分析不同pH下重組蛋白R(shí)1R2和R1R2CT二級(jí)結(jié)構(gòu)特性,生物化學(xué)論文

分析不同pH下重組蛋白R(shí)1R2和R1R2CT二級(jí)結(jié)構(gòu)特性,生物化學(xué)論文蜘蛛絲擁有優(yōu)異的機(jī)械和生物學(xué)性能，是一種理想的多功能材料。由于蜘蛛自相捕食和產(chǎn)絲量小等，通過馴養(yǎng)蜘蛛獲取大量蛛絲纖維的難度較高，因而采用生物技術(shù)的方式方法重組表示出蜘蛛絲蛋白成為獲取仿生蜘蛛絲纖維的主要途徑。到當(dāng)前為止，在蛛絲仿生領(lǐng)域仍未獲得突破，仿生的擬蛛絲纖維性能遠(yuǎn)不及天然蛛絲。研究表示清楚蛛絲蛋白的高分子量特性和成絲形式是決定絲纖維性能的重要因素，現(xiàn)已成為研究的熱門。典型的蛛絲蛋白由氨基端(Nterminal，NT)、羧基端(Cterminal，CT)以及占到90%的重復(fù)區(qū)(Re－peat，R)構(gòu)成。NT和CT高度保守，在蛛絲蛋白的分泌、儲(chǔ)存和成絲等經(jīng)過中起重要的調(diào)節(jié)作用。隨著pH的降低(中性到酸性)，NT二聚化，構(gòu)成蛋白網(wǎng)絡(luò)；CT則能促進(jìn)蛛絲蛋白的排列和可溶性的提高等，詳細(xì)功能尚不清楚；R主要與蜘蛛絲性能相關(guān)。另外，蛛絲蛋白纖維化還遭到鹽離子的影響，如氯化鈉能夠維持主壺腹腺絲蛋白(majorampullatespidroin，MaSp)NT單體的穩(wěn)定性等。由于主壺腹腺體容易分離，分泌的主壺腹腺絲性能突出等優(yōu)點(diǎn)，長(zhǎng)期以來一直遭到青睞。2020年本課題組獲得首條次壺腹腺絲蛋白(Minorampullatespidroin，MiSp)全長(zhǎng)編碼序列，經(jīng)比對(duì)分析得知MiSp和MaSp的CT同源性較高，但MaSpCT含有兩個(gè)保守半胱氨酸(Cysteins)，通過二硫鍵互相作用，構(gòu)成平行二聚體；MiSpCT則沒有Cys，二聚化機(jī)制和生物學(xué)功能尚未得到充分證實(shí)。為了進(jìn)一步研究蜘蛛絲蛋白MiSp重復(fù)區(qū)R和羧基端CT的二級(jí)構(gòu)造和功能，本實(shí)驗(yàn)通過克隆并在大腸桿菌Rosetta2(DE3)中分別表示出R1R2CT和R1R2兩個(gè)組合模塊蛋白，借助Ni-NTA親和色譜純化，利用圓二色譜(circulardichroism，CD)測(cè)定并分析了不同pH條件下的重組蛋白R(shí)1R2和R1R2CT二級(jí)構(gòu)造特性；采用掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope，SEM)表征R1R2和R1R2CT重組蛋白在不同pH及離子條件下的聚集和成絲情況，為成絲機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。1材料與方式方法1.1材料質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；EcoRⅠ、HindⅢ、BsaⅠ限制性內(nèi)切酶和phusionHigh-FidelityPCRMMbuffer購(gòu)自NEB公司(美國(guó))；T4DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司(美國(guó))；6his抗體購(gòu)自天根公司；Ni-NTA樹脂購(gòu)自Qiagen公司(德國(guó))。1.2方式方法1.2.1克隆構(gòu)建以MiSp全長(zhǎng)基由于模板(GenBank登錄號(hào):JX513956)，以R1p1和R1p2為引物PCR擴(kuò)增R1，以R2p1和R2p2為引物PCR擴(kuò)增R2。BsaⅠ酶切R1和R2，酶切片段回收后由T4連接酶體外連接R1和R2；以連接產(chǎn)物為模板，以R1p1和R2p2為引物擴(kuò)增R1R2；R1R2由EcoRⅠ和HindⅢ酶切，膠回收后的酶切片段與擁有一樣酶切位點(diǎn)的載體連接。以R1R2為模板，以R1R2p1和R1R2p2為引物擴(kuò)增片段R1R2，以CTp1和CTp2為引物擴(kuò)增CT；R1R2和CT分別由BsaⅠ酶切，酶切片段回收后體外連接，連接產(chǎn)物用作模板，以R1R2p1和CTp2為引物擴(kuò)增R1R2CT，產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切后與載體連接，引物序列見表1，詳細(xì)克隆構(gòu)建經(jīng)過如此圖1。1.2.2融合蛋白的表示出將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于Rosetta2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆接種于5mLLB培養(yǎng)基(含卡那霉素30mg/L)。200r/min，37℃過夜培養(yǎng)。將5mL過夜培養(yǎng)物接種于500mL新鮮LB培養(yǎng)基(含卡那霉素30mg/L)，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600為0.9左右，溫度降至25℃時(shí)參加終濃度為0.3mmol/L的IPTG，25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，離心10min(8000r/min，4℃)收集菌體，參加30mL20mmol/LTrispH8.0重懸菌體，200W超聲破碎(超聲5s，間隔8s)60次，低溫高速離心30min(12000r/min，4℃)收集上清。1.2.3蛋白表示出產(chǎn)物純化和分析上清中重組蛋白與Ni-NTA結(jié)合，由含有50mmol/L咪唑的20mmol/LTrispH8.0進(jìn)行完全洗滌，最后由含有300mmol/L咪唑的20mmol/LTrispH8.0洗脫蛋白。純化經(jīng)過中，收集穿柱液(Flowthrough)、洗滌液(Wash)、洗脫液(Elution)，并各取出20L，參加5L的5XSDS上樣緩沖液，100℃水浴10min，取適量樣品經(jīng)12%SDS電泳后進(jìn)行染色和脫色分析。樣品經(jīng)12%SDS凝膠電泳后進(jìn)行恒流電轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，以6his組氨酸標(biāo)簽作為檢測(cè)抗原，對(duì)表示出的融合蛋白進(jìn)行Westernblot來進(jìn)一步檢測(cè)，詳細(xì)方式方法參照Invitrogen操作手冊(cè)。1.2.4重組蛋白二級(jí)構(gòu)造測(cè)定實(shí)驗(yàn)中采用CD測(cè)定所有蛋白的二級(jí)構(gòu)造，均使用上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心的JASCOJ-815圓二色譜儀。終濃度為0.1g/L的重組蛋白R(shí)1R2和R1R2CT分別溶于pH5.5、6.5和7.5的PBS磷酸鹽溶液中，從190～260nm的波長(zhǎng)范圍收集信號(hào)，測(cè)試所用比色皿大小為1mm。1.2.5掃描電子顯微鏡測(cè)試分析終濃度為10mol/L的重組蛋白R(shí)1R2和R1R2CT分別溶于6種不同pH和鹽離子的溶液中:20mmol/LPBSpH5.5、20mmol/LPBSpH6.5、20mmol/LPBSpH7.5、20mmol/LPBSpH5.5(含有154mmol/LNaCl)、20mmol/LPBSpH6.5(含有154mmol/LNaCl)、20mmol/LPBSpH7.5(含有154mmol/LNaCl)，于37℃250r/min震蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)液(纖維)由東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院日立TM-1000臺(tái)式掃描電鏡測(cè)試分析。2結(jié)果2.1重組子的鑒定R1R2和R1R2CT分別與經(jīng)改造的載體pHTH連接，重組子質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司正反向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)和分析確定無突變，可用于后續(xù)的重組蛋白表示出。2.2重組蛋白表示出和純化R1和R2主要由甘氨酸(Glycine)和丙氨酸(Alanine)組成，CT序列中Gly和Ala較少，R1R2和R1R2CT的氨基酸序列見圖2。超聲破碎經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的R1R2和R1R2CTRosetta2(DE3)菌體，高速離心后的上清由Ni-NTA柱純化(Qiagen純化方式方法)。目的蛋白與Ni-NTA結(jié)合效率較高，洗脫后重組蛋白由SDS檢測(cè)，圖譜顯示目的蛋白可到達(dá)較好的純度(圖3A、B);Westernblotting圖譜進(jìn)一步證明重組蛋白的大小和完好性(圖3C)。2.3二級(jí)構(gòu)造測(cè)定我們采用CD技術(shù)分別測(cè)定于pH7.5、6.5和5.5的PBS溶液中重組蛋白R(shí)1R2和R1R2CT的二級(jí)構(gòu)造特征。R1R2在3種不同的pH中構(gòu)造類似，主要為無規(guī)卷曲構(gòu)象(圖4)。R1R2CT在208nm和222nm處呈現(xiàn)負(fù)峰，是典型的螺旋峰型(圖5)。我們的NMR結(jié)果證實(shí)CT為五螺旋構(gòu)造，且隨著pH值的降低，峰值信號(hào)向上偏移(未發(fā)表)。2.4掃描電鏡分析重組模塊蛋白R(shí)1R2、R1R2CT分別溶于6種不同pH值和離子條件下的溶液中：20mmol/LPBSpH5.5、20mmol/LPBSpH6.5、20mmol/LPBSpH7.5、20mmol/LPBSpH5.5+154mmol/LNaCl、20mmol/LPBSpH6.5+154mmol/LNaCl、20mmol/LPBSpH7.5+154mmol/LNaCl，終濃度為10mol/L.蛋白溶液經(jīng)250r/min，37℃震蕩培養(yǎng)12h后，電鏡結(jié)果顯示，R1R2和R1R2CT在pH7.5和pH6.5條件下均無可見的纖維產(chǎn)生。pH5.5時(shí)，R1R2CT構(gòu)成纖維束，外表形態(tài)光滑、形態(tài)整潔;而R1R2則構(gòu)成較為松懈的纖維，外表較為粗糙，呈扁平條帶狀。參加154mmol/L氯化鈉后，R1R2CT外表粗糙，蛋白聚集不均勻，構(gòu)成纖維形態(tài)較差;RIR2構(gòu)成的纖維量較少，但形態(tài)與無氯化鈉類似，外表形態(tài)較無氯化鈉時(shí)粗糙且不平整。3討論蛛絲蛋白由蜘蛛腹部腺體分泌產(chǎn)生，如MaSp由主壺腹腺分泌、MiSp由次壺腹腺分泌以及鞭毛狀絲蛋白(Flag)由鞭毛狀腺分泌等，主壺腹腺和次壺腹腺構(gòu)造類似。蛛絲蛋白在纖維化經(jīng)過中pH值從7.6降到6.3(當(dāng)下可測(cè)定的最低pH值)，同時(shí)離子濃度和種類亦發(fā)生變化，最后在剪切力作用下構(gòu)成高品質(zhì)的絲纖維。2007年，PloSONE報(bào)道了首條MaSp全長(zhǎng)基因組序列，蛋白序列分析表示清楚，MaSp由NT、CT以及占到95%以上的重復(fù)區(qū)R組成條MiSp全長(zhǎng)基因組序列，與MaSp類似，MiSp亦由NT、CT和R組成，R占主要部分。6種蛛絲纖維分別擁有不同的機(jī)械性能，主要由不同的重復(fù)區(qū)R決定；NT和CT在蛛絲蛋白的成絲經(jīng)過中主要起到調(diào)節(jié)、促溶以及利于纖維蛋白排列等作用。MiSp重復(fù)區(qū)域R主要由poly-Alanine(polyA)，Glycine-Glycine-X(X為其他氨基酸，GGX)以及Glycine-Alanine(GA)等模塊組成，組成的次壺腹腺絲擁有類似拖絲的機(jī)械性能。構(gòu)造分析發(fā)現(xiàn)，polyA和GA均能構(gòu)成-sheet構(gòu)造，在固態(tài)絲纖維中整潔排列構(gòu)成晶體區(qū)域，決定絲素蛋白的強(qiáng)度。GGX構(gòu)成310-helix，構(gòu)成絲纖維的無定型區(qū)域，決定絲纖維的延展性能。另外，MiSp中還帶有特殊的Spacer區(qū)域，但到當(dāng)前為止，該模塊的功能尚不清楚，我們揣測(cè)該模塊與延展性相關(guān)。在自然進(jìn)化中，重復(fù)區(qū)變化較大，但是CT在序列和構(gòu)造上高度保守，研究發(fā)現(xiàn)MaSpCT能夠穩(wěn)定絲蛋白，阻止過早的聚集，并且能夠調(diào)整重復(fù)區(qū)的排列而構(gòu)成外表形態(tài)更好的絲纖維。2018年，NATURE報(bào)道了MaSpCT的高級(jí)構(gòu)造，解釋了它在溶液中的構(gòu)造形態(tài)和它與絲蛋白儲(chǔ)存和自組裝轉(zhuǎn)變的密切相關(guān)性。另外，MaSpCT在調(diào)整重復(fù)區(qū)R二級(jí)構(gòu)造方面扮演著重要的角色，這對(duì)于絲纖維的機(jī)械性能具有很重要的作用。為了進(jìn)一步研究R和CT模塊的功能，我們構(gòu)建了R1R2和R1R2CT兩個(gè)重組克隆。通過BsaⅠ限制性內(nèi)切酶的介導(dǎo)，我們將R1和R2以及CT三段無縫連接(圖2)，排除了由酶切位點(diǎn)引入外源氨基酸的干擾。由于R1、R2以及CT中均含有稀有密碼子，因而我們選擇Rosetta2(DE3)作為表示出宿主菌體來消除稀有密碼子的影響。表示出及純化結(jié)果表示清楚(圖3)，重組蛋白R(shí)1R2和R1R2CT均可在Rosetta2(DE3)中大量表示出，采用Ni-NTA純化柱純化可得到純度較高的重組蛋白(圖3)。Westernblotting結(jié)果也證實(shí)了重組蛋白R(shí)1R2和R1R2CT的完好性和純度。R1R2主要由ploy-A、GA以及GGX組成，CD圖譜顯示(圖4和5)，R1R2重組蛋白在PBS溶液中主要為無規(guī)卷曲構(gòu)象，R1R2CT則擁有螺旋的兩個(gè)特征負(fù)峰值。我們的其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示清楚，MiSpCT為五螺旋構(gòu)象，隨著pH的降低，峰圖向上偏移，表示清楚二級(jí)構(gòu)造出現(xiàn)細(xì)微的變化(未發(fā)表)。R1R2為無規(guī)卷曲，R1R2CT為螺旋構(gòu)象，我們揣測(cè)CT能夠促進(jìn)重復(fù)區(qū)螺旋等構(gòu)象的構(gòu)成。我們?cè)?種不同的pH值及有無154mmol/LNaCl的條件下，37℃250r/min震蕩培養(yǎng)上述兩種重組蛋白12h，樣品經(jīng)SEM分析(圖6)表示清楚，在pH7.5和6.5時(shí)，R1R2CT和R1R2均無法構(gòu)成纖維，pH值降到5.5時(shí)，可構(gòu)成纖維。R1R2CT可構(gòu)成外表形態(tài)良好的重組纖維，且纖維成纖維束狀(圖6中顯示為4根單纖維的混合)，單根纖維外表光滑，呈立體圓形，大小均勻。只要重復(fù)區(qū)的R1R2重組蛋白則不同，構(gòu)成的纖維為扁平帶狀，大小不均勻。文獻(xiàn)記載MaSp重復(fù)區(qū)R重組蛋白無法構(gòu)成纖維，只要加上CT后才能構(gòu)成可見纖維。通過本實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)單獨(dú)的MiSpR1R2重組蛋白可以構(gòu)成纖維，只是纖維形態(tài)較R1R2CT不平整，呈條帶狀。因而，CT有利于絲蛋白的排列組裝而構(gòu)成較為嚴(yán)密的重組纖維。NaCl能夠維持MaSpNT單體穩(wěn)定性，不利于絲蛋白的纖維化。這里我們進(jìn)一步證實(shí)，在154mmol/LNaCl存在的條件下，R1R2和R1R2CT均可構(gòu)成纖維，但構(gòu)成纖維形態(tài)不均勻，無法呈現(xiàn)出立體圓形。本次研究通過對(duì)R1R2和R1R2CT的表示出、純化以及二級(jí)構(gòu)造和成絲傾向的分析，證實(shí)了在不同pH值的PBS中R1R2為無規(guī)卷曲構(gòu)象，而R1R2CT則主要為螺旋構(gòu)象。pH值6.5～7.5不利于絲素蛋白的纖維化，pH值為5.5時(shí)，纖維化形態(tài)較好。另外，我們還分析了NaCl對(duì)成絲的影響，結(jié)果表示清楚NaCl不利于高品質(zhì)纖維的構(gòu)成。本研究為成絲機(jī)理的研究以及通過基因工程方式方法仿生蜘蛛絲奠定了基礎(chǔ)。以下為參考文獻(xiàn)(References):[1]GILMANJJ.Strengthofspidersilk[J].Science,1996,272(5258):17a.[2]VOLLRATHF.Strengthandstructureofspiderssilks[J].Jour－nalofBiotechnology,2000,74(2):67-83.[3]LEWISRV.Spidersilk:ancientideasfornewbiomaterials[J].ChemicalReviews,2006,106(9):3762-3774.[4]KLUGEJA,RABOTYAGOVAO,LEISKGG,etal.Spidersilksandtheirapplications[J].TrendsinBiotechnology,2008,26(5):244-251.[5]RISINGA.Controlledassembly-aprerequisitefortheuseofrecombinantspidersilkinregenerativemedicine?[EB/OL].ActaBiomaterialia[6]HAUPTMANNV,WEICHERTN,MENZELM,etal.Native-sizedspidersilkproteinssynthesizedinplantaviaintein-basedmultimerization[J].TransgenicResearch,2020,22(2):369-377.[7]XIAXX,QIANZG,CSKI,etal.Native-sizedrecombinantspidersilkproteinproducedinmetabolicallyengineeredEs－cherichiacoliresultsinastrongfiber[J].ProceedingsoftheNa－tionalAcademyofSciencesofUSA,2018,107(32):14059-14063.[8]AYOUBNA,GARBJE,KUELBSA,etal.Ancientproper－tiesofspidersilksrevealedbythecompletegenesequenceoftheprey-wrappingsilkprotein(AcSp1)[J].MolecularBiologyandEvolution,2020,30(3):589-601.[9]CHENG,LIUX,ZHANGY,etal.Full-lengthminorampul－latespidroingenesequence[J].PLoSone,2020,7(12):e52293.[10]AYOUBNA,GARBJE,TINGHITELLARM,etal.Blueprintforahigh-performancebiomaterial:full-lengthspiderdraglinesilkgenes[J].PLoSone,2007,2(6):e514.[11]HAGNF.Astructuralviewonspidersilkproteinsandtheirroleinfiberassembly[J].JournalofPeptideScience,2020,18(6):357-365.[12]GAINESWA,SEHORNMG,MARCOTTEWR.SpidroinN-terminaldomainpromotesapH-dependentassociationofsilkproteinsduringself-assembly[J].TheJournalofBiologicalChemistry,2018,285(52):40745-40753.[13]ANDERSSONM,HOLML,RIDDERSTRALEY,etal.Mor－phologyandcompositionofthespidermajorampullateglandanddraglinesilk[J].Biomacromolecules,2020,14(8):2945-2952.[14]HAGNF,EISOLDTL,HARDYJG,etal.Aconservedspidersilkdomainactsasamolecularswitchthatcontrolsfibreas－sembly[J].Nature,2018,465(7295):239-242.[15]VOLLRATHF.Biologyofspidersilk[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,1999,24(2-3):81-88.。[16]JEFFERYF,LAMATTINAC,TUTON-BLASINGAMET,etal.Microdissectionofblackwidowspidersilk-producingglands[J].JournalofVisualizedExperiments(VideoJournal),2018,(47):2382.[17]ORTIZR,CESPEDESW,NIEVESL,etal.SmallampullateglandsofNephilaclavipes[J].TheJournalofExperimentalZo－ology,2000,286(2):114-119.[18]EISOLDTL,THAMMC,SCHEIBELT.Reviewtheroleofterminaldomainsduringstorageandassemblyofspidersilkproteins[J].Biopolymers,2020,97(6):355-361.[19]HUDSPETHM,NIEX,CHENW,etal.Effectofloadingrateonmechanicalpropertiesandfracturemorphologyofspidersilk[J].Biomacromolecules,2020,13(8):2240-2246.[20]JENKINSJE,SAMPATHS,BUTLERE,etal.Characterizingthesecondaryproteinstructureofblackwidowdraglinesilkusingsolid-stateNMRX-raydiffraction[J].Biomacromolecules,2020,14(10):3472-3483.[21]PARKHEAD,SEELEYSK,GARDNERK,et