目的基因的獲得

目的基因的獲得第一頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日contents第二頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日3.1從基因組DNA獲得目的基因堿抽提法提取總DNA層析法獲得細(xì)胞總RNA核酸的定量和純度測(cè)定第三頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日核酸電泳裝置—電泳儀第四頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日核酸電泳裝置—電泳槽、倒膠板第五頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日耗材第六頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日大腸桿菌總DNA的提取1.Pellet0.1gor2mL菌液，+TEbuffer(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)450μL+10%SDS45μL+10mg/mLPK6μL2.37℃溫浴1h(至清澈透明)3.酚/仿抽提3次(至無(wú)蛋白層)4.上清+1/10的3MNaAc,+等體積異丙醇5.75%酒精洗滌沉淀2-3次6.干燥，TAE溶解第七頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日第八頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日3.2從基因文庫(kù)中篩選目的基因基因組文庫(kù)的構(gòu)建cDNA文庫(kù)的構(gòu)建第九頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日

構(gòu)建基因組文庫(kù)篩選目的基因Genomiclibraries：acollectionofclones,representativeoftheentirestartingpopulation某種生物的基因組的全部遺傳信息切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段，再通過(guò)克隆載體貯存在一個(gè)受體菌的群體之中，這個(gè)集合即為該生物的基因組文庫(kù)構(gòu)建時(shí)遺傳信息供體是基因組DNA，因而無(wú)發(fā)育時(shí)期及組織器官特異性；一個(gè)完全的基因組文庫(kù)中包含著基因組DNA上的所有編碼區(qū)及非編碼區(qū)序列的克隆。生物有機(jī)體的每一個(gè)基因在文庫(kù)中都有其克隆，該克隆的基因片段里包括著間隔序列，所以基因組文庫(kù)可真實(shí)地顯示基因組的全部結(jié)構(gòu)信息。第十頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日基因組文庫(kù)的大小一個(gè)理想的基因組文庫(kù)，包含完整基因組的所有DNA序列理論上的克隆子數(shù)目＝基因組DNA總長(zhǎng)度/DNA插入片段的平均長(zhǎng)度實(shí)際的克隆子數(shù)目：大于理論1111載體能夠容載的DNA片段大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，構(gòu)建文庫(kù)所要求的DNA片段數(shù)目越少，所需的重組子越少。11第十一頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日121212第十二頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日Processconstructingagenemiclibrary

（基因組文庫(kù)的構(gòu)建流程）①物理切割法：超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）。②酶切法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機(jī)片段。1313（1）染色體DNA大片段的制備直接連接、人工接頭（adapter）或同聚物加尾。如：Sau3A與BamHI的酶切末端相同（二者是同尾酶）。（2）載體分別與得到的基因組DNA大片段進(jìn)行連接（3）重組載體各自轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，得到基因組文庫(kù)*（4）篩選重組子形成一個(gè)含有所有片段的菌群，這個(gè)菌群就是一個(gè)基因組文庫(kù)靶DNA未測(cè)序或未定位時(shí)，可通過(guò)基因組文庫(kù)篩選靶DNA。Q：什么是adapter？Linker？同尾酶？（第2、5章）13第十三頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日自學(xué)第十四頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日引物primer連桿linker銜接頭adaptor第十五頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日連桿Linker一種按預(yù)先設(shè)計(jì)，化學(xué)合成的寡核苷酸片斷。一般由8－12個(gè)核苷酸組成，以中線為軸兩側(cè)互補(bǔ)對(duì)稱。其上有一種或幾種限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。將連桿先連接到待連接的一種或兩種DNA片段的末端，然后用合適的限制酶切割連桿，使待連接的兩種DNA片段產(chǎn)生互補(bǔ)粘性末端，最后DNA連接酶催化，產(chǎn)生重組DNA分子。第十六頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日銜接頭adaptor一種化學(xué)合成的寡核苷酸，含有一種以上的限制酶識(shí)別序列。其與連桿的重要差別是銜接頭的一端或兩端已具有一種或兩種限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的粘性末端。第十七頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日1818采用λ噬菌體載體進(jìn)行基因組文庫(kù)的構(gòu)建示意圖Sau3AI和BamHI是同尾酶。18第十八頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日1919基因組DNA的處理：用兩種酶對(duì)基因組進(jìn)行部分酶切；EcoRI甲基化酶封閉EcoRI位點(diǎn)；EcoRI連桿(linker)與平末端連接；EcoRI酶切產(chǎn)生粘性末端；Λ噬菌體置換型載體的處理：Cos位點(diǎn)退火，載體成環(huán)；用EcoRI酶切產(chǎn)生1個(gè)大片段，2個(gè)小片段；去掉小片段，保留大片段；連接反應(yīng)：大片段與基因組片段連接形成噬菌體基因組的串聯(lián)體；在cos位點(diǎn)酶切成噬菌體大小后包裝進(jìn)噬菌體頭部；感染宿主并在宿主中增殖。Producingrepresentativegenomiclibrariesinλcloningvectors(1978年，最早用兩種不常見(jiàn)的酶酶切基因組，進(jìn)行克隆。)19第十九頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日2020CreationofagenomicDNAlibraryusingthephage-λvectorEMBL3A.(1983年，采用一種酶對(duì)基因組進(jìn)行切割。該克隆策略方便高效。)Aconvenientsimpli?cationcanbeachievedbyusingasinglerestrictionendonucleasethatcutsfrequently,suchasSau3AI.

Sau3AIandBamHIcreatethesamecohesiveends.20第二十頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日除了λ噬菌體衍生載體之外，還有其他許多的高容量克隆載體（如BAC、PAC、YAC等）都可以用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建。這些載體的優(yōu)點(diǎn)是平均插入片段的大小遠(yuǎn)大于λ置換載體，但文庫(kù)較難制備，插入片段較大，不容易直接操作。212121第二十一頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日3構(gòu)建cDNA文庫(kù)篩選目的基因mRNAcDNA反/逆轉(zhuǎn)錄DNA轉(zhuǎn)錄AcDNAlibraryisprepared

byreverse-transcribingapopulationofmRNAsand

thenscreenedforparticularclones.cDNA

library：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA分別與克隆載體重組，貯存在一個(gè)受體菌的群體中，這個(gè)群體就稱為cDNA文庫(kù)。*第二十二頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日CharacterofcDNA

library

（cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)）分離的目的基因可直接用于表達(dá)比DNA文庫(kù)小的多，容易構(gòu)建，文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行；以mRNA為材料，反映的是該生物特定發(fā)育時(shí)期、特定組織(或器官)在某種環(huán)境條件下的基因表達(dá)情況，有一定的時(shí)效性；只與編碼序列有關(guān)，因此不能反映內(nèi)含子、啟動(dòng)子、終止子以及與核糖體識(shí)別等的序列的結(jié)構(gòu)和功能特征2323*23第二十三頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日ProcessconstructingacDNAlibrary

（cDNA文庫(kù)的構(gòu)建流程）2424*(i)isolatemRNA（提取總RNA并分離mRNA）;(ii)?rst-strandDNAsynthesisonthemRNAtemplate,carriedoutwithareversetranscriptase（用Oligo(dT)（或隨機(jī)引物）作引物，以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈）;(iii)removaloftheRNAtemplate（去除RNA/DNA雜合鏈中的RNA，堿處理或RNaseH處理）;(iV)second-strandDNAsynthesisusingthefirstDNAstrandasatemplate,carriedoutwithaDNA-dependentDNApolymerase,suchasE.coliDNApolymeraseI（以cDNA第一鏈為模板，用DNA依賴性的DNA聚合酶合成cDNA第二鏈）.1：分離mRNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄的方式合成cDNA24第二十四頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日2525*2：cDNA與載體連接，形成重組載體在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。（通過(guò)接頭形成粘性末端而連接）或借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。（通過(guò)寡聚化形成粘性末端而連接）3：噬菌體顆粒的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（導(dǎo)入宿主中繁殖），得到cDNA文庫(kù)注：剛合成的cDNA雙鏈的末端幾乎不可能正好是內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，因此這里肯定不存在由粘性末端直接相連的例子。這一點(diǎn)與基因組DNA與載體的相連有所區(qū)別。4：從cDNA文庫(kù)中篩選目的重組子25第二十五頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日262626第二十六頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日2727HowtoisolatemRNA？利用mRNA都含有一段polyA尾巴的特點(diǎn)，采用親和層析柱將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。合成12－20個(gè)dT組成oligo（dT）作為引物與mRNApoly（A）尾巴雜交，用反轉(zhuǎn)錄酶引導(dǎo)可合成cDNA第一鏈。27第二十七頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日2828cDNA克隆中使用的反轉(zhuǎn)錄酶AMV：來(lái)源于禽類的成髓細(xì)胞瘤病毒MMLV：大腸桿菌中克隆的莫羅尼氏鼠白血病病毒天然來(lái)源的酶缺乏持續(xù)合成能力，但具有內(nèi)在的RNA酶活力，容易使RNA模板降解，不利于生產(chǎn)全長(zhǎng)的cDNA天然來(lái)源的酶，發(fā)揮功能的最適溫度是37℃，且通常會(huì)在富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列出轉(zhuǎn)錄終止——這些結(jié)構(gòu)往往出現(xiàn)在5端或3端的非翻譯區(qū)（這樣就不容易形成全長(zhǎng)cDNA）第二十八頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日2929現(xiàn)在常用的酶：天然的酶改造過(guò)以利于生產(chǎn)全長(zhǎng)cDNA現(xiàn)在常用突變了的反轉(zhuǎn)錄酶（老鼠病毒來(lái)源的），它們?nèi)狈NaseH活性，因此更有利于生產(chǎn)全長(zhǎng)cDNA如：LifeTechnologies公司生產(chǎn)的改造后的Super-ScriptII可以在50℃下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。第二十九頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日DevelopmentofcDNAcloningstrategiesAnearlycDNAcloningstrategy,involvinghairpin-primedsecond-strandDNAsynthesisandhomopolymertailingtoinsertthecDNAintothevector.(早期的策略：發(fā)卡方法：引導(dǎo)cDNA第二鏈的合成)3030ImprovedmethodforcDNAcloning.Thefirststrandistailedwitholigo(dC)allowingthesecondstrandtobeinitiatedusinganoligo(dG)primer.(改進(jìn)的策略：寡聚加帽法：對(duì)cDNA第一鏈同聚物加尾后，設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的引物合成cDNA第二鏈)*30第三十頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日早期cDNA策略3131mRNA的分離Oligo(dT)引物與mRNA退火，cDNA第一鏈合成降解mRNA模板，cDNA3’末端形成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)以發(fā)夾結(jié)構(gòu)為引物，合成cDNA第二鏈用S1核酸酶去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)缺點(diǎn)：S1核酸酶的作用，會(huì)使cDNA5’端的序列部分丟失31第三十一頁(yè)，共四十頁(yè)，2022年，8月28日3232合成的cDNA雙鏈通過(guò)同聚物加尾的方式與載體相連后導(dǎo)入宿主細(xì)胞中1976年，發(fā)卡方法的嚴(yán)重缺陷：S1核酸酶的切割會(huì)使克隆的5’端某些序列丟失。因此后來(lái)有了另一種方法。32第三十二頁(yè)，共四