天然高分子材料之膠原

天然高分子材料之膠原第一頁，共四十六頁，2022年，8月28日骨組織的等級結(jié)構(gòu)

Hierarchicalarchitechtureofbone第二頁，共四十六頁，2022年，8月28日骨的等級結(jié)構(gòu)（1）密質(zhì)骨和松質(zhì)骨；（2）密質(zhì)骨骨單位和哈氏管，（3）骨層板和（4）膠原纖維組成的膠原纖維束第三頁，共四十六頁，2022年，8月28日膠原纖維結(jié)構(gòu)組成第四頁，共四十六頁，2022年，8月28日膠原分子中間部分的氨基酸排列。（a）每個第三個氨基酸殘基是甘氨酸，X和Y通常是脯氨酸和羥脯氨酸殘基，（b）甘氨酸是最小的氨基酸，（c）三股螺旋使得甘氨酸殘基指軸內(nèi)，而另外兩個殘基處于螺旋表面，（d）脯氨酸和羥脯氨酸的殘基與多肽鏈結(jié)合，增強(qiáng)分子的剛性。第五頁，共四十六頁，2022年，8月28日疏松結(jié)締組織

成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞細(xì)胞：脂肪細(xì)胞未分化的間充質(zhì)細(xì)胞白細(xì)胞組成：膠原纖維纖維：彈性纖維網(wǎng)狀纖維蛋白多糖基質(zhì)：纖維粘連蛋白組織液第六頁，共四十六頁，2022年，8月28日TypicalExtracellularmatrix第七頁，共四十六頁，2022年，8月28日細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix,ECM）ECM是細(xì)胞外大分子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)。包括：膠原、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖、彈性蛋白等。結(jié)締組織中含量較高。影響細(xì)胞的存活、死亡、增殖和分化。第八頁，共四十六頁，2022年，8月28日Collagen膠原膠原是動物中的主要纖維蛋白，是所有多細(xì)胞動物，包括海綿體、無脊椎動物和脊椎動物的細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)成分。膠原原纖維占人和高等動物總蛋白量可高達(dá)30%，其作用是保持組織完整以及提供每一個結(jié)締組織所需要的特殊力學(xué)性能。人體中有16％左右是蛋白質(zhì)，膠原占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的30－40％，主要存在于皮膚、肌肉、骨骼、牙齒內(nèi)臟和眼睛瞪部位。從生物醫(yī)學(xué)角度，膠原在發(fā)育、傷口愈合、血小板活化和血管生成中具有重要作用。另外很多遺傳病的起因也被證明是由于膠原發(fā)生了突變，而膠原在其合成、降解或免疫學(xué)方面的微小變化也可以引起許多疾病。第九頁，共四十六頁，2022年，8月28日膠原的結(jié)構(gòu)膠原是一類由20種常見的氨基酸合成而來的蛋白質(zhì)，但是它在氨基酸組成、重復(fù)的序列模式、高度的翻譯后修飾和特有的分子內(nèi)交聯(lián)上別具一格。天然的膠原蛋白是一個由3條具有左手螺旋的鏈相互纏繞形成右手超螺旋的分子。膠原的超螺旋結(jié)構(gòu)是靠鏈間氫鍵以及螺旋和超螺旋的反向盤繞維持其穩(wěn)定性的。原膠原：3條肽鏈形成的螺旋，含三種結(jié)構(gòu)：螺旋區(qū)、非螺旋區(qū)及球形結(jié)構(gòu)域。第十頁，共四十六頁，2022年，8月28日Structuralfeatures

Allcollagenmoleculesaretrimersconsistingofthreepolypeptidechains,calledchains.Alongatleastpartoftheirlength,thethreepolypeptidechainsofacollagenmoleculearewoundaroundeachothertoformaunique,rod-liketriplehelix.第十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日

一個典型的膠原分子長300nm、直徑為2.5nm。在每一條左手螺旋的膠原鏈內(nèi)，每一圈螺旋需要3個氨基酸殘基。膠原螺旋的螺旋度不象-螺旋那么高。膠原螺旋的左手性，以及膠原的許多剛性源于許多脯氨酸殘基的立體限制。膠原分子的末端含有非螺旋部分，這一部分似乎對纖維形成過程中膠原分子的正確排列以及交聯(lián)是必需的。第十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日

典型的膠原螺旋在任一圈的第3個位置上都含有甘氨酸殘基。膠原的特點(diǎn)是具有重復(fù)的-Gly-X-Y-序列，其中X常常是脯氨酸，而Y是4-羥脯氨酸，它是脯氨酸的共價修飾衍生物。脯氨酸和4-羥脯氨酸的總和占膠原分子中殘基數(shù)的四分之一。除了4-羥脯氨酸外，5-羥賴氨酸也常出現(xiàn)在膠原分子中。一條鏈上的每一組-Gly-X-Y-中的甘氨酸殘基的酰胺氫原子都能與一個相鄰鏈上的殘基X的羰基氧原子之間形成分子內(nèi)氫鍵。脯氨酸和羥脯氨酸殘基在膠原的結(jié)構(gòu)中起著至關(guān)重要的作用，這些殘基的有限的構(gòu)象松弛度不僅可以防止-螺旋的形成，而且可以使得膠原螺旋和膠原纖維本身顯示出點(diǎn)剛性。羥脯氨酸殘基的羥基參與形成的氫鍵將使膠原三股螺旋更穩(wěn)定。第十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日膠原分子中間部分的氨基酸排列。（a）每個第三個氨基酸殘基是甘氨酸，X和Y通常是脯氨酸和羥脯氨酸殘基，（b）甘氨酸是最小的氨基酸，（c）三股螺旋使得甘氨酸殘基指軸內(nèi)，而另外兩個殘基處于螺旋表面，（d）脯氨酸和羥脯氨酸的殘基與多肽鏈結(jié)合，增強(qiáng)分子的剛性。-N-C-CO-HHH-N-C-CO-H2CCH2CH2H-N-C-CO-H2CCH2CHHOH甘氨酸Gly-脯氨酸Pro-羥脯氨酸Hyp-第十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日原膠原分子二級結(jié)構(gòu)原膠原形成膠原纖維膠原纖維電鏡圖第十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日膠原類型在原纖維中發(fā)現(xiàn)了20種膠原，其中5種含量最豐富的膠原類型是：I型膠原是骨、腱、角膜和韌帶中的主要膠原，最高可達(dá)體內(nèi)所有膠原的90%。II型膠原在軟骨、玻璃體和脊索中形成原纖維。III型膠原與I型膠原并存于結(jié)締組織。V型和VI型為異三聚體，與其他三種膠原共存于原纖維中。

第十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日第十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日由成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞分泌。在RER上合成，形成三螺旋之前于Pro及Lys殘基上進(jìn)行羥基化修飾。羥化反應(yīng)由脯氨酰4羥化酶（P4H）、脯氨酰3羥化酶催化（P3H）。Vc是酶的輔助因子，Vc缺乏導(dǎo)致壞血病。交聯(lián)：由側(cè)向相鄰的lys或hyl殘基氧化后所產(chǎn)生的兩個醛基間進(jìn)行縮合而成。交聯(lián)后后形成不溶性纖維，原膠原呈階梯狀排列，電鏡下可見間隔67nm的橫紋膠原的體內(nèi)合成（翻譯）第十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日Collagenfibrilbundles:abranchingassemblyunitintendonmorphogenesis第十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日TEMimageofcollagen第二十頁，共四十六頁，2022年，8月28日膠原的一般生化特性—變性膠原變性是指三股螺旋之間的氫鍵斷裂，螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團(tuán)，因而發(fā)生性質(zhì)的改變（比如粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫外吸收增加等）。加熱、改變膠原溶液的pH值或受有機(jī)溶劑（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等影響，均可使膠原變性。通常把50%膠原分子發(fā)生變形的溫度稱為變性溫度Td（denaturationtemperature）。由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的熔解相類似，故又稱為熔點(diǎn)或熔解溫度。膠原的變性溫度與羥脯氨酸的含量呈正相關(guān)。第二十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日其它生化特性天然膠原除非先經(jīng)尿素處理使之變性，否則不易溶于堿、弱酸及一般濃的中性鹽類。等電點(diǎn)為pH7-7.8，在強(qiáng)堿下長時間浸漬，其等電點(diǎn)會下降至，并伴有溶解現(xiàn)象。膠原不溶于水，但可溶于熱水。膨潤的膠原經(jīng)加熱后，會產(chǎn)生不可逆收縮，加熱至63-65℃時，纖維長度變?yōu)樵瓉淼?/9，若再加熱，三股螺旋分開，發(fā)生熱變性，形成明膠。未變性的膠原可被酸性紅染成紅色，變性者則否。第二十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日膠原的提取--牛肌腱膠原的制備將濕重100克牛肌腱洗凈，0.5%Tris處理后取出肌腱進(jìn)行切片，用75%酒精溶液進(jìn)行消毒處理，用滅菌蒸餾水沖洗后用勻漿器勻漿，再用滅菌蒸餾水洗滌。以5000r/min離心15分鐘，收集沉淀再懸浮于生理鹽水中1小時。以5000r/min離心15分鐘，再將肌腱懸浮至于1.5L含水果蛋白酶2mg的0.05mol/l的醋酸溶液中，在4℃下慢慢攪拌消化72小時。以5000r/min離心15分種。將上清液用0.lmol/l的NaOH調(diào)節(jié)pH值至中性，加入NaCl至最終濃度達(dá)2.5mol/L左右。攪拌過夜，在中性條件下進(jìn)行鹽沉淀。以5000r/min離心15分種。沉淀即主要為1型膠原蛋白。將沉淀用冷的滅菌蒸餾水作短時間洗滌，然后溶解在0.05mol/l的醋酸溶液中，以0.05mol/l的醋酸溶液作透析外液在10℃下透析2天，然后在PH為7.4的含130mmol/l的NaCl溶液中透析。第二十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日物理改性方法通過物理手段對膠原蛋白改性有紫外線照射、重度脫水、γ射線照射和熱交聯(lián)等方法。膠原溶液如被紫外線照射,將在分子間產(chǎn)生交聯(lián),粘度增加,生成凝膠。目前常用的紫外線改性膠原膜的方法是將膠原膜放在鋁箔上,距離254nm紫外燈20cm高度,照射1～5h。對經(jīng)紫外線照射的膠原膜進(jìn)行力學(xué)性能和膠原酶試驗(yàn)表明:交聯(lián)膠原膜的收縮溫度Ts和抗膠原酶解的能力均顯著高于未交聯(lián)膠原膜。重度脫水也是膠原蛋白物理改性中常用的方法,該法是通過脫水導(dǎo)致膠原分子間交聯(lián),從而增加變性溫度,改善膠原的性能。物理方法改性膠原蛋白的優(yōu)點(diǎn)是可避免外源性有毒化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入膠原內(nèi),缺點(diǎn)是膠原交聯(lián)度低,且難以獲得均勻一致的交聯(lián)。第二十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日化學(xué)改性方法主要是通過化學(xué)交聯(lián)進(jìn)行改性。交聯(lián)劑按交聯(lián)鍵發(fā)生的部位可分為兩種:一種是分子內(nèi)交聯(lián),它是在同一個螺旋內(nèi)兩條肽鏈之間形成的交聯(lián)鍵,這類交聯(lián)鍵主要影響交聯(lián)產(chǎn)物的變性溫度和拉伸強(qiáng)度等性能;另一種是分子間交聯(lián),它是在兩條相鄰的螺旋間的肽鏈中形成的交聯(lián)鍵。這類交聯(lián)鍵主要影響交聯(lián)產(chǎn)物的溶脹性和表面延伸性。當(dāng)兩條微纖維之間的距離小于交聯(lián)劑分子的長度時,交聯(lián)也可以在兩條相鄰的微纖維之間發(fā)生。目前常用的化學(xué)交聯(lián)劑有戊二醛、1,6-己二異氰酸酯(HDI)、碳二亞胺(EDC)、疊氮二苯基磷(DPPA)、?；B氮化物、聚環(huán)氧化物以及京尼平等。第二十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日將制備的膠原膜或者海綿置于0.25%戊二醛溶液中預(yù)交聯(lián)10min后，浸泡于含0.25%戊二醛的0.05mol/L醋酸溶液，于4℃交聯(lián)24h，PBS緩沖液漂洗3次?；瘜W(xué)交聯(lián)－戊二醛交聯(lián)法

戊二醛是到目前為止應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑,其水溶液在室溫下就能高效地與膠原縮氨酸鏈上的氨基反應(yīng),形成穩(wěn)定交聯(lián)。是一種同型雙功能交聯(lián)劑。其兩個醛基可分別與兩個相同或不同分子的伯氨基形成Schiff堿,將兩個分子以五碳橋連接起來。高濃度的GTA與膠原分子賴氨酸或羥賴氨酸殘基E2氨基反應(yīng),形成分子間交聯(lián)。戊二醛與蛋白質(zhì)交聯(lián)的特點(diǎn)是活性高、反應(yīng)快、產(chǎn)物穩(wěn)定、對沸水、酸、酶的抵抗能力強(qiáng),但有細(xì)胞毒性,且其用量難以控制。第二十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日化學(xué)交聯(lián)－EDC交聯(lián)法1一乙基一3-(3一二甲基氨基丙基)一碳化二亞胺（EDC）是化學(xué)性質(zhì)極為活潑的化合物,能使氨基和羧基之間形成酰氨鍵,其既可與羧基結(jié)合,也可與氨基結(jié)合,通常羧基與EDC反應(yīng)生成中間產(chǎn)物,再與另一分子的氨基反應(yīng)而形成偶聯(lián)物。EDC反應(yīng)的pH為5～9,一般膠原交聯(lián)選擇pH7左右,4℃或室溫24h。第二十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日化學(xué)交聯(lián)－EDC交聯(lián)法將膠原海綿浸入50ml含50mmol/L的2-(N-嗎琳)乙撐磺酸(MES)的體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液中，室溫下浸泡30min。加入(EDC)65mg和N-基唬拍酞亞胺(NHS)15mg，搖動使之溶解，室溫下反應(yīng)數(shù)小時。分別用無菌0.lmol/LNa2HP04,1mol/LNaCl和蒸餾水沖洗膠原海綿，再次冷凍干燥。第二十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日應(yīng)用膠原可以用于制造止血海綿、創(chuàng)傷輔料、人工皮膚、手術(shù)縫合線、組織工程基質(zhì)等。膠原在應(yīng)用時必須交聯(lián)，以控制其物理性質(zhì)和生物可吸收性。戊二醛和環(huán)氧化合物是常用的交聯(lián)劑。殘留的戊二醛會引起生理毒性反應(yīng)，因此必須注意使交聯(lián)反應(yīng)完全。膠原交聯(lián)以后，酶降解速度顯著下降。第二十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日應(yīng)用-作為藥物和基因輸送系統(tǒng)緩釋劑是指能夠延緩藥物釋放、持續(xù)釋藥8小時以上的一類制劑。膠原材料不僅生物相容性好，而且可通過降解機(jī)制控制藥物釋放的速度，在生物材料領(lǐng)域有較多研究應(yīng)用。在藥物緩釋劑中，膠原或變性膠原明膠主要被用作藥物載體、賦型劑或緩釋殼層等，緩釋系統(tǒng)的形式有多種，如膜、海綿、片、微膠囊等。早在20世紀(jì)70年代，國外就有用無端肽再生膠原制成的0.01一0.5mm膜，對吸收的藥物可緩慢釋放的報道。隨后，又相繼對膠原藥物緩釋體系進(jìn)行了研究，膠原可吸收性緩釋藥膜、傷口控釋抗生素、緩釋微膠囊已有報道第三十頁，共四十六頁，2022年，8月28日應(yīng)用—組織工程膠原不僅可生物降解，促進(jìn)細(xì)胞生長代謝，還可與其他天然高分子、無機(jī)或有機(jī)材料以及生物材料復(fù)合，這些優(yōu)點(diǎn)使其在組織工程中優(yōu)勢明顯。近年，膠原在組織工程中的應(yīng)用研究主要有以下幾方面?；钚匀斯てつw作為各類組織培養(yǎng)系統(tǒng)的支架。膠原與其它化合物或聚合物復(fù)合后，可用于矯形外科或修復(fù)骨缺損。目前，一般是利用膠原與羚基磷灰石結(jié)合制成復(fù)合材料植入人體修復(fù)骨缺損。國內(nèi)外有不少膠原復(fù)合物在骨組織工程中應(yīng)用的報道，表明膠原在骨組織工程中有3種作用:作為支架材料，可為骨細(xì)胞的生長提供支架和促進(jìn)新骨生存;膠原的止血作用;具有覆蓋陶瓷或金屬植入物的功能。例如透明質(zhì)酸一膠原復(fù)合物系統(tǒng)作為注射骨替代材料，經(jīng)動物及臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，復(fù)合物比單一或膠原具有更強(qiáng)的骨誘導(dǎo)性第三十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日膠原殼聚糖復(fù)合膜用于人工角膜第三十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日生物礦化（Biomineralization）生物礦化是指在生物體內(nèi)形成礦物的過程。與普通水溶液中無機(jī)鹽的形成不同,生物體內(nèi)礦物的形成。是在特殊反應(yīng)介質(zhì)、有機(jī)基質(zhì)和細(xì)胞的參與下完成的。生物膜所具有的高度有序環(huán)境對礦物晶體產(chǎn)生定向誘導(dǎo),控制其成核、生長和聚集等過程。其礦化機(jī)理涉及有機(jī)大分子預(yù)組織、界面分子識別、生長調(diào)控和細(xì)胞加工等。由于生物礦化過程的復(fù)雜性,目前常用脂質(zhì)體(囊泡)、膠束、微乳液、自組裝膜(SAMs)、單分子膜和液晶等體系作為模板,模擬有機(jī)基質(zhì)的調(diào)控作用和生物大分子的指導(dǎo)作用。第三十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日自組裝（self-assembly）所謂自組裝，是指基本結(jié)構(gòu)單元(分子，納米材料，微米或更大尺度的物質(zhì)）自發(fā)形成有序結(jié)構(gòu)的一種技術(shù)。在自組裝的過程中，基本結(jié)構(gòu)單元在基于非共價鍵的相互作用下自發(fā)的組織或聚集為一個穩(wěn)定、具有一定規(guī)則幾何外觀的結(jié)構(gòu)。自組裝過程并不是大量原子、離子、分子之間弱作用力的簡單疊加，而是若干個體之間同時自發(fā)的發(fā)生關(guān)聯(lián)并集合在一起形成一個緊密而又有序的整體，是一種整體的復(fù)雜的協(xié)同作用。

第三十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日第三十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日納米－羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料的制備和表征自組裝的方法制備nHAC的新思路。這種方法的思路是在膠原分子自組裝的同時制備納米相的羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料。按照這種方法得到的材料從成分上和結(jié)構(gòu)上都和天然骨有著很大的相似性。相對于傳統(tǒng)膠原/羥基磷灰石復(fù)合材料來說，由于此材料中羥基磷灰石是納米相，材料具有更好的生物學(xué)性能。作者對這種材料的理化性能進(jìn)行了表征，并討論了動力學(xué)因素對nHAC材料制備過程的影響。第三十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日制備方法1.在酸溶的膠原溶液中緩慢滴加含有PO43-的溶液，PO43-的量為每克膠原0.055mol滴加的同時攪拌，膠原溶液的濃度為0.02g/30ml;2.攪拌同時緩慢滴加含Ca2+的水溶液于步驟1制備的溶液中，加入的Ca2+

量與第1步中加的PO43-的摩爾比為Ca：P=1.66；3.攪拌時緩慢滴加NaOH溶液至pH值為6～8，PH值用試紙或pH計(jì)測定，在PH值為5～6時開始出現(xiàn)沉淀pH值為7時出現(xiàn)白色懸濁液；4.靜置溶液1～2天，除去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復(fù)清洗三次后，放入凍干機(jī)內(nèi)冰凍干燥，隨后研磨制成干粉第三十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日樣品的分析測定對得到的nHAC材料進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：XRD測定晶體結(jié)構(gòu)熱失重分析測定有機(jī)成分（膠原等）的含量

SEM結(jié)合EDS進(jìn)行成分分析

紅外分析

第三十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日nHAC切片TEM形貌Nano-HA