微生物工程發(fā)酵過程的控制

第二節(jié)發(fā)酵過程的pH控制

pH是微生物代謝的綜合反映，又影響代謝的進行，所以是十分重要的參數(shù)。發(fā)酵過程中pH是不斷變化的，通過觀察pH變化規(guī)律可以了解發(fā)酵的正常與否一、發(fā)酵過程pH變化的原因

1、基質(zhì)代謝

（1）糖代謝特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補料的標志之一（2）氮代謝當氨基酸中的-NH2被利用后pH會下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當碳源不足時氮源當碳源利用pH上升。（3）生理酸堿性物質(zhì)利用后pH會上升或下降2、產(chǎn)物形成

某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液pH變化。如有機酸類產(chǎn)生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。

3、菌體自溶，pH上升，發(fā)酵后期，pH上升。

二、pH對發(fā)酵的影響

例

pH對林可霉素發(fā)酵的影響

林可霉素發(fā)酵開始，葡萄糖轉(zhuǎn)化為有機酸類中間產(chǎn)物，發(fā)酵液pH下降，待有機酸被生產(chǎn)菌利用，pH上升。若不及時補糖、(NH4)2SO4或酸，發(fā)酵液pH可迅速升到8.0以上，阻礙或抑制某些酶系，使林可霉素增長緩慢，甚至停止。對照罐發(fā)酵66小時pH達7.93，以后維持在8.0以上至115小時，菌絲濃度降低，NH2-N升高，發(fā)酵不再繼續(xù)。發(fā)酵15小時左右，pH值可以從消后的6.5左右下降到5.3，調(diào)節(jié)這一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高發(fā)酵單位。

1、實例pH7.0t不調(diào)pH調(diào)pH效價pH例：培養(yǎng)基初始pH值對漆酶分泌的影響pH在4～7范圍內(nèi)產(chǎn)酶最高2、pH對發(fā)酵的影響

（1）pH影響酶的活性。當pH值抑制菌體某些酶的活性時使菌的新陳代謝受阻（2）pH值影響微生物細胞膜所帶電荷的改變，從而改變細胞膜的透性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進行

（3）pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用

（4）pH影響代謝方向

pH不同，往往引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。例如黑曲霉在pH2~3時發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，在pH近中性時，則產(chǎn)生草酸。谷氨酸發(fā)酵，在中性和微堿性條件下積累谷氨酸，在酸性條件下則容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺3、pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有不同的影響

生長合成pH對菌體生長影響比產(chǎn)物合成影響小例青霉素：菌體生長最適pH3.5~6.0,產(chǎn)物合成最適pH7.2~7.4

四環(huán)素：菌體生長最適pH6.0~6.8，產(chǎn)物合成最適pH5.8~6.0XpH四環(huán)素4、最佳pH的確定配制不同初始pH的培養(yǎng)基，搖瓶考察發(fā)酵情況pH對產(chǎn)海藻酸裂解酶的影響pH對海藻糖水解酶產(chǎn)生的影響pH——菌濃

pH——酶活pH對谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活力的影響熱凝膠產(chǎn)生不同階段pH的考察pHDObiomass從圖中可見，熱凝膠發(fā)酵菌體生長和熱凝膠合成是非偶聯(lián)的，整個發(fā)酵過程可以分成兩個階段：前10h是菌體生長期，之后熱凝膠開始合成，至發(fā)酵結(jié)束是熱凝膠合成期。在菌體生長期，DO直線下降，培養(yǎng)液中的pH也迅速下降。10h左右，菌體質(zhì)量濃度達到最大值，DO和pH降至最低點（5.4～5.6），菌體生長結(jié)束。此后進入熱凝膠合成期。試驗兩階段的最適pH，見表穩(wěn)定期隨著pH降低，糖耗速率增加，生物量增加，但產(chǎn)物合成速率在pH5.6時達到最高。說明當pH小于5.6以后微生物消耗的糖并非用于合成熱凝膠，而是合成菌體。三、pH的控制

1、調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的pH?；A(chǔ)料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須調(diào)節(jié)pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要調(diào)到6.5~6.82、在基礎(chǔ)料中加入維持pH的物質(zhì)，如CaCO3

，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等3、通過補料調(diào)節(jié)pH

在發(fā)酵過程中根據(jù)糖氮消耗需要進行補料。在補料與調(diào)pH沒有矛盾時采用補料調(diào)pH如（1）調(diào)節(jié)補糖速率，調(diào)節(jié)空氣流量來調(diào)節(jié)pH(2)當NH2-N低，pH低時補氨水；當NH2-N低，pH高時補(NH4)2SO44、當補料與調(diào)pH發(fā)生矛盾時，加酸堿調(diào)pH

分別在4種緩沖介質(zhì)中，于pH6．50一9．50測定天冬酰胺酶酶活力．1甘氨酸介質(zhì)pH8.00時酶活力最高；2硼酸在pH8．50，酶反應(yīng)最快3磷酸在pH8．50，酶反應(yīng)最快4Tris在pH8．50，酶反應(yīng)最快酶活1＞2＞4＞35、不同調(diào)pH方法的影響天冬酰胺酶不同pH控制方式對目的突變株ISw330異亮氨酸搖瓶發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖所示?！?”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素聯(lián)合控制pH值。異亮氨酸發(fā)酵例：pH對L-異亮氨酸發(fā)酵的影響（天津科技大學(xué)）菌株最適生長pH控制在6.8～7.06、發(fā)酵的不同階段采取不同的pH值不同pH值對菌體的形態(tài)影響很大，當pH值高于7．5時，菌體易于老化，呈現(xiàn)球狀；當pH值低于6．5時菌體同樣受抑制，易于老化。而在7．2左右時，菌體是處于產(chǎn)酸期，呈現(xiàn)長的橢圓形；在6．9左右時，菌體處于生長期，呈“八”字形狀并占有絕對的優(yōu)勢。pH6．9時，菌體生長旺盛，pH7．15時，對菌體的產(chǎn)酸有利。因此，在發(fā)酵的產(chǎn)酸期產(chǎn)酸較高。采用階段pH控制模式進行發(fā)酵，在發(fā)酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值為7．15，到80h后pH值為7．25。產(chǎn)率22．27g·/L，產(chǎn)酸率提高12．23％。例：克拉維酸發(fā)酵中pH變換控制問題的提出：在pH低時菌體生長受抑制，在高pH時克拉維酸要分解用2.5升罐進行的不控制pH的發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，前期由于微生物產(chǎn)生的酸性副產(chǎn)物和有機酸使pH降至6.5。在達到最高細胞濃度后，pH開始從6.5升至8.3。CA產(chǎn)量達最高水平時，pH不再升高。在發(fā)酵終止時，pH再次升至8.5。隨著pH升高，CA迅速分解。研究不同pH對發(fā)酵的影響分別配置pH為6.0，7.0，8.0的培養(yǎng)基測定菌的生長和產(chǎn)物合成pH6.0時，生長受抑制，產(chǎn)物降解少pH8.0時生長良好產(chǎn)量低，產(chǎn)物降解pH7.0時的狀況控制pH7.0和8.0時，最高細胞濃度接近相同(約16％PMV)，但控制pH6．0時細胞生長受抑制。在2．5升生物反應(yīng)器內(nèi)，不控制pH時2．47μg／(m1·h)控制pH7.0時的產(chǎn)率3．37μg／(m1·h)最高控制pH8.0時，產(chǎn)率2．02μg／(m1‘h)在控制pH6．0時，CA產(chǎn)生被抑制,但降解少因此對細胞生長和CA產(chǎn)生最好將pH控制于7.0，但在控制pH7.0時，仍出現(xiàn)CA的迅速分解。由于CA生產(chǎn)的最適pH和減少CA分解的pH各不相同，因此在分批發(fā)酵中應(yīng)用了pH變換策略，使發(fā)酵pH由中性pH7．0變換為酸性pH6.0。在發(fā)酵前期，在細胞生長和產(chǎn)生CA期間控制pH7.0，4d后，當CA產(chǎn)量達最高值時，變換pH為6.0，以減少CA分解。最高CA濃度可保持24h。由于改變pH，使CA分解速率明顯降低。pH控制是一項非常細致的工作，不僅考慮最佳pH值，而且要根據(jù)生長階段考察對pH的要求。在pH控制中還要采用合適的調(diào)節(jié)方法?？偨Y(jié)小結(jié)發(fā)酵過程pH會發(fā)生變化變化原因基質(zhì)代謝產(chǎn)物形成菌體自溶對發(fā)酵的影響pHpH影響酶的活性pH值影響微生物細胞膜所帶電荷的改變pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離pH影響代謝方向pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有不同的影響

pH的控制方式基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH在基礎(chǔ)