普通遺傳學5細菌de分析

第五章細菌的遺傳分細菌的概

本章細菌的接合 作中斷雜交與重組作F?因子與性6細菌的轉化與轉導作圖思考題本章 掌握F-菌株、F+菌株、Hfr菌株的概念、區(qū)別區(qū)別F因子、F′因子的異掌握細菌的遺傳作圖的原理，了解基本過程細菌的概述細菌的細細菌的突變細菌的培養(yǎng)與突變型篩細菌 在遺傳研究中的優(yōu)越細菌的擬有性過 結構的了解日益深研究材料采用了新的生物類型—一、細菌（bacteria）的細真細菌：大腸桿菌（Escherichiacoli）古細菌：詹氏甲烷球菌桿菌，大約15μm長，0.5μm大腸桿菌(E.coli，其為一條環(huán)狀的露DNA分子，長1333um。細胞里通常還具有一個或多個小的—質粒。1、結構

一、細菌細菌是單細胞生物2、生長特生長周期短，20分鐘一個世代，生長速度快3、遺傳特細 露的DNA4 和繁二、細菌的突單一細菌在固體培養(yǎng)基上形成一個菌落（clone）1、合成代謝功能的突變野生型（原養(yǎng)型）：eg:Met+,eg:Met－,ColonyofSerratia粘 2、分解代謝功能的突變野生型：能利用復雜的糖類作為碳源。eg突變型：不能利用復雜的糖類作為碳源。eg:3 抗性 eg:敏感性：eg:

T2s細菌中常用的若干突變 符號見表三、細菌的培養(yǎng)與突變型

一個細胞繁殖而來的純系。通常采用平板表面涂布法或 可以獲得單菌落許多細菌的突變都與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分及培養(yǎng)條件有選擇培養(yǎng)法為了高效測定所發(fā)生的突變，Lederberg設計了影印四、細菌 在遺傳研究中的優(yōu)越性③便于研 的突變④便于研 的作用⑤便于研 的重組五、細菌的擬有性過 細菌的遺傳重轉化（Transformation）接合（Conjugation）轉導（Transduction）性導（

胞的DNA與細胞的DNA可以通過4種細菌生活條件基本培養(yǎng)基（BasalMedium）：BM或無機鹽：SO42-、NO3Ca2+、 ：葡萄糖、蔗糖維生素：生物素、Vb完全培養(yǎng)基：CM（CompleteMediumBM＋全部營養(yǎng)物質BM＋某一種（營養(yǎng)）物質細菌的接合 作細菌接合現象的發(fā)現和證F因高頻重組細菌的交換重一、細菌接合現象的發(fā)現和1、1946年，Lederberg和E.L.Tatum的大腸桿菌雜交實驗：材料：大腸桿菌(Escherichiacoli)K12菌株的兩個菌株A—met－bio－thrleu菌株B—metbio首次證明E.coli的有性生殖 重方法將A、B兩菌株混合培養(yǎng)→完全培養(yǎng)基上過夜→離心，各取108涂布在基本培養(yǎng)基。結果：平板上長出原養(yǎng)型菌落，頻率為10－7。原養(yǎng)型菌落的產生，是A的thr＋leu＋thi+和B的met+bio+的 組里。原養(yǎng)型菌落回復突變的結果 回復突變頻率10-6，兩個 變的頻率＝10-6×10-6＝10-12<10-A培養(yǎng)液滅菌→濾液加入B培養(yǎng)液→培養(yǎng)→無原養(yǎng)菌互養(yǎng)（Syntrophism）——兩個品系分泌的代謝物

互養(yǎng)作用及其A品系：A－BT1S(met－bio－thr+leu+T1B品系：A+B－TR(met+bio+thr－leu－T 試驗方法：將A、B品系混合接種在基本培養(yǎng)基表面，證實B.Davis1950年所做的U把A、B菌株分別培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基上→培養(yǎng)液充分混合→從兩端抽取細菌培養(yǎng)液→接種在基本培養(yǎng)基→結果長出原養(yǎng)型細菌 轉導和互養(yǎng)3超微孔濾板：可通過生物大分子、噬菌不能通過：細結論：A，B品系菌株間的直接接觸是 重組的前提。在Lederbery和Tatum的試驗中，發(fā)生了一種不同2、接合二、F因子1、F因子的發(fā)現1952年，WHayes雜交試以大腸桿菌K12菌株的兩個營養(yǎng)缺陷型為材菌株A—metbio-thrleu菌株B—met+ thr-leu-鏈霉素處理A菌（不殺死細菌，阻 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時 洗滌離B重組體未減 基本培養(yǎng)基鏈霉素處理B

洗滌離心無重組體產 基本培養(yǎng)大腸桿菌的兩種類型Hayes(1952)研究表大腸桿菌兩種不同菌株(品系)接合過程中遺傳物質的轉移是單向的；2、F因子Hayes和Cavalli-Sforza（1953)發(fā)現，供體有一個性因子即致育因子—F因子。F因子：環(huán)狀DNA分子，全長94.5kb，約為全長的2%結構：3個區(qū)域 傘毛配對區(qū)：可以與細 配對，進行交換整合P161圖F因子的特點：有F因子的細菌稱為F＋(供體)，表面有沒有F因子的細菌稱為F－（受體）F＋細菌經吖啶橙處理而丟失，成為F－F＋可以和F－雜交，但不能和F＋F＋×F的雜交后代皆為F＋，而且可以10－7頻率獲細菌的 的重組頻率很低，又稱B♀B♀ 三、高頻重組1951Cavalli發(fā)現用氮芥處理F然后將處理后的F＋×F－→10－4重組子。新的菌株稱為高頻重組（HighfrequencyofHfr：指F因子整合到宿主細胞 Hfr×F－→F－，出現高頻重組，但F－很少變成F＋×F－→2F＋，重組頻率很低。Hfr→吖黃素處理，不會丟失F因子。質粒，附加

F因子的實既可存在于之外作為獨立的子，又可整合到細菌上作為細菌子的一部分的F雜交時獲 整失 游 四、細菌的交換重組F＋→F因子和F＋細菌兩個環(huán)狀DNA分子可以在同源區(qū)配子（Hfr）。B A A Hfr×F－只接受部分的供 這些稱為供體外子(endogenote)，而受體的完整則稱為受體內子（exogenote），部分合子（merozygote）：這種含一個親本全 細菌的遺傳重組是在部分二倍體中進行的。重組是單交

＋

線 ，以后丟失重組細菌交換的特①單交換不能產生完整的重組體，雙交換及其它偶②相反的重組體不出現。所以在選擇性培養(yǎng)基上只5.3中斷雜交與重組作圖重組作圖一、中斷雜交實驗原1954E.Wollman和E.Jacob設計完成Hfr：thrleuazirFthr－leu－azis

tonrlac+gal+strstonslac-gal- Hfr+F－菌株混合通氣培養(yǎng)，隔段時間取樣，放在攪拌器中攪拌以中斷雜交，將混合菌液稀釋涂布于含有Str的不同選擇培養(yǎng)基上，對形成菌落的F－細 選擇性標記（selectedmarker）：在雜交中用來選出雜交子代重組體的標記。用供體的thr＋leu＋strs作為選擇標記，其他幾個基體的。）中斷雜交技術（interruptedmating）：這種根據供體 時間繪制連鎖圖的技術，稱為中斷雜交技術P165圖7－9－b，P164表結果表明，thr+最先進入F-細胞，接合8分鐘后便出現了重組體，leu+隨后半分鐘出現，aziS在9分鐘時出在被選擇的thrleu+的重組體中，其它的供體接連出現，不同的經過一定時間就上升到一個穩(wěn)定的水平。分析不同的非選擇標記進入受體且重組的時間不同，但 的重組頻率隨著時間的增加而增加，直至按時間順序，先重組和后重組的 ，重組率的結論Hfr的是以線性方式轉移進入F－的。它以某一特定位點為轉移起點（設為0點），以一定的次序將上的轉入F－細胞。某些F＋，頻率很低。大腸桿菌 呈環(huán)形利用不同的Hfr品系進行中斷雜交實驗，可以給出 的連鎖圖。下表列出了5株Hfr菌的 連鎖順序，其 向F-品 連鎖次Hfr Hfr Hfr HfrOFOF這個實驗進一步說明F因子和細 1957年，Wollman和Jacob提出假設：E.coli 的染色體是環(huán)狀的，可在不同位置上自發(fā)地斷開。F因子可E.coli的全 轉移需要100分鐘，每分鐘2.3×104bpP166圖三、重組作圖如果兩 間的轉移時間小于2分例：緊密連鎖二 :lac－，ade－，lac先進入受體，ade居后。如：Hfrlac+ade+strsF－lacade↓完全培養(yǎng)基混合↓基本培養(yǎng)基(無腺嘌呤、加↓F－adestrr分析：⑴F－lac－ade－，供體 組。⑵若重組體為lac+ade+，說明兩個 交換，ade和Lac間無交換重組；⑶若重組體為lac－ade+，ade和Lac⑷若重組體為lac＋ade－F－ade+strr菌落→影印培養(yǎng)在EMB( 上，檢查能否利用乳糖→紫紅色菌落lac+白色菌落 重組組 2

交交換2-3交換

lac+adelac－Rf(lac-ade在lac和ade間發(fā)生交換的菌落數菌落總數

×100%

白色菌

白色菌落+暗紅色菌（菌落總數5.4、F?因子與F?性三種致育因子一、F?因子1959年，Aderlberg重復Hfr×F－實驗時，發(fā)現部分Hfr品系回復為F+狀態(tài)。 的過程是可逆的。Hfr菌株在切除F因子時發(fā)生錯誤切除，分離出一個攜帶 的遺傳因子，這種帶有 的F因子稱為F?因子。P168圖F?因子的特點①以極高的比率轉移它攜帶 ②F? 不同于F因子隨機插入。二、性F?因子帶有部分細菌 ，形成部分二倍體1、性導（ 配對、交 整準確環(huán)

準確環(huán)

1因～半條染色 5.6、細菌的轉化與轉導作一、細菌的轉化與作轉化（transformation）：某些細菌(或其他生物)通過 1、細菌轉化的發(fā) oniae)轉化實驗1944，Avery轉化是細 重組的方法之一轉化因子（TranformationPrinciple,TP）。2、影響轉化的因(1)雙球菌成功轉化的DN 段至少要有800bp；枯草桿菌最少需要16000bp。(2)轉化片段形態(tài):必須是雙鏈。(3)轉化片段濃度：每個細胞攝取的DNA分子數不超過10個。(4)受體細胞生理狀態(tài)；感受態(tài)感受態(tài)：行轉化的生理狀態(tài)。轉化率一般都很低，大約為1%轉化低的原⑶必須有酶或蛋白質以及能量等的協同作用3雙鏈DNA分子與受體部位可逆結合→供體DNA進入受體→雙鏈變?yōu)閱捂湣迦?，形成雜合DNA分子→形成轉化子4、轉化在遺傳分析中的共轉化（cotransformation）：供體一條 一般連鎖。應用①兩 同時轉化的效率（連鎖或不連鎖 定位（遺傳作圖）（枯草桿菌將抽提的供體DNA濃度降低10如果a、b二 是緊密連鎖的，則a、b二 時轉化頻率也降低10倍如果a、b不連鎖，但a、b二 則降低10×10=100倍。在較低濃度范圍內，轉化頻率和轉化DNA的濃度成正eg：供 上有兩 a+b+，受體為a⑴若a，b獨立遺傳，共轉化的概率為兩個 ⑵若a，b連鎖，共轉化的概率比兩個 eg：枯草桿菌(Bacillustrp2his2tyr1+trp－h(huán)istyr 結果如下：p170表分析：每次只看2 位trp2+trp2+his2+tyr+trphistyr1221重組型＝2600＋107＋3660＋418＝6785親本型＝11940＋1180＝13120Rftrp2－h(huán)is2＝重組型/重組型＋親＝6785/ 二、細菌的轉導與作轉導（transduction）：指以噬菌體為媒介將1、轉導現象的1951LederbergZinder在鼠傷寒沙門氏菌中將兩個營養(yǎng)缺陷型LT22和LT2進行雜phe－trp－tyr－met+his+×phe+trp+tyr+met－原因證實

↓混合培養(yǎng)基本培養(yǎng)基↓phe+trp+tyr+met+

a、10－5>10－12（10－6×10－6） U型管試驗(防止細胞直接接觸)在LT-22的一臂也獲得野生型重組體→排除由于接合或性導。c、DNase處理→重組體→排除轉對FA的進一步研究證明，FA是噬菌體FA與噬菌體P22用抗P22的 抗噬菌體P22的沙門氏菌菌株對過濾性因子也表現實驗結果的解LT22菌株是攜帶P22噬菌體的溶源性細菌，LT2菌株是對P22噬菌體敏感的非溶源性細菌；在培養(yǎng)過程中，少數LT22菌自溶釋放出游離的P22噬菌體，通過U型管底的濾板(? 1m)， 裂解LT2菌；宿主 DNA被裂解成小片段某些LT2的 段在P22噬菌體組裝時，偶爾轉導噬菌體再次進入LT22菌，經重組后產生野生2、轉導的類型和特普遍性轉導：可以轉導細 的任何不同部分 的特異部分。轉導的特點：以噬菌體為媒介→將細菌的一段錯誤包裝在噬菌體的蛋白質外殼內→通過轉移到另一個受體細胞內。㈠普遍性轉導（generalized1、轉導的機2、轉導作供體a+b+→受體a－b－，得到a+b－a－b＋a+b+轉導體選擇a+或b+就可以確定兩個 Rfab＝單個轉導子數/總轉導子數選擇標記a+或選擇b+

a－b＋＋a+b+3、共轉導共轉導(cotransduction)：如果兩個 轉導，說明兩 雙因子轉導：觀察兩個的轉導，計算并比較每兩個的共轉導頻率，可以確定在染色例如：供體受 共轉導頻→a ab→→a ab→a近a在bc之→b遠三因子轉導：分析一個實驗的結果就可以推出三個 例如：供體大腸桿 型a+b+c+，受體 型abc最少的一類轉導體代表最難于轉導的情。這種轉導體的兩邊為供體 ，而中間為受，如 正確次序為a-b-c，就應為a+bc+eg:假定最少的轉導體為a+b+c，這三個 當是a-c-b或b-c-a。頻率最低共轉導的應用：測 間的連鎖關eg:E.coli的P1噬菌體進行轉導實P1侵染帶leuthrazir用轉導顆粒P1再侵染帶leu－thr－azis將受體細菌特定培養(yǎng)：培養(yǎng)在一種可選擇1～2個標 例如：1、azi＋thr培養(yǎng)基，leu為標 ，只有l(wèi)eu+才生長。150%azir23%leu+3leu+0%33 的連鎖關系實驗1 說明leu和azi較近，和thr較遠；實驗2 說明leu位于中間 最大轉導片根據共轉導頻率推 之間的物理距 d＝L1- d=同 上 之間的物理距離L=轉導DNA的平均長度（bp，kbp）X=兩個 轉換X= 例：轉導噬菌體 組大小為80kb供體：E.colitrpA+supC+pyrF+受體：E.colitrpA－supC－pyrF－以supC為選擇性標記結果： supC+trpA+ 2trpA+3trpA－０4trpA－dl(1dl(1380(13x0.2529.6k根據3可 的順序為 trpA距離supC－trpA共轉導類型是1和頻率是36+114/603=0.25，距離為29.6kbsupC－pyrF共轉導類型是1和3，頻率是0.06，距離為48.7kb。 （二）特殊性轉特殊性轉導（specializedtransduction）或局限性轉導（restrictedtransduction）：由溫和性噬菌體進行的轉導，只能轉導供體組的部分