色氨酸代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞

色氨酸代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞第一頁，共三十一頁，2022年，8月28日立論依據(jù)

一研究意義

（1）原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）是我國常見惡性腫瘤之一，在消化道腫瘤中，其發(fā)病率僅次于胃癌。目前肝癌的治療，除手術(shù)治療外，化療、放療、生物和免疫治療等多種治療措施的綜合運用，為提高患者生存率起到了積極的作用。但是至今，并沒有找到根治肝癌的有效方法。第二頁，共三十一頁，2022年，8月28日(2)自

Tayor等提出IFN-γ對腫瘤生長的抑制作用是其誘導(dǎo)色氨酸代謝所致的觀點后，與色氨酸分解代謝有關(guān)的酶——吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）和腫瘤的關(guān)系開始倍受關(guān)注。第三頁，共三十一頁，2022年，8月28日

近期的研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型的腫瘤中，IDO可以扮演完全不同的角色。

第四頁，共三十一頁，2022年，8月28日

在急性髓細(xì)胞樣白血病、黑色素瘤等腫瘤中，IDO可以通過抑制T細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤的生長；而在肝癌等腫瘤中，IDO的存在可以提高機(jī)體的抗癌細(xì)胞作用,目前這一作用的具體機(jī)制尚不十分清楚。第五頁，共三十一頁，2022年，8月28日（3）IDO是色氨酸分解代謝的限速酶，對色氨酸沿犬尿酸途徑進(jìn)行分解起到了重要作用。

IDO在多種組織中有表達(dá)，在感染、腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病以及妊娠期間，IDO的活性增強(qiáng)，加速色氨酸的分解。脂多糖（LPS）、IFN-γ等細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等表達(dá)IDO。

第六頁，共三十一頁，2022年，8月28日IDO的分子式為：

NH2ONH2OHOIDO為偏脂溶性物質(zhì)，可溶解于DMSO溶劑中。

第七頁，共三十一頁，2022年，8月28日IDO催化反應(yīng)如下：

色氨酸

IDON-甲酰尿氨酸

甲酰胺酶

L-犬尿素犬尿素3-羥化酶犬尿素酶3-羥基犬尿酸

鄰氨基苯甲酸犬尿素酶

非特異性羥化

羥基氨基苯甲酸

氧化酶

喹啉酸第八頁，共三十一頁，2022年，8月28日二國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：

IshioT等在體外培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，外周單核細(xì)胞加入肝癌細(xì)胞株HepG2或PLC/PRF/5共同培養(yǎng)后，可顯著誘導(dǎo)單核細(xì)胞中IDOmRNA的表達(dá)。外周單核細(xì)胞抗肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用正好與IDOmRNA的表達(dá)水平成正比，加入IDO的抑制劑1-甲基色氨酸（1-MT）后可以降低細(xì)胞毒性作用。IDO陽性的肝細(xì)胞癌病人在肝切除術(shù)后，無復(fù)發(fā)生存率高于IDO陰性的患者。

第九頁，共三十一頁，2022年，8月28日二國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：KaiS等證明IDO可以增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞(慢性髓性白血病細(xì)胞系)和HepG2細(xì)胞的功能。給與1-MT可以降低老鼠NK細(xì)胞毒素的活性。

第十頁，共三十一頁，2022年，8月28日二國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：

GuidoFrumento等證明L-犬尿素、鄰吡啶甲酸和喹啉酸等色氨酸代謝產(chǎn)物可以抑制某些淋巴細(xì)胞的增殖。此效應(yīng)在色氨酸缺乏時更為明顯。

DariuszPawlak等發(fā)現(xiàn)喹啉酸在1000μM/L濃度水平上可以降低HepG2細(xì)胞的活性。第十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日二國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：

總之，IDO抗肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制尚處于摸索階段，還有許多值得研究的地方。本課題將主要研究色氨酸在IDO催化下分解生成的幾種代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞的生長和凋亡有何影響。

第十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日研究方案

一研究目的

觀察色氨酸經(jīng)IDO催化后分解生成的各種代謝產(chǎn)物的量及其代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞的生長及凋亡的影響，為臨床治療肝癌提供新思路。第十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日二研究內(nèi)容高效液相色譜法測定色氨酸代謝產(chǎn)物的量。肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)。

MTT法測定代謝產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞的增值的抑制作用及色氨酸缺乏對這一作用的影響。流式細(xì)胞術(shù)觀察代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。

第十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日三擬解決的關(guān)鍵問題

1

HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)

2

從細(xì)胞水平來驗證色氨酸的代謝產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞是否有抑制增殖、周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡的作用。

3

各代謝產(chǎn)物濃度范圍及作用時間的選定均為本試驗的技術(shù)關(guān)鍵

4利用高效液相色譜法對色氨酸的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析

第十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日四技術(shù)路線(第一步）

。

HepG2細(xì)胞株

體外培養(yǎng)

細(xì)胞濃度達(dá)到104/ml

分0.1,1,10，100，1000μM/L濃度加入代謝產(chǎn)物

12h,24h,36h,48h后分別檢測

MTT法

HepG2細(xì)胞抑制率

統(tǒng)計學(xué)分析

第十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日四技術(shù)路線（第二步）。

HepG2細(xì)胞株

體外培養(yǎng)

細(xì)胞濃度達(dá)到104/ml

分0.5,5,50，500，5000μM/L濃度加入IDO

12h,24h,36h,48h后分別檢測

MTT法

HPLC法

HepG2細(xì)胞抑制率各代謝產(chǎn)物的量

統(tǒng)計學(xué)分析.

第十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日四技術(shù)路線（第三步）

HepG2細(xì)胞株

體外培養(yǎng)

細(xì)胞濃度達(dá)到104/ml

根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果加藥，作用一定時間離心沉淀后收集細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為5*106/ml

流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期的變化分析結(jié)果第十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日六

實驗方案

1

細(xì)胞培養(yǎng)：HepG2細(xì)胞株在DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。

2

加藥：將培養(yǎng)好的HepG2細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成104/ml單細(xì)胞懸液，置于反應(yīng)板內(nèi)，同時加藥

第十九頁，共三十一頁，2022年，8月28日

(1)選定三種代謝產(chǎn)物（L-犬尿素、3-羥基犬尿酸、喹啉酸）進(jìn)行試驗。

色氨酸充足的條件下（30μM/L）,將每種代謝產(chǎn)物分（0.1，1,10，100，1000μM/L）

5個濃度梯度，(12h,24h,36h,48h)4個反應(yīng)時間，用MTT法測細(xì)胞抑制率。繪制時間關(guān)系曲線。

另設(shè)色氨酸空白組為對照組

第二十頁，共三十一頁，2022年，8月28日

(2)色氨酸充足的條件下（30μM/L）加入IDO，分（0.5，5,50，500，5000μM/L）

5個濃度梯度(12h,24h,36h,48h)4個反應(yīng)時間，測細(xì)胞抑制率。

并用高效液相色譜法（HPLC）測出三種代謝產(chǎn)物（L-犬尿素、3-羥基犬尿酸、喹啉酸）生成的量。

第二十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日

3流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期：選取某個代謝產(chǎn)物最佳反應(yīng)濃度和反應(yīng)時間離心收集細(xì)胞，然后調(diào)整細(xì)胞為5×106/ml，處理后24h內(nèi)上機(jī)分析。

第二十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日

4統(tǒng)計學(xué)分析：統(tǒng)計描述：均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，析因設(shè)計的方差分析，樣本之間比較用SNK-Q檢驗和t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0軟件。第二十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日本課題的創(chuàng)新之處

首次將色氨酸在IDO的催化下分解生成的代謝產(chǎn)物單獨作用于HepG2肝癌細(xì)胞株，探討IDO抗肝癌細(xì)胞的作用機(jī)理，進(jìn)一步研究其對肝癌的潛在治療價值，并借此尋找肝癌治療的新途徑。第二十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日研究計劃及預(yù)測進(jìn)展

2007年3月底之前：在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)資料，反復(fù)論證該課題的可行性、科學(xué)性、創(chuàng)新性；全面了解及掌握所需要的試劑等。

2007年4月開始進(jìn)行預(yù)實驗，及時解決碰到的具體問題，并撰寫綜述。

2007年6月后開始正式實驗，做好實驗紀(jì)錄。

2007年10月爭取完成實驗。

2007年11月后整理實驗紀(jì)錄，做統(tǒng)計學(xué)處理，撰寫科研論文。

第二十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日預(yù)期研究成果

預(yù)計試驗結(jié)果為色氨酸代謝產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞有抑制增殖,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用,該作用隨藥物濃度和時間的增加而增強(qiáng)。色氨酸代謝產(chǎn)物有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。色氨酸代謝產(chǎn)物在肝癌治療上有潛在價值。第二十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日

在充分的理論，成熟的實驗條件，認(rèn)真仔細(xì)的工作之后，相信能得到滿意的結(jié)果。即使結(jié)果可能不盡人意，也會給以后的研究工作以寶貴的啟示。第二十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日研究基礎(chǔ)

一學(xué)術(shù)條件：

我院消化科有自己的實驗室及科研經(jīng)驗豐富的博士生和碩士生導(dǎo)師進(jìn)行指導(dǎo)。上幾屆研究生和導(dǎo)師王琦教授在肝癌有關(guān)方面作了大量的基礎(chǔ)性研究工作，積累了豐富的理論知識和實踐經(jīng)驗。第二十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日二實驗條件

我院實驗室和山西醫(yī)科大學(xué)實驗室具備專業(yè)的技術(shù)人員和所需的各種儀器設(shè)備，具有多年的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗，色譜法、MTT法、流式細(xì)胞術(shù)均已成熟，可以確保實驗順利完成。

三所需經(jīng)費已基本落實。第二十九頁，共三十一頁，2022年，8月28日經(jīng)費預(yù)算

支出科目

金額（萬元）

計算根據(jù)及理由

1．合計

0．752．科研業(yè)務(wù)費0．05文獻(xiàn)檢索打印論文裝訂3．實驗材料費0．40細(xì)胞培養(yǎng)試劑4．儀器設(shè)備費0．10實驗室耗材光鏡電鏡5．協(xié)作費0．10液相色譜分析流式細(xì)胞術(shù)檢測費用等6．研究組織實施費0．10論文交流第三十頁，共三十一頁，2022年，8月28日主要參考文獻(xiàn)：

1.IshioT,GotoS,TaharaK,etal.Immunoactivativeroleofindoleamine2,3-dioxygenaseinhumanhepatocellularcarcinoma[J]JournalofGastroenterologyandHepatology2004Vol19,319-326

2.KaiS,GotoS,TaharaK,etal.Inhibitionofindoleamine2,3-dioxygenasesuppressesNKcellactivityandaccel