常規(guī)組織病理技術(shù)

徐州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室常規(guī)組織病理技術(shù)1病理學(xué)是研究疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律的學(xué)科，主要的研究范圍是疾病發(fā)生發(fā)展過程中組織、細胞代謝、功能及結(jié)構(gòu)的變化。病理學(xué)的發(fā)展與科學(xué)技術(shù)發(fā)展息息相關(guān)，因為病理學(xué)的發(fā)展與使用的工具和方法（即技術(shù)）的更新密切相關(guān)。

2解剖剪刀尸體解剖器官病理學(xué)顯微鏡細胞細胞病理學(xué)電鏡超微結(jié)構(gòu)超微病理學(xué)免疫學(xué)免疫組化免疫病理學(xué)分子生物學(xué)分子病理學(xué)計算機及網(wǎng)絡(luò)信息病理學(xué)工具和方法的更新與病理學(xué)的發(fā)展3病理學(xué)理論病理學(xué)技術(shù)病理學(xué)理論4技術(shù)是病理學(xué)發(fā)展之母！5病理學(xué)

傳統(tǒng)病理學(xué)現(xiàn)代病理學(xué)↓↓形態(tài)學(xué)以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)

器官病理學(xué)與其他技術(shù)相結(jié)合細胞病理學(xué)免疫病理學(xué)超微病理學(xué)分子病理學(xué)……

6病理學(xué)技術(shù)傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)常規(guī)組織病理技術(shù)（formalin固定石蠟切片HE）現(xiàn)代新技術(shù)7免疫組化HE乳腺導(dǎo)管8免疫熒光HE9結(jié)腸癌EB病毒原位分子雜交10Fish檢測人類表皮生長因子受體2基因

（humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER2）11常規(guī)組織病理技術(shù)內(nèi)容——formalin固定石蠟切片制作HE染色等基本——研究形態(tài)學(xué)必不可少的重要方法基礎(chǔ)——常規(guī)組織病理技術(shù)是現(xiàn)代新技術(shù)基礎(chǔ)優(yōu)點——簡單易操作，基本滿足日常工作需要（常規(guī)技術(shù)、常規(guī)染色）12取材HE染色封固常規(guī)技術(shù)基本流程固定切片常規(guī)技術(shù)的完成是制作出染色良好的HE切片脫水、透明、浸蠟、包埋13HE14第一節(jié)組織與細胞標(biāo)本的選擇組織標(biāo)本的選擇即取材，取材的目的是正確的獲取所需要的標(biāo)本或標(biāo)本的某一部位。15一、

組織標(biāo)本的選擇（取材）從大體標(biāo)本上按病理檢查或研究的目的、要求切取適當(dāng)大小的組織塊，供制片進行顯微鏡檢查。16材料要求：新鮮、數(shù)量、質(zhì)量取材包括兩個步驟：從人體（活檢、手術(shù)、尸檢）或動物體上獲取器官、組織↓進一步將其切取為制片所需組織塊17切取組織塊必須注意下列幾點：

1.避免人為損傷組織：總的要求——能夠反應(yīng)組織結(jié)構(gòu)特點及病變特點且能夠表明病變部位與周圍組織的關(guān)系。（1）組織塊應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)18腎臟取材19取材20（2）組織塊的采取應(yīng)在主要病變部位及正常與病變交界處2122（3）腫瘤標(biāo)本的選擇腫瘤本身、邊緣、腫瘤連同臟器表面和底、切端，轉(zhuǎn)移灶，盡量避開繼發(fā)病變

23乳腺癌24胃25注意包埋面263.組織塊大小

一般不超過2××27原則:凡可疑處均要取材285.編號、標(biāo)記296.取材剩余組織塊可放于70%酒精中保存有利于日后再取材時細胞染色，瓶子內(nèi)外亦需以標(biāo)簽注明號碼。注意：⑴盡量保留一定量的組織⑵不要隨意丟棄標(biāo)本30脫鈣骨組織需先脫鈣再取材31二、細胞取材及制片收集和制片方法32第二節(jié)組織的固定

凡是需要制作病理檢查標(biāo)本的各種組織，無論是制作切片標(biāo)本還是大體標(biāo)本，首先必須固定。固定的目的是使離體的組織、細胞盡量保持生活狀態(tài)以利觀察、研究。33一、概念將各種組織浸入某些化學(xué)試劑內(nèi)，使細胞內(nèi)的物質(zhì)能盡量保持其生活狀態(tài)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置，叫做固定。

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二.固定組織的目的（1）保持細胞與生活時的形態(tài)相似（自溶、腐?。?/p>

（2）固定可使組織內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等各種成分凝固成不溶性物質(zhì)，保持其原來結(jié)構(gòu)；（3）增加組織對染料的親和力，易著色；（4）組織硬化，便于取材、切片。35由組織固定不當(dāng)或不良對標(biāo)本造成的影響是無法糾正和彌補的!36373839

三.固定注意事項（1）固定的組織越新鮮越好（2）固定液的量：約1：10固定容器：足夠大,開口不宜太?。?）固定的溫度：室溫(25℃)（4）特殊類型染色對固定要求嚴格，組織的大小、固定的時間、溫度的適當(dāng)都應(yīng)注意。40

有專家說：若你能取到新鮮的組織，能切到厚2~4mm的切塊和記得固定液是十倍于組織塊的總體積，你的診斷的正確性已得到了80﹪的保證。41四.固定劑和固定液用于固定組織的化學(xué)物質(zhì)稱為固定劑或固定液。固定劑/單純固定液—由單一化學(xué)物質(zhì)組成混合固定液/復(fù)合固定液—由多種化學(xué)物質(zhì)混合組成42

(一)單純固定液1.甲醛：優(yōu)點●固定后的組織很少收縮?！衲鼙４嬷竞皖愔|(zhì)（用冰凍切片法），也可固定高爾基體、線粒體，又是糖的保存劑，使肝糖變成微細的顆粒團?！翊┩噶姡?小時穿透深度2.7mm，8小時為4.7mm，12小時為5mm），固定均勻，能增加組織的韌性，便于取材?！窦兹┕潭ǖ臉?biāo)本核染色甚佳?！駜r格低廉。43缺點：●經(jīng)甲醛固定的陳舊組織，尤以多血的肝脾組織易發(fā)生黑色或棕黑色的沉積（粒狀結(jié)晶），稱甲醛色素。

甲醛氧化---蟻酸與血紅蛋白結(jié)合—福爾馬林色素避免長時間固定，固定后流水沖洗

●尿酸結(jié)晶可被溶解。

44甲醛固定液的配制:（1）10%formalin市售甲醛（濃度為37~40%）1份水9份(2)中性甲醛

45優(yōu)點：●如要證明尿酸結(jié)晶和保存糖類，則須用100%酒精固定?！裨谝延脛e種固定液后，可用70%酒精較久的保存組織?！窬凭扔泄潭ㄗ饔茫钟忻撍饔?。

2.乙醇

46缺點：●經(jīng)酒精固定的標(biāo)本對核的染色不良，也不利于染色體的固定?！褚C明細胞含的脂肪和類脂質(zhì)時，不能用酒精固定?！袢缫C明組織內(nèi)的色素時，不宜以酒精作為固定劑。●不適用于固定大塊組織?！窬凭珒r格較貴。4780%-95%的酒精作為固定劑為好高濃度酒精組織硬化顯著,放置過久組織收縮明顯且質(zhì)脆,不但影響制片,組織形態(tài)也不好。很少單獨使用48（二）復(fù)合固定液1.A-F液（酒精-甲醛固定液）有固定兼脫水作用配制方法:95%酒精（A）90ml40%甲醛（F）10ml

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有防止酒精的硬化收縮作用,穿透力強,適用于外膜致密的組織配置方法：無水酒精60ml，冰醋酸10ml，氯仿30ml50

五.常用的固定方法——浸泡法其他方法：

蒸汽固定法：甲醛蒸汽小而薄的組織、細胞

細胞涂片的固定方法可采用浸入法和滴加法防摩擦脫落防交叉污染防混淆

微波固定法：優(yōu)點是核膜清晰，染色質(zhì)均勻，組織收縮??；缺點是時間及溫度(63-65℃)不易控制灌注固定法加熱蒸汽51

組織固定后的沖洗

流水沖洗沖洗的時間與組織塊的大小、固定時間的長短有關(guān)大標(biāo)本——24小時小標(biāo)本——2~10小時52第三節(jié)組織切片技術(shù)53脫水透明浸蠟封固

制作切片的方法和程序

制作切片的主要過程

包埋染色切片54一、

脫水某些溶劑置換組織內(nèi)水分的過程（一）目的石蠟切片組織中含大量水分水與石蠟不能混合必須脫去組織中的水分脫水必須干凈徹底!55（二）脫水劑能夠使組織脫水的化學(xué)物質(zhì)稱為脫水劑。常用脫水劑；與水任意比例混合酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、環(huán)己酮酒精水二甲苯56（三）脫水步驟和時間脫水時間和組織塊大小有關(guān)，一般大小為1.8㎝×1.8㎝，厚約0.2~0.3㎝的組織，其脫水步驟和時間如下：

●70%酒精1~2h

●80%酒精2~4h

●90%酒精2~4h

●95%酒精Ⅰ2~4h●95%酒精Ⅱ2~4h

●無水酒精Ⅰ2~4h

●無水酒精Ⅱ2~4h遞增酒精濃度可避免組織過度收縮57自動脫水機58(四)脫水的注意事項

組織脫水必須掌握由低濃度向高濃度逐步過渡的原則脫水時間要適度

組織脫水要徹底干凈酒精的濃度適時更換降級使用！59二、透明

組織經(jīng)酒精脫水后，還必須經(jīng)過一個媒劑透明過程

既與酒精混合又溶解于石蠟酒精石蠟媒劑使組織透明60常用透明劑二甲苯、甲苯、氯仿、香柏油等最常用二甲苯（）約30min61三、浸蠟

經(jīng)過透明的組織塊，進一步移入熔化的石蠟內(nèi)浸漬，稱為浸蠟。用其他浸透劑（火棉膠，碳蠟，明膠等）滲入組織內(nèi)部的過程稱為浸透或透入目的：使石蠟充分進入組織中，使較軟的組織塊變成有一定硬度的組織蠟塊而便于切片

62注意:●在浸蠟過程中，一般要2次或3次更換蠟缸●浸蠟時間，一般更換3次石蠟總共在3h左右●浸蠟在溫箱中進行溫度！●浸蠟用的石蠟要定期更新（降級使用）浸蠟用石蠟熔點較低,52-56℃63四、包埋使用包埋劑將處理過的組織包于其中，使組織達到一定韌度和硬度，有利于切片。石蠟包埋法；快速石蠟包埋法等6465包埋666768蠟塊6970組織芯片制作方法：

組織芯片又稱組織微列陣，是將數(shù)十個、數(shù)百個、乃至上千個小的組織片整齊的排列在某一載體上（通常是載波片）而成的微縮組織切片。

制作：采用石蠟包埋法

優(yōu)點：方法簡單易操作各組織基本在同一平面蠟與組織融合較好，不會出現(xiàn)崩塊現(xiàn)象較小的蠟塊可以包埋較多的組織附71五石蠟切片

組織經(jīng)石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機制成切片的過程稱為石蠟切片法。一般切成4~6μm，特殊情況可切1~2μm優(yōu)點：操作簡便、便于大批制作、便于長期保存

72切片前的準(zhǔn)備：高質(zhì)量的蠟塊和鋒利的切片刀是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵清潔的載玻片、恒溫烤片裝置、優(yōu)質(zhì)狼豪毛筆、彎嘴鑷過程：切片、貼附、烤片73輪轉(zhuǎn)式切片機切片7475組織漂烘儀＞40℃,＜蠟的熔點60~70℃貼片76

切片的注意事項●首先要求切片刀鋒利，刀口無缺損，才能切出完整薄片●蠟塊四周在切片時應(yīng)修切整齊，尤其是上、下緣，要求平行●切片刀及蠟塊都要固定牢靠，機身的各個部分及螺絲應(yīng)予旋緊，不可產(chǎn)生震動，搖動切片機時，用力不能過猛，以保持機身平穩(wěn)，防止震動●切片刀傾角不宜過大或過小，以20～30℃為佳●石蠟過軟或室溫過高，切片易粘于切片刀上，或發(fā)生皺縮，此時可將蠟塊置于水槽內(nèi)冷凍后再切。反之，如室溫過低或石蠟過硬，切不成片時，可在蠟塊切面上哈氣加溫77附：冰凍切片

保存酶類和抗原活性，尤其是對熱或有機溶劑耐受能力弱的酶及細胞表面抗原

術(shù)中快速病理診斷、某些特殊染色、某些免疫組織化學(xué)染色,原位分子雜交注意：用于切片形態(tài)學(xué)觀察要注意防止冰晶形成--速凍科學(xué)研究：RNA，DNA提取78普通染色HE蘇木精hematoxlin和伊紅eosin染色

常規(guī)染色染色的目的：增加組織在顯微鏡下的分辨率HE染色主要用以顯示各種組織、細胞的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)以及疾病過程中病變的發(fā)生、發(fā)展及修復(fù)的過程。常規(guī)染色特殊染色79（一）染色原理1、細胞核染色原理：核酸陰離子+蘇木素陽離子→藍色2、細胞漿染色原理：蛋白質(zhì)陽離子+伊紅陰離子→伊紅色PH值低于蛋白質(zhì)等電點3、分化和藍化作用：分化：1%鹽酸脫去多余染液藍化：弱堿性液體使蘇木素處于藍色離子狀態(tài)而使細胞核染上藍色80染色缸染色架81全自動染色機82（二）染液及溶液的配制1、蘇木精染液染核蘇木精染液的配制方法很多，如哈瑞（Harris）蘇木精染液，埃利希（Ehrlich）蘇木精染液，德拉菲爾德（Delafield）蘇木精染液，邁耶（Mayer）蘇木精染液，克拉茲（Carazzi）蘇木精染液等。832、伊紅染液

染胞漿

伊紅染液的濃度為０.２５％～１％。一般而言，其濃度低時，染色時間延長。可以是水溶液，也可以是醇溶液。84

3、分化液a)

1%鹽酸酒精溶液：鹽酸1ml，70%酒精99mlb)

0.5%～1%鹽酸水溶液：鹽酸0.5～1ml，加蒸餾水99ml以上兩種溶液以1%鹽酸酒精溶液最常用。854、

弱堿性水溶液

(1)碳酸鋰水溶液：碳酸鋰1.25g溶于蒸餾水100ml。PH值為8.0左右。(2)氫氧化銨水溶液：將氫氧化銨（氨水）逐滴加入蒸餾水中，經(jīng)攪拌后，用pH試紙檢驗溶液，pH值調(diào)至7.5～8.0之間即可?！咀⒁狻恳陨蟽煞N“弱堿性水溶液：為返藍劑，使蘇木精染色返為藍色。使用流水沖洗1～2h也可起到返藍作用，因為自來水亦呈弱堿性。86（三）染色程序與方法常規(guī)石蠟切片HE染色大體分三個步驟：1、染色前切片脫蠟水洗染色劑為水溶性，水與石蠟不溶，在染色前必須將石蠟脫盡，否則不能染色。脫蠟時間寧長勿短。二甲苯脫蠟酒精洗去二甲苯水87步驟：（1）二甲苯Ⅰ5min（烘干切片浸入，脫蠟）（2）二甲苯Ⅱ1～5min（充分溶解殘存切片上石蠟）（3）無水酒精Ⅰ1～2min（洗去二甲苯）（4）無水酒精Ⅱ1～2min（徹底洗出二甲苯）（5）95%酒精1～2min（6）

85%酒精1～2min（7）

70%酒精1～2min（用各級酒精清洗切片中的二甲苯，同時切片逐步加水，不可直接由無水酒精入水，可致切片漂浮脫落）。（8）自來水洗1～2min（9）蒸餾水洗1～2min（使水充分進入切片有利于蘇木素染液進入胞核）

882、HE染色

HE染色是先用蘇木精染液將切片組織過染，經(jīng)水洗后再用鹽酸酒精分化，弱堿性水溶液返藍。使胞核呈鮮明的藍色，胞質(zhì)及背景無色，再水洗后用伊紅染胞質(zhì)。過染蘇木素水洗分化藍化染色伊紅89

步驟（1）

蘇木精染液1～5min（2）

自來水洗3～5min（3）

1%鹽酸酒精8～15min（分化）（4）

自來水洗1～5min（5）

弱堿性水溶液30～60s（藍化）（6）

自來水洗5～10min(此時可在光鏡下觀察著色程度，如不適可作相應(yīng)處理)（7）

蒸餾水洗1～2次（8）

伊紅水溶液5～10min（9）

蒸餾水洗1～2次（用水洗去未結(jié)合的染液）90

3脫水、透明、封固

常規(guī)石蠟切片HE染色的組織切片，均以干性封固劑（中性樹膠）封藏，便于觀察和長期保存。

二甲苯透明酒精脫水水封固91封固劑

使染色后的組織封固于載玻片與蓋玻片之間而不與空氣直接接觸，避免氧化褪色；折光率與玻片的折光率相似。透明用二甲苯使組織透明（折光率）以利光線通過。92步驟

(1)

70%酒精1～2min(2)

0.5%伊紅酒精溶液0.5～2min(3)

80%酒精1～2min(4)

95%酒精1～2min(5)

無水酒精Ⅰ1～5min(6)

無水酒精Ⅱ1～5min(7)

二甲苯石炭酸混合液1～2min(8)

二甲苯Ⅰ1～2min(9)

二甲苯Ⅱ1～2min(10)中性樹膠封固93染色注意事項1.脫蠟水洗中的問題1）脫蠟時間寧可長些，不應(yīng)過短，否則脫蠟不盡，無法著色。2）

用各級酒精清洗切片中的二甲苯，同時使切片逐步加水。94

（1）蘇木精染色時間染色時間之長短不可能一成不變，與不同的組織，取材的新舊，組織固定液的不同，環(huán)境溫度等有密切關(guān)系，因此染色時間必須根據(jù)實際情況靈活掌握。

（2）伊紅染色時間伊紅染色程度應(yīng)以蘇木精對核著色程度為參照標(biāo)準(zhǔn)，以求達到對比鮮明。95

分化處理恰當(dāng)，即核的顏色達到適宜程度，應(yīng)