天科微生物各章課件7生長控制一

第七章

微生物的生長及其控制微生物通過新陳代謝把營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成細(xì)胞物質(zhì)，增加個(gè)體重量的過程。生長：細(xì)胞生長到一定程度進(jìn)行分裂，產(chǎn)生同親代相似的子代細(xì)胞的過程。

繁殖：生長是一個(gè)逐步發(fā)生的量變過程;繁殖是一個(gè)產(chǎn)生新的生命個(gè)體的質(zhì)變過程。在高等生物里這兩個(gè)過程可以明顯分開，但在低等特別是在單細(xì)胞的生物里，由于細(xì)胞小，這兩個(gè)過程是緊密聯(lián)系又很難劃分的過程。單細(xì)胞微生物，生長導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量增加（細(xì)胞個(gè)體增長到一定程度就分裂成兩個(gè)大小基本相等的子代細(xì)胞）。多細(xì)胞微生物（某些霉菌），生長意味著細(xì)胞數(shù)目增加而個(gè)體數(shù)目不變，只能叫生長，而不能叫繁殖（只有通過形成無性或有性孢子使得個(gè)體數(shù)目增加的過程才叫繁殖）。第一節(jié)個(gè)體細(xì)胞生長概述一、細(xì)菌細(xì)胞的生長1.染色體DNA的復(fù)制和分離細(xì)胞伸長和DNA復(fù)制DNA分配和隔膜開始形成桿菌在生長過程中，新合成的肽聚糖是在多個(gè)位點(diǎn)插入到老細(xì)胞壁中，新老細(xì)胞壁呈間隔分布。球菌在生長過程中，新合成的肽聚糖是在赤道板附近插入，導(dǎo)致新老細(xì)胞壁明顯分開，原來的老細(xì)胞壁推向細(xì)胞兩端。2、細(xì)胞壁的擴(kuò)增熒光抗體技術(shù)3、細(xì)菌的分裂隔膜完全形成子細(xì)胞分離DNA分配和隔膜開始形成當(dāng)細(xì)菌的各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)制完成之后就進(jìn)入分裂時(shí)期，此時(shí)在細(xì)菌長軸的中間位置，通過細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷并伴隨新合成的肽聚糖插入，導(dǎo)致橫隔壁向心生長，最后在中心匯合，完成一次分裂，通常情況下，將一個(gè)細(xì)胞分裂成兩個(gè)大小相等的子細(xì)胞。二、酵母細(xì)胞的生長繁殖細(xì)胞分裂期M間隔期G1DNA合成期S第二間隔期G2核膜上的紡錘體斑通過復(fù)制由一個(gè)變?yōu)閮蓚€(gè)，DNA開始復(fù)制，芽體出現(xiàn)。紡錘體斑產(chǎn)生約15根微管，其中一個(gè)紡錘體斑沿核膜移動(dòng)180度，從而使兩個(gè)紡錘體斑通過直線形的微管連在一起。芽體增大，細(xì)胞核移到母細(xì)胞與芽體交界處，微管延長。細(xì)胞核有絲分裂，其中一個(gè)核進(jìn)入芽體，芽體子細(xì)胞與母細(xì)胞之間的壁開始合成，隨后子細(xì)胞與母細(xì)胞分離，或暫時(shí)不分離（如假絲酵母屬）繼續(xù)出芽。三、霉菌菌絲的延伸過程

頂端生長需要高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器參與。在菌絲的亞頂端區(qū)富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等細(xì)胞器。細(xì)胞膜脂肪和蛋白質(zhì)在亞頂端區(qū)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后，通過小泡囊轉(zhuǎn)移到高爾基體的近側(cè)潴泡中，由高爾基體轉(zhuǎn)向遠(yuǎn)側(cè)時(shí)，成熟而分泌泡囊。分泌的泡囊從亞頂端區(qū)移向頂端，泡囊與細(xì)胞膜融合形成細(xì)胞膜。同時(shí)釋放出細(xì)胞壁分解酶與合成酶，分解酶使壁組份間的鍵斷裂，合成酶催化合成新壁成分，并將其轉(zhuǎn)移到壁區(qū)形成新壁?！熬z尖端生長的泡囊假設(shè)”第二節(jié)微生物的群體生長一、單細(xì)胞微生物的典型生長曲線將少量純種非絲狀單細(xì)胞微生物接種到恒容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度、通氣等條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測定單位體積里的細(xì)胞數(shù)，以單位體積里細(xì)胞數(shù)的對數(shù)作縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，畫出的曲線，就是非絲狀的單細(xì)胞微生物的典型生長曲線。典型生長曲線根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)R（即每小時(shí)的分裂次數(shù)）的不同，一般可分為遲緩期（延滯期）、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等四個(gè)時(shí)期。1.延滯期（Lagphase），也稱遲緩期、延遲期、適應(yīng)期。將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后,在開始一段時(shí)間內(nèi)菌數(shù)不立即增加,或增加很少，生長速度接近于零。此時(shí)細(xì)胞特點(diǎn)可概括為：分裂遲緩、代謝活躍。該期的具體特點(diǎn)為：①生長速率常數(shù)為零；②細(xì)胞形態(tài)變大或增長，尤其是長軸最為明顯，許多桿菌可長成絲狀；③細(xì)胞內(nèi)的RNA尤其是rRNA含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性；④合成代謝十分活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加速，容易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶；⑤對外界條件如NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等理化因素反應(yīng)敏感。遲滯期出現(xiàn)的原因：微生物接種到一個(gè)新的環(huán)境，暫時(shí)缺乏分解和催化有關(guān)底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。調(diào)整代謝遲滯期的長短與菌種的遺傳性、菌齡以及移種前后所處的環(huán)境條件等因素有關(guān)，短的只需要幾分鐘，長的需數(shù)小時(shí)?？s短遲滯期的常用手段：(1)通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使遲緩期縮短；(2)利用對數(shù)期的細(xì)胞作為種子；(3)盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；(4)適當(dāng)擴(kuò)大接種量。2.指數(shù)期（Exponentialphase），又稱對數(shù)期（Logphase)指緊接遲滯期之后，細(xì)胞以幾何級數(shù)增長的一段時(shí)期。指數(shù)期的特點(diǎn)：①生長速率常數(shù)R最大且為常數(shù)，細(xì)胞每分裂一次所需的時(shí)間（稱為代時(shí)，或世代時(shí)間，或增代時(shí)間，或倍增時(shí)間，用G表示）最短且穩(wěn)定；②細(xì)胞進(jìn)行平衡生長，菌體各部分的成分十分均勻；③酶系活躍，代謝旺盛。三個(gè)重要參數(shù)的計(jì)算：繁殖代數(shù)(n)、生長速率常數(shù)(R)、代時(shí)(G)

t1

–t01G=——————=—————

nR注意：只有處于指數(shù)期，才符合以上計(jì)算公式納米細(xì)菌(nanobacteria)，三天才分裂一次；九十年代初期從地下數(shù)公里發(fā)現(xiàn)的超微型細(xì)菌，用代謝產(chǎn)生的CO2作指標(biāo)，計(jì)算出這些超微菌的代謝速率僅為地上正常細(xì)菌的10-15，有人認(rèn)為它們需要100年才能分裂一次。

影響代時(shí)的因素：1）菌種：不同的微生物及微生物的不同菌株代時(shí)不同；2）營養(yǎng)成分：在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長代時(shí)短；3）營養(yǎng)物濃度：在一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比；凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長速率的營養(yǎng)物成分，就稱為生長限制因子。4）溫度：在一定范圍，生長速率與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)。指數(shù)期細(xì)胞的應(yīng)用：適宜作“種子”；研究基礎(chǔ)代謝的材料；噬菌體增殖的最好階段；革蘭氏染色；誘變育種；3.穩(wěn)定期（Stationaryphase）指數(shù)期之后，培養(yǎng)液中活細(xì)菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定的階段(可能由于細(xì)菌分裂增加的數(shù)量等于細(xì)菌死亡數(shù)，或者細(xì)胞僅停止分裂而保持代謝活性)。穩(wěn)定期特點(diǎn)：①生長速率常數(shù)R降低至0；②代時(shí)G延長；③細(xì)胞重要的分化階段；細(xì)胞開始衰老，原生質(zhì)分布不均勻，出現(xiàn)液泡；開始積累糖原等內(nèi)含物；產(chǎn)芽孢的菌開始形成芽孢；次生代謝產(chǎn)物（抗生素等）開始大量合成④菌體的最大收獲期①穩(wěn)定期如果及時(shí)采取措施，補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件（調(diào)整pH、溫度、通氣），可以獲得更多的菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物。②對以收獲菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物（SCP、乳酸等）為目的的發(fā)酵生產(chǎn)來說，穩(wěn)定期是產(chǎn)物的最佳收獲期。③通過對穩(wěn)定期到來原因的研究，促使了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝、技術(shù)的創(chuàng)建。微生物在穩(wěn)定期的生長規(guī)律對于生產(chǎn)實(shí)踐的指導(dǎo)意義：4.衰亡期（Decline或Deathphase）營養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細(xì)菌死亡速率超過新生速率，整個(gè)群體呈現(xiàn)出負(fù)增長。該時(shí)期死亡的細(xì)菌以對數(shù)方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性也會使細(xì)菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。衰亡期特點(diǎn)：①生長速率常數(shù)R小于0；②細(xì)胞形態(tài)發(fā)生多形化

出現(xiàn)畸形或細(xì)胞大小懸殊；有些微生物因蛋白酶活力的增強(qiáng)而發(fā)生自溶，有些微生物產(chǎn)生或釋放出一些代謝產(chǎn)物如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等；芽孢桿菌往往在此期釋放芽孢。

在實(shí)際工作中多采用分光光度計(jì)測定OD值的方法繪制細(xì)菌的生長曲線，但該法繪制的生長曲線不能反映衰亡期。二.絲狀真菌的生長曲線絲狀真菌是以菌絲干重（mg）作為衡量生長狀況的縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。絲狀真菌的生長曲線由三個(gè)時(shí)期組成：延滯期，快速生長期，衰亡期絲狀真菌不是單細(xì)胞，其繁殖不以幾何級數(shù)增加，故沒有指數(shù)生長期三、同步生長（Synchronousgrowth）同步培養(yǎng):使群體中的所有個(gè)體細(xì)胞處于同樣細(xì)胞生長和分裂周期中（即大多數(shù)細(xì)胞能同時(shí)進(jìn)行生長或分裂）的培養(yǎng)方法。通過同步培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞被稱為同步細(xì)胞或同步培養(yǎng)物。問題：如何研究在單個(gè)細(xì)胞的生理與遺傳特性。通過同步培養(yǎng)方法的處理，非同步群體細(xì)胞處于同一生長階段，并能同時(shí)進(jìn)行分裂的生長狀態(tài)，稱為同步生長。同步生長往往只能維持2-3個(gè)世代，隨后又逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機(jī)生長。1.機(jī)械篩選法硝酸纖維素濾膜法（膜洗脫法，右圖a）同步培養(yǎng)的方法有兩類：離心法,右圖b過濾法機(jī)械法優(yōu)點(diǎn)：不影響菌體的代謝與活性，細(xì)胞保持自然狀態(tài)。2.環(huán)境條件控制法環(huán)境環(huán)境控制法的缺點(diǎn)：細(xì)胞活性受到不同程度的影響。溫度培養(yǎng)基成份其他光合細(xì)菌：光照和黑暗交替培養(yǎng)；芽孢菌：形成芽孢后加熱處理四、連續(xù)培養(yǎng)(Continousculture）分批培養(yǎng)（batchculture）封閉培養(yǎng)（closedculture）培養(yǎng)基一次加入，不予補(bǔ)充，不再更換連續(xù)培養(yǎng)(Continousculture）在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物生長處于平衡生長狀態(tài)，能以恒定的生長速率生長的一種培養(yǎng)方法。若在一個(gè)開放的系統(tǒng)中(恒定容積的流動(dòng)系統(tǒng))培養(yǎng)微生物，培養(yǎng)過程中不斷補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物，是實(shí)現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)恒定，即處于穩(wěn)態(tài)。單細(xì)胞微生物的生長符合典型的生長曲線最簡單的連續(xù)培養(yǎng)裝置包括：培養(yǎng)室、無菌培養(yǎng)基儲存器和調(diào)節(jié)流速的控制系統(tǒng)。連續(xù)培養(yǎng)的主要參數(shù)稀釋率D（h-1）：即培養(yǎng)基每小時(shí)流過培養(yǎng)容器的體積數(shù)。D==培養(yǎng)基的流動(dòng)速率培養(yǎng)室的容積FV無菌培養(yǎng)基儲存器培養(yǎng)室調(diào)節(jié)流速的控制閥1.連續(xù)培養(yǎng)的類型根據(jù)控制培養(yǎng)基流入培養(yǎng)容器方式的不同可分兩種類型：恒濁器連續(xù)培養(yǎng)和恒化器連續(xù)培養(yǎng)。A.恒濁培養(yǎng)系統(tǒng)B.恒化培養(yǎng)系統(tǒng)1.盛無菌培養(yǎng)基的容器2.控制流速閥3.培養(yǎng)室4.排出管5.光源6.光電池7.排出物恒濁器：根據(jù)培養(yǎng)室內(nèi)微生物的生長密度，借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)基的流速，以取得菌體密度高、生長速率恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)器。恒化器：培養(yǎng)基流速恒定，通過控制培養(yǎng)基中某一生長限制性底物的濃度來調(diào)節(jié)微生物的生長速率,使微生物維持恒定生長速率的連續(xù)培養(yǎng)裝置。兩種連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的比較裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產(chǎn)物應(yīng)用恒濁器菌體密度無限制生長因子不恒定最高菌體或與菌體相平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)恒化器培養(yǎng)基流速有限制生長因子恒定低于最高速率不同生長速率的菌體實(shí)驗(yàn)室科研恒化器中的菌體濃度不由稀釋率決定，而由生長限制性底物濃度決定。通過控制流速可得到生長速率不同但密度基本恒定的培養(yǎng)物，微生物始終在低于其最高生長速率下進(jìn)行生長繁殖。遺傳學(xué)：突變株分離；生理學(xué)：不同條件下的代謝變化；生態(tài)學(xué)：模擬自然營養(yǎng)條件建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿绻鶕?jù)連續(xù)培養(yǎng)器串聯(lián)的數(shù)目分，也可分為兩種類型：單級連續(xù)培養(yǎng)多級連續(xù)培養(yǎng)適用于：代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生速率與菌體生長速率相平行的培養(yǎng)微生物代謝產(chǎn)物與菌體生長不平行，例如丙酮、丁醇或某些次級代謝產(chǎn)物（抗生素、維生素等）的生產(chǎn)，應(yīng)采取多級連續(xù)培養(yǎng)法，第一級發(fā)酵罐中以培養(yǎng)菌體為主，后幾級則以產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物為主。連續(xù)培養(yǎng)應(yīng)用與生產(chǎn)就稱為連續(xù)發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)：

高效：簡化操作單元，縮短生產(chǎn)周期，提高設(shè)備利用率；便于自動(dòng)控制；降低動(dòng)力消耗及體力勞動(dòng)強(qiáng)度；產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定。雜菌污染機(jī)會增多；易菌種退化；營養(yǎng)物利用率低。連續(xù)發(fā)酵的缺點(diǎn)：2.連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用第三節(jié)微生物生長的測定單位時(shí)間里微生物數(shù)量或生物量（Biomass）的變化。微生物生長測定：微生物生長的測定方法計(jì)數(shù)評價(jià)培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響；評價(jià)不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制(或殺死)作用的效果；客觀地反映微生物生長的規(guī)律。質(zhì)量法生理指標(biāo)法一、計(jì)數(shù)法1.直接計(jì)數(shù)法采用特殊的計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板），在顯微鏡下對微生物數(shù)量進(jìn)行直接計(jì)數(shù)（計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量）缺點(diǎn):(1)不能區(qū)分死菌與活菌；(2)只適用于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物的孢子；不適于對運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；(3)需要相對高的菌體濃度(106/mL以上)；(4)個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。優(yōu)點(diǎn)：快速其它直接計(jì)數(shù)方法：

將已知顆粒濃度的樣品（例如血液）與待測細(xì)胞濃度的樣品混勻后在顯微鏡下根據(jù)二者之間的比例直接推算待測微生物細(xì)胞濃度。比例計(jì)數(shù)過濾計(jì)數(shù)當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、熒光染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上(或一定面積中)的細(xì)菌數(shù)。活菌計(jì)數(shù)采用特定的染色技術(shù)也可分別對活菌和死菌進(jìn)行分別計(jì)數(shù)（美蘭，能區(qū)分死菌和活菌的熒光試劑盒）2.間接計(jì)數(shù)法該法最常用。通常用來測定細(xì)菌、酵母菌等單細(xì)胞微生物的生長情況或樣品中所含微生物個(gè)體的數(shù)量（細(xì)菌、酵母菌、孢子）。即平板菌落計(jì)數(shù)法，又稱活菌計(jì)數(shù)法采用培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法要求操作熟練、準(zhǔn)確，否則難以得到正確的結(jié)果。樣品充分混勻；傾注法涂布法每支移液管及涂布棒只能接觸一個(gè)稀釋度的菌液；同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù),取平均值；每個(gè)平板上的菌落數(shù)目合適，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。樣品充分混勻；一個(gè)菌落可能是多個(gè)細(xì)胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）來表示，而不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。3.膜過濾培養(yǎng)法當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積