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6/6也說(shuō)說(shuō)體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)品、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品那些事(9)第九篇紛繁復(fù)雜的企業(yè)參考品上一篇講了質(zhì)控物/品,這一篇來(lái)說(shuō)說(shuō)企業(yè)參考品。企業(yè)參考品在試劑盒的研發(fā)中處于比較重要的分量,關(guān)系到試劑盒開(kāi)發(fā)的質(zhì)量和整體進(jìn)度。企業(yè)參考品往往有以下幾個(gè)用途:①產(chǎn)品研發(fā)環(huán)節(jié),用于原材料選擇和確定,產(chǎn)品反應(yīng)體系、反應(yīng)條件的確認(rèn)和優(yōu)化,產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的確認(rèn)和優(yōu)化;②產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)節(jié),依據(jù)體系文件的規(guī)定,使用企業(yè)參考品的全套或部分,用于產(chǎn)品放行;③產(chǎn)品注冊(cè)報(bào)批或上市后監(jiān)督抽驗(yàn)環(huán)節(jié),在沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、國(guó)家參考品的情況下,依據(jù)產(chǎn)品技術(shù)要求,廠家可以使用企業(yè)參考品進(jìn)行型式檢驗(yàn);④使用環(huán)節(jié),可以提供給用戶用于方法和產(chǎn)品的選擇、驗(yàn)證或確認(rèn),檢驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量控制等。關(guān)于企業(yè)參考品,有以下幾點(diǎn)想要闡明:一、企業(yè)參考品一般是對(duì)定性產(chǎn)品而言的我們往往將定性產(chǎn)品的質(zhì)控物質(zhì)稱為參考品,這是有歷史緣由的,在第一篇里提到,WHO對(duì)定量測(cè)定傾向于使用“標(biāo)準(zhǔn)品”一詞,對(duì)定性測(cè)定側(cè)重于使用“參考品”這個(gè)術(shù)語(yǔ)。二、企業(yè)參考品與試劑盒里的質(zhì)控品不是一回事定性試劑盒里往往還帶有質(zhì)控品/對(duì)照品,本文所說(shuō)的企業(yè)參考品不是指這些質(zhì)控品/對(duì)照品,兩者的用途不一樣。試劑盒里的陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品一般用于結(jié)果判定或試驗(yàn)有效性的判斷,例如某乙肝表面抗原試劑盒(ELISA方法),試劑盒里有陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品,其用途在說(shuō)明書(shū)里有明確規(guī)定,每一板實(shí)驗(yàn),都要加質(zhì)控品,說(shuō)明書(shū)“結(jié)果判定”項(xiàng)下有4點(diǎn)規(guī)定“①試驗(yàn)有效性:陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00;陰性對(duì)照平均值≤0.10;②臨界值計(jì)算:臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15;③陰性判定:樣品OD值<臨界值為乙肝表面抗原陰性;④陽(yáng)性判定:樣品OD值≥臨界值為乙肝表面抗原陽(yáng)性”。再舉例某新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法),試劑盒里有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各1支,隨樣品參與核酸提取、擴(kuò)增過(guò)程,在結(jié)果判讀欄規(guī)定“陰性對(duì)照各檢測(cè)靶標(biāo)應(yīng)無(wú)Ct值,陽(yáng)性對(duì)照各檢測(cè)靶標(biāo)Ct≤30,需同時(shí)滿足,否則本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效?!盤CR試劑盒通常還會(huì)有內(nèi)標(biāo)(InternalControl,IC)。內(nèi)標(biāo)是指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子。內(nèi)標(biāo)與企業(yè)參考品、上述提到的試劑盒里的陽(yáng)性、陰性質(zhì)控品/對(duì)照品也不是一回事。內(nèi)標(biāo)的最大特點(diǎn)是與靶序列共同擴(kuò)增,可以對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。而其他的質(zhì)控品處理過(guò)程與樣品一致,都是獨(dú)立擴(kuò)增。內(nèi)標(biāo)有兩種形式,一種是使用天然樣品中含有的內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo),另一種是人工添加的內(nèi)標(biāo)。企業(yè)參考品是對(duì)產(chǎn)品的各項(xiàng)性能進(jìn)行確認(rèn)或驗(yàn)證的質(zhì)控品,IVD產(chǎn)品的性能包括正確度、精密度、靈敏度、特異性、檢測(cè)范圍等各項(xiàng)指標(biāo),所以參考品的組成往往不是一只,是一個(gè)“panel”。三、企業(yè)參考品的研發(fā)是IVD試劑盒研發(fā)的一部分企業(yè)參考品的用途是全面評(píng)價(jià)和確認(rèn)產(chǎn)品的各項(xiàng)性能,發(fā)揮“標(biāo)尺”、“砝碼”作用,是IVD研發(fā)、生產(chǎn)及應(yīng)用全過(guò)程中進(jìn)行產(chǎn)品安全有效性評(píng)價(jià)的必備核心耗材。在研制試劑盒的同時(shí),一般沒(méi)有現(xiàn)成的參考品,研發(fā)人員要根據(jù)所研制的試劑盒的方法原理、預(yù)期用途、擬達(dá)到的性能指標(biāo)以及研發(fā)計(jì)劃和節(jié)點(diǎn)安排,進(jìn)行企業(yè)參考品的設(shè)計(jì)和實(shí)施。因此,企業(yè)參考品的研發(fā)是IVD試劑盒研發(fā)的一方面,有的時(shí)候,可能花在企業(yè)參考品研制上的成本和時(shí)間不會(huì)比試劑盒本身要少。以新冠病毒檢測(cè)試劑為例,研發(fā)時(shí)需要做交叉反應(yīng)的確認(rèn),包括與其他人類冠狀病毒、甲流和乙流各種流感病毒、呼吸道各種病毒、腸道各種病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、相關(guān)細(xì)菌和真菌的交叉反應(yīng),據(jù)了解,這些毒株、菌株的可獲得性成為新冠產(chǎn)品研發(fā)中的重要和關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。再例如,腫瘤相關(guān)突變基因檢測(cè)試劑,其參考品的研制也比較復(fù)雜,包括來(lái)源(例如臨床樣本、永生化細(xì)胞系、基因編輯細(xì)胞系、基因工程構(gòu)建產(chǎn)品、質(zhì)粒),基因及突變位點(diǎn)、突變類型、片段長(zhǎng)度、突變頻率的設(shè)計(jì),參考品的制備(例如細(xì)胞克隆、核酸提取、純化、制備)、定性鑒定和表征、定量測(cè)定等等都是系統(tǒng)性的復(fù)雜工程。四、企業(yè)參考品設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)遵循的一些原則企業(yè)參考品的設(shè)計(jì)應(yīng)客觀合理,應(yīng)能充分評(píng)價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量,幫助發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品在設(shè)計(jì)或者生產(chǎn)中的一些缺陷和問(wèn)題,這是根本目的,這樣可以避免在臨床試驗(yàn)階段甚至上市后才發(fā)現(xiàn)問(wèn)題,從而少走彎路。在實(shí)際工作中,會(huì)經(jīng)常有同仁問(wèn)道:陽(yáng)性參考品是3支就滿足要求,還是5支滿足要求?全用質(zhì)?;蚣?xì)胞系可以嗎?不覆蓋所有的型別,可以嗎?其實(shí)對(duì)于這些問(wèn)題,我們要深刻認(rèn)識(shí)到企業(yè)參考品相當(dāng)于是對(duì)產(chǎn)品考評(píng)的考卷,如果你想產(chǎn)品60分就ok,那可以只出滿分是60分的考卷,如果你想產(chǎn)品到90分以上,那你可以出100分的試卷。企業(yè)參考品通常包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、精密度參考品、檢出限參考品等。在企業(yè)參考品的基質(zhì)選擇上,企業(yè)參考品的基質(zhì)應(yīng)可能與臨床被檢樣本相同或接近(例如血清、血漿、組織切片)。陽(yáng)性參考品主要評(píng)估產(chǎn)品的敏感性,應(yīng)具有代表性、滿足臨床樣本的分布類型、遺傳標(biāo)記代表性,應(yīng)包括強(qiáng)陽(yáng)性參考品、中等陽(yáng)性參考品、弱陽(yáng)性參考品,其中應(yīng)以中等陽(yáng)性參考品為主。如被測(cè)物包括不同的型別及亞型,一般情況下應(yīng)覆蓋。陰性參考品主要評(píng)估產(chǎn)品的特異性,陰性參考品除了有不含被測(cè)物的正?;颊邩颖就猓€應(yīng)設(shè)置一定數(shù)量的含有可能會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)物質(zhì)的樣本,包括分析物的結(jié)構(gòu)類似物、具有同源性序列的核酸片段、易引起相同或相似的臨床癥狀的其他病原體、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物等。建議還應(yīng)設(shè)置干擾評(píng)價(jià)的參考品,如常見(jiàn)的內(nèi)源性干擾物質(zhì)、常用藥物及其代謝物、樣本添加劑等。重復(fù)性參考品一般設(shè)置包含中陽(yáng)性和弱陽(yáng)性至少兩個(gè)濃度水平的參考品。檢出限參考品是評(píng)價(jià)產(chǎn)品檢出能力的重要工具,對(duì)于定性產(chǎn)品尤為重要。檢出限參考品的濃度水平可采用90~95%陽(yáng)性檢出水平或略高于試劑盒檢出限的水平,如100%陽(yáng)性檢出水平。五、企業(yè)參考品制備企業(yè)參考品制備一般包含以下過(guò)程:——原材料來(lái)源:樣本來(lái)源途徑,企業(yè)可以自行收集并建立,也以購(gòu)買商業(yè)化盤,可以委托專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行定制;——定性表征:化學(xué)結(jié)構(gòu)、組份或生物學(xué)特征的確證,例如抗原性分析、免疫原性分析,生化分析、基因序列測(cè)定,肽圖、活菌計(jì)數(shù)、效價(jià)(效力)試驗(yàn)、純度試驗(yàn)等;——處理加工過(guò)程:過(guò)濾、滅活、添加、調(diào)整、配制、分裝等;——定值過(guò)程:應(yīng)使用適當(dāng)?shù)姆椒ɑ蚪饦?biāo)準(zhǔn)方法對(duì)被測(cè)物的濃度、滴度、效價(jià)、突變頻率、DNA含量等進(jìn)行確認(rèn);——穩(wěn)定性研究:要對(duì)保存期穩(wěn)定性、使用穩(wěn)定性(開(kāi)瓶、凍融等)等進(jìn)行研究,確定效期。企業(yè)要建立自己的參考品,并固定化下來(lái)。舉例來(lái)講,對(duì)于定性試劑盒而言,檢出限這個(gè)指標(biāo)非常關(guān)鍵,因此檢出限參考品的合理設(shè)置也就顯得尤為重要,但在實(shí)際工作中,我們會(huì)發(fā)現(xiàn)有的企業(yè)設(shè)置該參考品時(shí)不太科學(xué),往往隨意選擇一個(gè)臨床的強(qiáng)陽(yáng)性樣本,然后進(jìn)行倍比稀釋,對(duì)系列稀釋的參考品進(jìn)行檢測(cè),直至檢測(cè)到結(jié)果為陰性,并將上一個(gè)稀釋度參考品設(shè)置為檢出限參考品,這樣并不能清楚的確定參考品中的被測(cè)物的具體濃度(或滴度、效價(jià)等),從而也無(wú)法保持參考品批次間的一致性。相對(duì)于定量試劑,定性試劑顯得更為多樣和復(fù)雜,體現(xiàn)在企業(yè)參考品

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