實(shí)驗(yàn)病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)

關(guān)于實(shí)驗(yàn)病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)第1頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三原理與蛋白質(zhì)分子類似，核酸也是兩性解離分子。在pH3.5時(shí)，堿基上的氨基基團(tuán)解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只有一個(gè)磷酸解離，整個(gè)核酸分子帶正電荷，在電場中向負(fù)極泳動(dòng)；在pH值為8.0~8.3時(shí)，堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。用適應(yīng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，發(fā)揮分子篩的功能，使得分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離的目的。第2頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三載樣緩沖液其中含有的甘油可以使待電泳樣品沉在點(diǎn)樣孔底部，避免樣品漂浮其中含有的溴酚藍(lán)（某些還含有二甲苯青）可以作為電泳速度度的指示分子，溴酚藍(lán)的遷移位置大約相當(dāng)于200bp左右的線性DNA分子的遷移位置。第3頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三溴化乙錠溴化乙錠含有一個(gè)可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA的結(jié)合無特異性。當(dāng)染料分子插入后，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處發(fā)射出來。溴化乙錠可以用來檢測單鏈或雙鏈核酸（DNA或RNA）。但是染料對單鏈核酸的親和力相對較小，所以其熒光產(chǎn)率也相對較低。有一些低毒產(chǎn)品替代：sybrgreen、sybrgold、genefinder第4頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三電泳準(zhǔn)備用透明膠封固玻璃板兩頭，在板一端放置電泳梳子。用1×TAE–buffer配制瓊脂糖凝膠(0.24gAgaros/32ml1×TAE–buffer)，在微波爐中加熱至瓊脂糖溶解。待溶液冷卻至60℃，加入適量Goldview(或溴化乙錠)至微紅，混勻。將溫?zé)岬沫傊悄z倒入膠模中，凝膠厚度在5-7mm之間。在凝膠完全凝固后，撕去透明膠，小心地將玻璃板移至裝有1×TAE–buffer的電泳槽中，輕輕地拔去梳子，且使緩沖液沒過膠面。第5頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三DNA電泳取9μl的DNA樣品與1μl的10*樣品緩沖液（甘油，溴酚藍(lán)，DNA穩(wěn)定劑）混合后，用微量取樣器慢慢將混合物加至樣品孔中。蓋上電泳槽并通電，使DNA向陽極移動(dòng)。當(dāng)溴酚藍(lán)在凝膠中移出適當(dāng)距離（根據(jù)DNA的大小、1kb和3kb左右的指示劑來判斷）后，切斷電源，取出玻璃板，在紫外燈下觀察，并拍照記錄結(jié)果，估測質(zhì)粒分子量的大小。第6頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三第7頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒DNA3條帶不是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。第8頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三第9頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1:學(xué)會(huì)通過雞胚接種增殖的病毒的收集2:掌握病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)的基本原理和基本操作3：理解病毒血凝和血凝抑制試驗(yàn)的應(yīng)用病毒的血凝和血凝抑制第10頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三二實(shí)驗(yàn)原理1:紅細(xì)胞凝集某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹病毒等）擁有血凝素糖蛋白，可與人或某些動(dòng)物的紅細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，從而呈現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。在此，病毒與紅細(xì)胞是配體與受體的關(guān)系，而不是顆粒性抗原與相應(yīng)抗體作用的凝集反應(yīng)。這種凝聚多種病毒都具有，不是完全特異的第11頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三2:紅細(xì)胞凝集抑制當(dāng)病毒被相應(yīng)抗體中和后，則喪失了凝集紅細(xì)胞的功能，即病毒的紅細(xì)胞凝集特性被抑制。3:利用已知抗體，可通過紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)鑒定某些具紅細(xì)胞凝集特性的病毒，同樣也可利用已知病毒抗原，通過紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)來測定抗體水平，從而評價(jià)疫苗的免疫效果，或動(dòng)物是否受到病毒感染

血凝抑制試驗(yàn)是抗原抗體的特異性血清實(shí)驗(yàn)第12頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三4紅細(xì)胞的解脫現(xiàn)象某些具紅細(xì)胞凝集特性的病毒還擁有神經(jīng)氨酸酶活性，其可使病毒從紅細(xì)胞上解脫下來，因此，血凝試驗(yàn)的時(shí)間太長，可能會(huì)在高濃度孔見到類似陰性的反應(yīng)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)過程中必須控制好時(shí)間。第13頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三

三實(shí)驗(yàn)操作(一)病毒的雞胚接種與培養(yǎng)(二)病毒尿囊液的收集

37度培養(yǎng)72小時(shí)的雞胚--放置于4度冰箱,致死雞胚--消毒氣室--用鑷子打開氣室-打開殼膜--用移液器或吸管收集尿囊液于1.5毫升離心管--5000轉(zhuǎn),離心5分鐘,以去除細(xì)胞沉淀--上清液供血凝和血凝抑制試驗(yàn)作用.(三)制備1%濃度的雞紅細(xì)胞采集新鮮的抗凝血,以生理鹽水洗3次,每次離心5分鐘,轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn),最后用生理鹽水配制成1%濃度.第14頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三(四)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)1、50μl的生理鹽水加入96孔微量板A、B行的1-12孔。2、被檢病毒液50μl分別加入A、B行（一行為標(biāo)準(zhǔn)病毒，一行為自己收集的病毒）的第一孔，然后倍比稀釋至第11孔，棄去50μl，12孔為陰性對照。3、加50μl的1%雞紅細(xì)胞于每一孔，按病毒的低濃度至高濃度加入。4、混勻、室溫靜止30min。5、確定紅細(xì)胞100%凝聚的病毒的最高稀釋度，為HA滴度。第15頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三6、血凝效價(jià)（HA）的確定將板直立，首先觀察紅細(xì)胞陰性對照，應(yīng)呈逗點(diǎn)狀。紅細(xì)胞凝集孔呈顆粒狀附于孔底。能凝集紅細(xì)胞的最高稀釋度即為血凝效價(jià)。第16頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三(五)4單位病毒液的配制以出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的最高稀釋度為1個(gè)單位,將原病毒液稀釋成4倍于最高稀釋度的病毒液,即為4單位病毒液.例如:出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的最高稀釋度是2的9次方(病毒的血凝效價(jià)為2的9次方),那么,4單位病毒液就為2的7次方.第17頁，共19頁，2023年，2月20日，星期三(六)病毒的紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)1、加生理鹽水50μl于96孔板的一排的1-12孔。2、加標(biāo)準(zhǔn)血清50μl于一排第一孔，倍比稀釋到第11孔，棄50μl。3、將50μl病毒的4個(gè)血凝單位抗原加至1到第11孔