乙酰DCF-H(不熒發(fā)光）DCF（發(fā)熒光）*樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察

Dihydrorhodamine123（507nm/529nm）H2rhod123被動擴散入細胞內在細胞內被氧化成rod123（發(fā)光）激光掃描共焦顯微鏡應用第39頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用藥物進入細胞的動態(tài)過程及定位分布

xyzt掃描

第40頁，共48頁，2023年，2月20日，星期五激光掃描共焦顯微鏡應用四.膜電位的測量標記膜電位探針(慢反應）：JC1