生物制品的制備

生物制品的制備第一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)一般生物制品的制備方法一原料的選擇、預(yù)處理和保存方法在生物制品的制備過程中，起始原料的質(zhì)量直接關(guān)系到終產(chǎn)品的質(zhì)量和工藝的穩(wěn)定，有時(shí)涉及工業(yè)生產(chǎn)中的勞動(dòng)保護(hù)和安全生產(chǎn)問題。第二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）原料選擇的原則①有效成分含量高，新鮮如紫杉醇在紅豆杉的樹皮中含量較高，1萬公斤樹皮能提取1公斤紫杉醇。②來源豐富，產(chǎn)地接近③雜質(zhì)盡可能少④成本低⑤起始材料質(zhì)量穩(wěn)定起始材料質(zhì)量不穩(wěn)定，就會(huì)造成產(chǎn)品的質(zhì)量不穩(wěn)定。第三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）原料選擇的注意事項(xiàng)生物在不同的生長(zhǎng)、發(fā)育期可合成不同的生化成分，所以生物的生長(zhǎng)期對(duì)生理活性物質(zhì)的含量影響很大，對(duì)不同原料要注意選取最佳生長(zhǎng)期：①植物原料要注意它生長(zhǎng)的季節(jié)性②微生物原料最好選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，因?yàn)檫@時(shí)的微生物生長(zhǎng)代謝能力最強(qiáng)應(yīng)根據(jù)具體情況確定。③動(dòng)物原料要選擇適當(dāng)?shù)哪挲g和性別如：人絨毛膜促性腺激素

（HCG）——孕婦尿尿激酶——男性尿第四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日①橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，其實(shí)味不同。所以然者何？水土異也。（2）原料選擇的注意事項(xiàng)②山藥味甘而性平，入脾、肺、腎三經(jīng)，健脾胃，補(bǔ)肝腎。懷山藥是一種生長(zhǎng)在河南的具有健脾胃補(bǔ)肝腎的藥食同源珍貴藥材。

我國(guó)山藥產(chǎn)地眾多，但是以產(chǎn)地河南省焦作市的山藥最為優(yōu)秀，焦作古稱懷慶府，因此這里的山藥也叫懷山藥。山藥炒羊肉（助消化）草莓山藥撻（安神）第五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2007年8月31日，香港《成報(bào)》發(fā)表一篇文章：《打羊胎素可染瘋牛癥，全球首宗臺(tái)女子變植物人》——此次事件被一些專家認(rèn)為是因注射羊胎素而起。

羊胎素指一種從生長(zhǎng)在海拔4000米以上的阿爾卑斯高山黑綿羊母體內(nèi)約5個(gè)月的小羊胚胎中提取含有特別豐富活性物質(zhì)的細(xì)胞。

（2）原料選擇的注意事項(xiàng)第六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2原料的預(yù)處理生物活性物質(zhì)易失活與降解，所以需保持材料的新鮮、防止微生物污染、腐敗和變質(zhì)。①動(dòng)物原料：采集后立即處理，去除結(jié)締組織、脂肪組織等，迅速冷凍儲(chǔ)存。②植物原料：要擇時(shí)采集，并就地去除不用的部分，保鮮處理。③微生物原料：及時(shí)將菌細(xì)胞和培養(yǎng)液分開，進(jìn)行保鮮處理。第七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日3原料的保存方法①冷凍法：適用于所有生物原料，常用－40℃速凍，－80—－70℃保存時(shí)間更長(zhǎng)。②有機(jī)溶劑脫水法：常用有機(jī)溶劑是丙酮。該法適用于原料少而價(jià)值高、有機(jī)溶劑對(duì)活性物質(zhì)沒有破壞作用的原料，如腦垂體等。③防腐劑保鮮：常用乙醇、苯酚、甘油等。該法適用于液體原料，如發(fā)酵液、提取液等。

第八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日二、目的產(chǎn)物的提?。╡xtraction）(1)生物組織與細(xì)胞的破碎（obtrudeoftissueandcell）：生物制品大部分存在于生物組織或細(xì)胞中，要提高提取率，破碎過程是非常重要的。常用的破碎方法：①磨切法，該法屬于機(jī)械破碎方法，設(shè)備有組織搗碎機(jī)、膠體磨、勻漿器、勻質(zhì)機(jī)、球磨機(jī)、乳缽等。②壓力法，有加壓、減壓、滲透壓三種

第九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日③反復(fù)凍融法，設(shè)備簡(jiǎn)便，活性保持好，但用時(shí)較長(zhǎng)。④超聲波振蕩破碎法，該方法破碎效果較好，但由于局部發(fā)熱，對(duì)活性有損失。（冰?。葑匀芊ɑ蛎附夥?，用得較少。第十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）提?。╡xtraction）

生物組織與細(xì)胞破碎后要立即進(jìn)行提取。提取時(shí)，首先要根據(jù)活性物質(zhì)的性質(zhì)，

①選擇提取試劑。提取試劑主要有：水、緩沖溶液、鹽溶液、乙醇、其他有機(jī)溶劑（如氯仿、丙酮等）。②考慮提取溶劑的用量及提取次數(shù)、提取時(shí)間。

③注意提取的溫度、pH、變性劑等因素。

第十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日三、分離純化的基本過程第十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日四、分離純化的基本技術(shù)1分離純化技術(shù)應(yīng)滿足的要求①技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；

②選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來，達(dá)到較高純化倍數(shù)；

③收率要高；

④兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理或調(diào)整；

⑤分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的需求。

第十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2.細(xì)胞破碎與固液分離

（1）細(xì)胞收集常用離心分離的方法；膜過濾法也逐漸得到廣泛應(yīng)用。（2）細(xì)胞破碎有機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法。（3）固液分離分離細(xì)胞碎片是比較困難的，可以用離心、膜過濾或雙水相分配的方法，使細(xì)胞碎片分配在一相（通常為下相）而分離，同時(shí)也起部分純化作用。第十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日3.目的產(chǎn)物的分離純化

分離純化主要依賴色譜分離方法。色譜技術(shù)是下游精制階段的常用手段，該法優(yōu)點(diǎn)是具有多種多樣的分離機(jī)制，設(shè)備簡(jiǎn)單，便于自動(dòng)化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效應(yīng)。色譜技術(shù)分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜、高壓液相色譜等。

第十五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)各類生物制品的分離純化方法蛋白質(zhì)核酸糖類脂類氨基酸第十六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日一、蛋白質(zhì)類制品的分離純化方法（Isolationanddepurationofproteinproduction）

包括蛋白質(zhì)、多肽和酶類等藥物。分離純化方法有：

(1)沉淀法（precipitation）：蛋白質(zhì)、酶的初步純化往往用沉淀法。原理是使蛋白質(zhì)膠體顆粒破壞，從而沉淀蛋白質(zhì)。常用的有鹽析法（saltingout）、有機(jī)溶劑沉淀法（organicsolventprecipitation）、等電點(diǎn)沉淀法（isoelectricprecipitation）、與靶物質(zhì)結(jié)合沉淀法（如抗體—抗原）（targetbandingprecipitation）等。第十七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日蛋白質(zhì)中性鹽中和電荷水化層減弱溶解度下降，沉淀鹽析法原理等電點(diǎn)沉淀法在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負(fù)電荷相等)，此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。第十八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日(2)按分子大小分離的方法：有超濾法（ultrafiltration）和透折法（dialysis）（即膜分離方法）、凝膠層析法（gelchromatography）、超速離心法（ultracentrifugation轉(zhuǎn)速大于20000r/min）等。其中膜分離法可用于生物大分子物質(zhì)的濃縮、分級(jí)和脫鹽。

第十九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日凝膠層析又稱分子篩層析，主要根據(jù)混合物中分子的大小和形狀不同

，在通過凝膠時(shí)，分子的擴(kuò)散速率各異而達(dá)到分離的目的。凝膠顆粒具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子易進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，流程長(zhǎng)而移動(dòng)速度慢，而大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，沿凝膠顆粒間隙流動(dòng)，流程短移動(dòng)快。這種現(xiàn)象稱為分子篩效應(yīng)。第二十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日(3)按分子所帶電荷進(jìn)行分離的方法氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶均為兩性電解質(zhì)。它們具有等電點(diǎn)，在離開等電點(diǎn)的pH時(shí)便會(huì)帶正或負(fù)電荷。例如某蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為7.0，當(dāng)溶液pH為4.0時(shí)，分子則帶有正電荷。由于具有該性質(zhì)，利用帶電性質(zhì)進(jìn)行分離是極其有效的方法。利用電學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分離的方法有離子交換柱層析法（ion-exchangechromatography）、電泳法（electrophoresis）、等電聚焦法（isoelectricfocusing）等。第二十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（4）親和層析法（affinitychromatography）大部分生物活性物質(zhì)都有其作用的靶物質(zhì)，如酶與底物（或抑制劑）、抗原與抗體、激素與受體等，它們之間有特異的親合作用，利用該性質(zhì)設(shè)計(jì)的特異層析分離技術(shù)稱為親和層析。親和層析分離專一性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，是當(dāng)前應(yīng)用很廣泛的分離方法之一。另外，最近出現(xiàn)的新方法還有疏水層析（hydrophobicinteractionchromatography）等。

第二十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日親和色譜（affinitychromatography）

1）基本概念（basicconcept）親和層析是利用待分離物質(zhì)與其特異性配基之間特異性的親和力進(jìn)行分離的一類特殊的層析技術(shù)。配基（ligand）：被固定在基質(zhì)上的分子稱為配基，配基和基質(zhì)是以共價(jià)鍵結(jié)合的。基質(zhì)（matrix）：亦稱為載體（vector），是構(gòu)成固定相的骨架。第二十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2）親和層析有如下特點(diǎn)（Characteristicsof

AffinityChromatography）純化過程簡(jiǎn)單、迅速；分離效率高；產(chǎn)物純度高；必須針對(duì)某一分離對(duì)象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件。因此應(yīng)用范圍受到一定的限制。第二十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日3）親和層析的基本原理（MechanismofAffinityChromatography）①親和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑。②當(dāng)含有混合組份的樣品（流動(dòng)相）通過此固定相時(shí)，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動(dòng)相流出。③然后改變流動(dòng)相成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來。（見Fig1、Fig2）。第二十五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（Fig1.MechanismofAC）第二十六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（Fig2.MechanismofAC）抗原專一抗體基質(zhì)第二十七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日具有特異性親和作用的生物分子4）配基的種類(sortsofligand)抗原與抗體。DNA與互補(bǔ)DNA或RNA（cDNA、mRNA)。酶與其底物。激素與其受體。維生素與結(jié)合蛋白。糖蛋白與植物凝集素。第二十八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日5）親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析載體的選擇（selectionofvectors）多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過。顆粒均勻，具有良好的流速。具有惰性，盡量減少非專一性吸附。在溫和的條件下能與配基共價(jià)偶聯(lián)。第二十九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日6）常用的親和層析載體（VectorsofAffinityChromatography）纖維素（cellulose）葡聚糖凝膠（Sephadex）瓊脂糖凝膠（Sepharose）聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel）多孔玻璃珠（Bio-Glass）其它新型載體（Othergels）第三十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日7）親和層析配基的選擇（Selectionofligand）1.純化對(duì)象和配基之間必須有較強(qiáng)的親和力。2.但親和力太高也是有害的，因?yàn)樵诮怆x配基復(fù)合物時(shí)所需的條件就要強(qiáng)烈，這樣可能使生物分子變性。3.配基必須具有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，可用于和載體相連，同時(shí)又不影響配基與生物分子之間的親和力。第三十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日8）載體、配基、目的物的連接載體（VectorsorMatrix）

+配基（Ligand）

+目的物（targetmaterial）第三十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日FigACreliesuponareversiblehighly

specificbindingreaction.第三十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日FigSpacerarmprinciple

Aspacerissometimesusedtoensurefullaccessibilityoftheaffinityligand.第三十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日FigPrincipleofpreparingACmedia第三十五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日9）親和層析的基本操作方法：①平衡（Equilibration）用平衡Buffer沖洗柱體，至基線平穩(wěn).第三十六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日②樣品上柱和沖洗（Sampleapplicationandwash）樣品中的目的物與層析介質(zhì)選擇性的吸附，雜質(zhì)不被吸附。用上樣Buffer沖洗柱體，雜質(zhì)被沖洗下來。形成雜質(zhì)峰（見下圖）。第三十七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日第三十八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日③洗脫（Elution）

選擇適當(dāng)?shù)臈l件，將吸附在親和介質(zhì)上的目的物解吸下來（見下圖）。第三十九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日二、核酸類制品的分離純化方法（Isolationanddepurationofnucleicacid

）核酸類藥物生產(chǎn)方法主要有提取法和發(fā)酵法。提取法生產(chǎn)DNA和RNA，先提取核酸和蛋白質(zhì)復(fù)合物，再解離核酸與蛋白質(zhì)，然后分離RNA與DNA。發(fā)酵法主要用于生產(chǎn)單核苷酸。第四十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日高RNA含量酵母搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)物連續(xù)發(fā)酵發(fā)酵液過濾酵母菌體NaOH20℃攪拌破壁氨水處理離心上清液沉淀蛋白三氯乙酸酸調(diào)pH核酸粗品乙醇洗滌干燥RNA干品第四十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日三、糖類制品的分離純化方法（Isolationanddepurationofsugar

）

由于各種糖類制品的性質(zhì)和原料來源不同，沒有統(tǒng)一規(guī)范的提取和純化工藝。這里只介紹多糖和粘多糖的一般分離純化方法。第四十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）提取方法（extraction）

非降解法適用于從含一種粘多糖的動(dòng)物組織中提取粘多糖，提取采用的溶劑是水或鹽溶液。降解法（degradation）適用于從組織中提取結(jié)合比較牢固的粘多糖（mucoitin）。如從軟骨中分離提取硫酸軟骨素（chondroitinsulfate），就是用堿處理進(jìn)行降解。又如用酶處理法可提取與蛋白質(zhì)結(jié)合的多糖。第四十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日

（2）分離方法（isolation）

常用的分離方法是沉淀法和離子交換層析法。乙醇沉淀法（alcoholprecipitation）：是從提取液中沉淀多糖的最簡(jiǎn)易方法，也適用于分級(jí)分離。4-5倍體積的乙醇可以使任何結(jié)締組織中的粘多糖完全沉淀。用季銨化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚陰離子能與某些陽離子表面活性劑結(jié)合成不溶于水的鹽，如十六烷基三甲基銨（CTA）等。

第四十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日

離子交換層析法（ionexchangechromatagraphy)：粘多糖的聚陰離子能夠很好地被陰離子交換劑吸附和分離，如DowexI-X2（商品名）離子交換樹脂、DEAE-離子交換纖維素（二乙胺乙基）等。洗脫可用NaC1溶液進(jìn)行梯度洗脫。第四十五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日四、脂類制品的分離純化方法

（isolationanddepurationoflipoid）（1）提取方法（extraction）

脂類自然狀態(tài)下是以結(jié)合形式存在的。非極性脂是與其他脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合的。提取脂質(zhì)就是要選擇適當(dāng)?shù)娜軇﹣砥茐倪@種結(jié)合鍵，將脂質(zhì)溶解出來。常用的溶劑有組合溶劑，醇是其中的主要成分，此外還有氯仿、甲醇、水等。第四十六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）純化方法（depuration）

沉淀法(precipitation)：由于不同脂質(zhì)在丙酮中溶解度不同，故常用它進(jìn)行沉淀。吸附層析法(adsorptionchromatography)：常用吸附劑有硅膠、氧化鋁等。它是通過極性和離子力等把各種化合物結(jié)合到固體吸附劑上。洗脫一般是采用極性逐漸增大的洗脫液來進(jìn)行，非極性的先流出，極性的后流出。第四十七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日離子交換層析法（Ionexchangechromatography）:脂質(zhì)分子的存在有非解離、兩性離子和酸式解離三種狀態(tài)。根據(jù)它們?cè)谝欢╬H條件下的解離情況，選擇適當(dāng)?shù)碾x子交換劑可將它們提純。如TEAE—纖維素對(duì)分離脂肪酸和膽汁酸等特別有效。

第四十八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日五、氨基酸類制品的分離純化方法

（isolationanddepurationofAa）（1）氨基酸的生產(chǎn)方法（productionofAa）蛋白質(zhì)水解法（proteinhydrolysis）：水解法有酸水解（acidhydrolysis）、堿水解（basehydrolysis）和酶水解（enzymehydrolysis）三種。第四十九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日

①用鹽酸水解為常用方法，其優(yōu)點(diǎn)是水解迅速、完全，產(chǎn)物全部是L—型氨基酸，缺點(diǎn)是色氨酸全部被破壞，絲氨酸等部分被破壞。②堿水解法易產(chǎn)生消旋作用，較少應(yīng)用。③酶水解法水解不夠完全。

第五十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日發(fā)酵法（fermentation）：菌株經(jīng)過發(fā)酵后，從培養(yǎng)液中提純氨基酸?；瘜W(xué)合成與酶促合成法化學(xué)合成法一般得到的是DL—型氨基酸，尚需要對(duì)異構(gòu)體拆分；酶促合成法也是酶工程在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用，優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)工藝簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物少和易提純等。第五十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）氨基酸的分離方法（isolationofAa）

有沉淀法（percipitation）、吸附法（adsorption）和離子交換法（ion-exchange)。沉淀法(percipitation)：根據(jù)形成沉淀的原理不同分為兩種：①是依據(jù)不同氨基酸在水中或其他溶劑中的溶解度差異進(jìn)行沉淀分離。②是用特殊試劑沉淀某種氨基酸，如用鄰二甲苯-4-磺酸與亮氨酸形成不溶性鹽沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游離出來。第五十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日

吸附法(adsorption)：這是利用吸附劑根據(jù)氨基酸吸附力的差異進(jìn)行氨基酸分離的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分離就是利用活性炭對(duì)其吸附的原理。

離子交換法（ion-exchange)：氨基酸是兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下，不同氨基酸帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)是不相同的，因此在離子交換劑上被吸附的強(qiáng)度不同。常用的離子交換劑為強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，洗脫主要用pH梯度洗脫。

第五十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)人體來源生物制品制備實(shí)例

（Exampleofbio-preparationapplicationtohuman）一、人血漿白蛋白制劑的制備（preparationofhumanbloodplasmaalbumin）（1）結(jié)構(gòu)和性質(zhì)（structureandcharacter）人血是一種紅色混濁的、具有一定腥味與粘滯性的液體。用適當(dāng)?shù)目鼓齽┏テ渲械挠行纬煞郑ㄈ缂t血球）而得到淡黃色、半透明的液體叫血漿。第五十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日血漿中除含有大量的水分以外，還含有血漿蛋白等溶質(zhì)。白蛋白（albumin）又稱清蛋白，白蛋白是血漿蛋白中含量最高（3.8～4.8%）、分子量最小、分子數(shù)最多的一類蛋白質(zhì)。白蛋白對(duì)治療因失血、創(chuàng)傷、燒傷等引起的休克，腦水腫和大腦損傷性所致的腦壓增高，防止低蛋白血癥，肝硬化或者由腎病引起的水腫與腹水等嚴(yán)重疾病具有良好療效。第五十五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日白蛋白為單鏈分子，由584個(gè)氨基酸殘基組成，N端為天門冬氨酸，C端為亮氨酸，分子量為6.6×104，在離子強(qiáng)度為0.15時(shí)，pI為4.7，易溶于水，在60%硫酸銨飽和度以上沉淀。對(duì)酸較穩(wěn)定，受熱變性。從人體中分離的白蛋白有兩種：一種是從健康人血漿中分離制得的人血清白蛋白，另一種是從健康產(chǎn)婦胎盤中分離制得的胎盤白蛋白。第五十六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日

血（無抗凝劑）→自然凝固→分離出血清（無纖維蛋白酶原、凝血因子等）血+混合抗凝劑草酸銨草酸鉀離心上清血漿總蛋白：6.2-7.9%白蛋白：3.8-4.8%水：90-92%（現(xiàn)常用肝素、檸檬酸鈉）第五十七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）工藝路線

利凡諾,NaHCO3pH8.6,離心分離絡(luò)合物蒸餾水，NaCl，HCl弱酸性，40℃，離心離心液濃縮超濾濃縮液滅活病毒

65℃，1h；60℃，10h熱處理液除菌除菌過濾白蛋白液干燥冷凍干燥白蛋白去雜蛋白人血漿（%）圖3-1白蛋白生產(chǎn)工藝路線第五十八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）工藝要點(diǎn)

①絡(luò)合對(duì)于絡(luò)合所要求的pH值，可以略高些，這樣，白蛋白絡(luò)合完全，絡(luò)合物形成一個(gè)相當(dāng)硬的塊，傾倒上清液方便，損失少。但不能太高，以防絡(luò)合血漿中的其它蛋白，影響解離與白蛋白制劑的純度。若pH值偏低，絡(luò)合不完全，絡(luò)合物松軟，甚至成湯狀，不利于傾去上清液。血漿攪拌用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至之間，緩慢加入與血漿等體積的2.3%利凡諾溶液，邊加邊攪拌，充分絡(luò)合后。靜置2~4h，分離上清與絡(luò)合物沉淀。第五十九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日加入2.3%利凡諾溶液比加入5%利凡諾溶液的效果好？因?yàn)榧?%利凡諾溶液常造成滅活時(shí)白蛋白部分變性或者分裝困難。加入2.3%利凡諾溶液的體積一般不超過血漿體積的一半。這可能是加入利凡諾溶液除去了解離物中過多的Cl-而澄清，或者是加入的利凡諾（過量）使白蛋白與利凡諾的絡(luò)合物反溶，從而使造成混濁的物質(zhì)消失，達(dá)到澄清的目的。第六十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日②解離生產(chǎn)中要嚴(yán)格控制溶液的溫度。25℃左右室溫，絡(luò)合物形成一個(gè)硬塊，利于去上清和解離。溫度太低，雖然不影響絡(luò)合，但絡(luò)合物呈稀糊狀，傾倒上清液時(shí)常會(huì)丟失部分絡(luò)合物，而且絡(luò)合物內(nèi)殘存較多的利凡諾的水溶液。解離溫度要維持在40℃左右，是解離反應(yīng)的最適溫度。第六十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日解離液的pH值在1.28~1.45之間，解離效果良好。絡(luò)合物中加入解離液并攪拌均勻后，將解離后混合溶液pH值控制在6.0左右較理想。以解離后解離混合溶液pH值決定加入解離液的體積。解離后解離混合液的pH值高于6.5時(shí)，表明加入的解離液少了，有部分絡(luò)合物未被解離開；低于5.85，表明加入的解離液多了，解離過度。這兩種情況下，解離效果均不佳。第六十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日在沉淀中加約二分之一血漿體積的滅菌蒸餾水解離所得到的絡(luò)合物沉淀，將解離混合物溶液用0.5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至，加NaCl至0.15%～0.2%，充分?jǐn)嚢琛?0℃過夜解離（8-10h）。第六十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日在生產(chǎn)過程中常發(fā)現(xiàn)，由于解離效果差，從而不能使生產(chǎn)過程順利進(jìn)行。方法：（1）加入活性炭法：在解離效果略差，即能夠較順利地離心，得到部分或全部稍混濁的濾液，但不能正常進(jìn)行壓濾時(shí)，加入適當(dāng)?shù)幕钚蕴坑跒V液中，攪攔均勻后，立即離心，由于活性炭吸附溶液中粘稠物質(zhì)，形成大顆粒，經(jīng)離心可以除去雜質(zhì)，起到澄清的作用。第六十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）加入利凡諾法：在解離時(shí)，在由加入的鹽酸或（和）鹽過多而造成解離物的濾液混濁的情況下，變性前后，向解離物中加入適量的利凡諾溶液均會(huì)起到澄清的作用，而回收率卻不會(huì)降低太多。變性前加利凡諾溶液比變性后加利凡諾溶液的效果顯著。由于前者在變性過程中反應(yīng)溫度升高了，反應(yīng)時(shí)間增加了。第六十五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）多次絡(luò)合法如果解離效果極差，用以上兩種方法處理都難以達(dá)到澄清的目的，那只有采取多次絡(luò)合法，即在盡量除去解離物中粘稠物質(zhì)后，將其pH值調(diào)至9.0~9.2，加入適量的5%利凡諾溶液，進(jìn)行重絡(luò)合，繼爾重解離，一般都會(huì)得到很理想結(jié)果。如果仍然出現(xiàn)解離不良的現(xiàn)象，重復(fù)以上處理過程，直到得到滿意的結(jié)果。這種方法使產(chǎn)品純度高，外觀變黃（棕），同時(shí)也使成本提高，回收率降低。第六十六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日③去雜蛋白：白蛋白具有生物活性，凡是使蛋白質(zhì)變性的溫度都會(huì)使白蛋白變性。65℃條件下變性1h，離心分離出上清液。④熱處理：在60±0.5℃條件下處理10h，滅活病毒。

⑤檢驗(yàn)方法：凍干品白色疏松物體。白蛋白含量占95%以上，水分<1%，水溶后pH為，硫酸銨殘量<0.01%，細(xì)菌學(xué)和熱原質(zhì)檢測(cè)合格。第六十七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日二、尿激酶（urokinase）的制備（1）天然尿激酶是由兩條肽鏈通過二硫鍵連接而成。是絲氨酸蛋白酶，絲氨酸、組氨酸是活性中心必需的氨基酸。該酶底物專一性很強(qiáng)，血纖維蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白質(zhì)底物，作用于Arg-Val鍵上，使纖溶酶原轉(zhuǎn)為纖溶酶。（2）尿激酶的pI為8-9。溶液狀態(tài)不穩(wěn)定。用于治療各種新血栓形成或血栓梗塞疾病。

第六十八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日一噸可制成90克粗品，治療各種新血栓形成或血栓梗塞疾病。

男性尿

沉淀10℃下，pH8.5上清尿液酸化pH5.0-5.5酸化尿吸附硅藻土，5℃硅藻土吸附物洗滌5℃，水硅藻土柱洗脫0.02%氨水，0.1mol/LNaCl洗脫液去熱源、色素DEAE-SephadexA50柱，pH8.0,（二乙氨乙基葡聚糖）流出液（活性部分）濃縮羧甲基纖維素（CMC柱，pH4.2)CMC柱洗脫（HAC-NaAC)NH3+NaCl,pH11.5-11.8洗脫液透析H2O,4℃透析液凍干成品（3）工藝流程（圖3-2）圖3-2尿激酶生產(chǎn)工藝路線第六十九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（4）工藝要點(diǎn)①收尿：男性尿，8h內(nèi)處理。調(diào)尿液pH6.5以下。②硅藻土吸附：加入1%的硅藻土，5℃下攪拌吸附1h。③洗脫：硅藻土吸附物用5℃冷水洗滌后裝柱，當(dāng)洗脫液由清變渾時(shí)開始收集。④除熱原、色素：收集液用飽和NaH2PO4，調(diào)pH8.0，加NaCl調(diào)電導(dǎo)至22M/Ω，過DEAE-SephadexA50層析柱，收集流出活性部分。第七十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日⑤CMC濃縮：流出液用1mol/LHAc調(diào)至pH4.2，用蒸餾水調(diào)電導(dǎo)至16-17M/Ω，通過CM-C層析柱。用10倍體積的pH4.2的HAC-NaAc緩沖液洗滌柱床。洗后用0.1%氨水0.1mol/LNaCl溶液洗脫尿激酶。收集活性組分，雜質(zhì)被吸附。⑥產(chǎn)品質(zhì)量：無色澄清液或白色凍干粉末。酶活力>15000IU/mg蛋白質(zhì)。第七十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日三、絨毛膜促性腺激素（HCG）的制備（1）HCG的性質(zhì)（characterofHCG）HCG是一種糖蛋白，由α、β兩亞基組成，易溶于水，pI為。HCG由胎盤滋養(yǎng)層合體細(xì)胞所分泌。婦女妊娠45-70天，尿中HCG含量可達(dá)。治療女性不育癥，神經(jīng)性皮炎。男性性功能過低癥和隱睪癥，子宮出血和習(xí)慣性流產(chǎn)。第七十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日孕婦尿[粗制]尿：苯甲酸：乙醇/1：0.075：5）用HCl調(diào)pH4-5HCG(粗品）提取NaACpH4.8提取液透析水，5℃以下透析內(nèi)液吸附（CMSepharoseCI-6B）羧甲基瓊脂糖凝膠吸附后交換劑洗滌Ⅰ，Ⅱ峰NaAC,pH4.8,pH5.9洗滌后交換劑洗脫NaAC,pH8.5洗脫液冷凍干燥

—30℃HCG精品

溶解蒸餾水，10℃以下HCG溶液透析pH6.8,5℃以下透析內(nèi)液吸附羥基磷灰石，pH6.8吸附物解吸0.5mmol/L,1.0mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS),pH6.8解吸液干燥—30℃HCG純品（2）HCG生產(chǎn)工藝路線第七十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）工藝要點(diǎn)①吸附粗品：HCl調(diào)孕婦尿至pH4-5，加苯甲酸—乙醇飽和液（孕婦尿：苯甲酸乙醇飽和液：乙醇=1:0.075:5）攪拌1h靜置2-3h，過濾，棄濾液，得吸附物。在攪拌下加入95%乙醇，至苯甲酸全部溶解有絮狀沉淀產(chǎn)生，靜置過夜，離心，沉淀用95%乙醇和丙酮洗滌，干燥得粗制品。第七十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日②提?。杭?0倍量的4℃1/15mol/L、pH4.8醋酸鹽緩沖液，攪拌4h，離心，取上清液。沉淀再提取2h。合并兩次提取液，棄去沉淀。③離子交換層析：CM-Sepharose柱用0.01mol/L的醋酸鹽緩沖液平衡后樣品上柱。依次用pH4.8、0.01mol/L的醋酸鹽緩沖液和pH5.9、0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌出兩個(gè)峰（雜質(zhì)）。再用pH8.5、0.2mol/L的醋酸鹽緩沖液洗脫，得到的第3峰即為HCG。第七十五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日④羥基磷灰石柱層析：柱用pH6.8、0.5mmol/L磷酸鹽緩沖液平衡。樣品用pH6.8、0.5mmol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行層析上柱。洗脫先用pH6.8、0.5mmol/L再用pH6.81.0mmol/L的磷酸鹽緩沖液。得到I、II活性峰。然后冷凍干燥。HCG純品的比活性為10,000-12,000IU/mg蛋白質(zhì)。

第七十六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日四、白細(xì)胞介素-2（IL-2）的制備

（1）性質(zhì)：由活化的淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的，糖蛋白有一個(gè)鏈內(nèi)二硫橋（58位，105位）。等電點(diǎn)為pH6.5。（2）工藝路線（圖3-4）

誘生白細(xì)胞培養(yǎng)液0.4mol/LNaCl,PBS,pH6.5UltrogelACA44柱，pH7.6圖3-4為IL-2生產(chǎn)工藝路線人血白細(xì)胞誘生雞瘟病毒，絲裂原培養(yǎng)液，37℃，CO2,孵育[滅活病毒]HCl,pH2.0-2.5；NaOH,pH7.2-7.4上清液硫酸胺分級(jí)（0.35飽和度）離心[去變性雜蛋白]上清液硫酸胺沉淀（0.85飽和度）離心沉淀除鹽10mmol/L磷酸鈉緩沖液，PBS透析，pH6.5透析內(nèi)液瓊脂糖Sepharose4B,pH6.5親和層析親和層析載體Ⅰ洗滌親和層析載體Ⅱ解吸1.0mol/LNaCl,PBS,pH6.5IL-2組分凝膠層析凝膠載體0.2mol/LTris-HCl,含0.1%PEG,2%正丁醇，0.5mol/L甘氨酸，pH7.6洗脫IL-2[去變性雜蛋白]第七十七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）工藝要點(diǎn)

①誘生：刺激人外周血白細(xì)胞，37℃培養(yǎng)。②病毒滅活和固液分離：HCl調(diào)節(jié)pH再用NaOH調(diào),除去變性雜蛋白。③分級(jí)沉淀：加飽和硫酸銨溶液至0.35飽和度，4℃靜置24h，離心，收集沉淀。④除鹽：除沉淀溶于pH6.5、10mmol/L的磷酸鈉緩沖液（PBS）中（內(nèi)含2%（g/100mL）正丁醇,0.15mol/LNaCl）。用pH6.5的10mmol/LPBS透析24h（更換5次透析外液）。第七十八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日⑤藍(lán)色瓊脂糖層析：透析內(nèi)液通過Sepharose4B層析柱，用200mL平衡柱緩沖液洗去不吸附蛋白，再用含0.4mol/LNaCl的PBS液洗滌親和柱，最后用含1.0mol/LNaCl的PBS液解吸IL-2活性組分。⑥凝膠層析：活性組分經(jīng)超濾濃縮，上UltrogelACA44層析柱，柱用含0.1%聚乙二醇MW6000的2%正丁醇和pH7.6的0.5mol/L甘氨酸的0.2mol/LTris-HCl洗脫，得IL-2。

第七十九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日五、人體來源藥物的研究前景（prospect）人體來源的原料雖只限于血液、胎盤、尿液、毛發(fā)等有限幾種，但利用前景很廣闊。1、可進(jìn)一步開發(fā)新產(chǎn)品

exploitationofnewproductio）（1）血液的利用，血漿蛋白可分離為I-V5個(gè)成分。目前僅利用了其中的I（纖維蛋白原）、II（免疫球蛋白）和V（白蛋白）3個(gè)組分，III和IV，目前基本未加以利用。第八十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日組分III中含有IgA、IgM、凝血因子II、VII、IX、X、蛋白C、纖溶酶原、α2-巨球蛋白、β-微球蛋白、補(bǔ)體成分C3、C4、C5和C8，以及許多其他α和β球蛋白。組分IV中含有抗凝血酶III、αI抗胰蛋白酶、銅藍(lán)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白、補(bǔ)體Ci脂酶抑制物、前白蛋白等。主要問題是含量較低，提純難度大，產(chǎn)量小而不被重視。

第八十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）對(duì)其他原料的利用，胎盤是重要的人類原料之一，較好利用的只有胎盤球蛋白、胎盤白蛋白等少數(shù)品種。尿液利用也只限于尿激酶、激肽釋放酶、CSF等少數(shù)品種。第八十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2、用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)人類活性物質(zhì)（productionforHumanactivesubstance）基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等技術(shù)在生物藥物研制方面發(fā)揮了重要作用。例如基因重組的組織型纖溶酶原激活劑（已于1987年獲準(zhǔn)正式生產(chǎn)，凝血因子VII、IX和白蛋白等亦在研究中?；蚬こ谈蓴_素、白細(xì)胞介素、紅細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EPO）等研究亦取得成功，并投放市場(chǎng)。

第八十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)動(dòng)物來源生物制品的制備一、動(dòng)物來源藥物的特點(diǎn)我國(guó)應(yīng)用動(dòng)物藥物歷史悠久，4000年前就已經(jīng)使用40多種動(dòng)物藥。本草綱目中收集了440種，中國(guó)藥用動(dòng)物志收載了1500多種。到20世紀(jì)50年代開始，我國(guó)陸續(xù)開展了動(dòng)物藥物的研究與生產(chǎn)，其中取得的重大成果是關(guān)于胰島素的研究，1965年得到結(jié)晶牛胰島素。生物藥物在治療和預(yù)防疾病方面有其他藥物不可取代的特點(diǎn)，所以越來越引起人們的注意。第八十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日動(dòng)物來源藥物的特點(diǎn)：原料來源豐富，牛、豬、羊的器官、組織、腺體、血液、毛角等都可做為原料，來源豐富且健康、新鮮，品種繁多，可以制備出人體所需要的各種活性物質(zhì)；要重視安全性，動(dòng)物與人體種屬差異大，活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有一定的差異，蛋白質(zhì)是抗原，不同來源的蛋白質(zhì)注射于人體內(nèi)要產(chǎn)生抗原反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)有生命危險(xiǎn)。第八十五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日二、動(dòng)物來源藥物的種類與用途1、動(dòng)物多肽與蛋白質(zhì)類藥物（1）、動(dòng)物多肽藥物的重要性與種類1）重要性：腦垂體所分泌的多肽激素，藥效顯著，且毒副作用小，細(xì)胞因子已有近百種，通過對(duì)這些活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的研究，有助于我們?cè)O(shè)計(jì)和研制新型藥物。第八十六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2）種類：多肽類激素：垂體多肽激素（促腎上腺皮質(zhì)激素、促黑激素、脂肪水解激素、催產(chǎn)素、加壓素）；下丘腦激素（促甲狀腺激素釋放激素、生長(zhǎng)素抑制激素、促性腺激素釋放激素）；甲狀腺激素（甲狀旁腺素、降鈣素）；胰島激素（胰高血糖素、胰解痙多肽）；胃腸道激素（胃泌素、膽囊收縮素-促胰酶素、腸泌素、腸血管活性肽、抑胃肽、緩激肽、P物質(zhì)）；胸腺激素（胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子）。多肽類細(xì)胞因子：腦氨肽、蛇毒、胎盤提取物、脾水解物、肝水解物、心臟激素、轉(zhuǎn)移因子、抗癌肽等。第八十七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）、動(dòng)物蛋白類藥物蛋白質(zhì)激素（生長(zhǎng)素、催乳激素、促甲狀腺素、促黃體生成激素、促卵泡激素）；血漿蛋白質(zhì)，動(dòng)物血漿制品不能用于人類；蛋白質(zhì)類細(xì)胞因子；粘蛋白（胃膜素、硫酸糖肽、內(nèi)在因子、血型物質(zhì)）；膠原蛋白（明膠、阿膠、氧化聚合明膠）；其他：硫酸魚精蛋白、胰蛋白酶抑制劑。第八十八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2、動(dòng)物酶與輔酶類藥物種類：促消化酶類（胃酶可口服，蛋白酶，胰酶）；消炎酶類（溶菌酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等可提高毛細(xì)血管通透性，消退浮腫）；治療心血管疾病（纖溶酶、尿激酶、凝血酶）；抗腫瘤的酶（天冬氨酰酶、谷氨酰胺酶、半胱氨酸酶、組氨酸酶）；與氧化還原電子傳遞有關(guān)的治療酶（細(xì)胞色素c、超氧化物歧化酶、過氧化物酶）；其他藥用酶（有機(jī)磷解毒酶、青霉素酶）。動(dòng)物輔酶類藥物：大多數(shù)屬于核苷酸類藥物。第八十九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日3、動(dòng)物核酸類藥物（1）、組成與作用

核酸由核苷酸、核苷酸、核苷、堿基及其衍生物?？捎迷诎┌Y、肝炎、抗放射性、心臟病等方面的治療。（2）、主要種類和用途DNA：能改善機(jī)體虛弱疲勞、與細(xì)胞毒藥物合用可提高細(xì)胞毒藥物對(duì)癌細(xì)胞的選擇性作用，與紅霉素合用，可降低毒性、提高療效；RNA：口服可用于精神遲緩、記憶衰退、動(dòng)脈硬化性癡呆、靜注用于刺激造血和促進(jìn)白細(xì)胞生成、治療慢性肝炎、肝硬化和初期癌癥；輔酶A用于動(dòng)脈硬化、白細(xì)胞、血小板減少，肝、腎病等；ATP用于心力衰竭、心肌炎、心肌梗死、腦動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈硬化、急性脊髓灰質(zhì)炎、肌肉萎縮、慢性肝炎等。

第九十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日4、動(dòng)物糖類藥物單糖、寡糖、多糖。多糖以粘多糖為主，是一類胞外生物大分子物質(zhì)，是動(dòng)物體內(nèi)蛋白多糖分子中的糖鏈部分，可抗凝血、降血脂、抗病毒、抗腫瘤和抗放射性。第九十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（1）、粘多糖的種類與分布粘多糖（中性和酸性）、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等。粘多糖主要分布在動(dòng)物骨、軟骨、皮、角、血管、腸、滑膜液、腦、角膜、肺、肝、心、尿等原料中。甲殼質(zhì)：蝦、蟹、昆蟲等甲殼動(dòng)物外殼，高等植物細(xì)胞壁，人造皮膚、血管、手術(shù)線；消炎、降低膽固醇和血脂。肝素：腸黏膜、肺、肝、心、腎等部位，抗凝血藥物，外科手術(shù)后防止形成血栓，可預(yù)防血栓形成。第九十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）、制備方法原料處理，提取有效成分，去除非粘多糖，脫色，脫蛋白，純化，用乙醇分級(jí)沉淀，季銨鹽絡(luò)合沉淀，離子交換柱層析，分子篩分離，親和層析等。第九十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日5、動(dòng)物脂類藥物溶于氯仿、苯、石油醚等非極性溶劑，而不溶于或微溶于水中，可分為脂肪、類脂和衍生物，又可分為復(fù)合脂和簡(jiǎn)單脂。（1）、脂類藥物的種類與分布脂肪酸及其衍生物、磷脂類、膽酸類、卟啉和衍生物。主要為脂肪酸和磷脂，分布在腦、脊髓等神經(jīng)組織中，脂肪組織、趕等含量也較豐富，膽酸分布在膽汁中，卟啉以血液為主。脂類藥物的一個(gè)特點(diǎn)是，從生物組織中制得的藥物再經(jīng)過分子改造可以得到更高療效的產(chǎn)品。腦磷脂可止血、防動(dòng)脈硬化以及神經(jīng)衰弱；卵磷脂防治動(dòng)脈硬化、神經(jīng)衰弱和肝病。第九十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）、制備方法提取法：將原料粉碎后用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑進(jìn)行直接提取，再經(jīng)純化即得到。水解法：將目的產(chǎn)物與其他不需要的成分進(jìn)行水解分離，提取純化；生物轉(zhuǎn)化法：利用酶、微生物發(fā)酵、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)藥物；化學(xué)合成或半合成。6、動(dòng)物細(xì)胞因子

動(dòng)物來源的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。

第九十五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日三、動(dòng)物來源生物制品制備的實(shí)例1、胰島素的制備

（productionofinsulin）（1）胰島素的性質(zhì)：，由A鏈、B鏈通過兩個(gè)二硫鍵連接；A鏈含21個(gè)氨基酸，B鏈含30個(gè)氨基酸；是所有蛋白質(zhì)中研究得最多，也是研究得最清楚的蛋白。

第九十六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）工藝路線豬胰臟提取乙醇，草酸，10-15℃提取液堿化氨水，pH8-8.4堿化液酸化硫酸，pH3.6-3.8,5℃酸化液濃縮30℃以下，減壓濃縮液去脂速熱速冷去脂溶液鹽析NaCl,pH2-2.5鹽析物水、丙酮、氨水（pH4.2~4.3）除酸性蛋白濾液鋅沉淀氨水，Zn（Ac）2，pH6.0沉淀除堿性蛋白，結(jié)晶Zn（Ac）2，丙酮、氨水，pH8.0，5℃以下，檸檬酸調(diào)pH6.0結(jié)晶洗滌，干燥水、丙酮、乙醚胰島素精品圖2—1豬胰島素生產(chǎn)的工藝路線

第九十七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（3）工藝要點(diǎn)①提?。航g碎胰臟，加倍的86%-88%乙醇和5%的草酸，提取3h。②濃縮：30℃減壓濃縮至比重為為止。③除酸性蛋白：加入7倍量的蒸餾水溶解，再加3倍量冷丙酮，用氨水調(diào)pH至，補(bǔ)加丙酮，離心去除酸性質(zhì)白沉淀。④鋅沉淀：用氨水調(diào)pH為，加入3.6%醋酸鋅溶液（20%濃度），再用氨水調(diào)pH至6.0，4℃放置過夜；收集沉淀。第九十八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日⑤除堿性蛋白、結(jié)晶：每克加冰冷的2%檸檬酸溶液50mL，6.5%醋酸鋅溶液2mL，丙酮16mL，用冰水稀釋至100mL，使充分溶解；冷至5℃以下，用氨水調(diào)至pH至8.0，過濾；濾液用10%檸檬酸溶液調(diào)pH6.0，補(bǔ)加丙酮，慢速攪拌3-5h使結(jié)晶析出；再轉(zhuǎn)入5℃左右放置3-4d，使結(jié)晶完全；收集結(jié)晶，用丙酮、乙醚脫水后，真空干燥，即得結(jié)晶胰島素。第九十九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2、超氧化物歧化酶（SOD）的制備超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）與機(jī)體抗衰老、腫瘤發(fā)生、自身免疫疾病和輻射防護(hù)等有關(guān)。用于炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及放射治療后的炎癥等。SOD存在于動(dòng)物、植物、微生物中，有Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等。牛紅細(xì)胞SOD為Cu-Zn-SOD，由兩個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基含1個(gè)Cu和1個(gè)Zn。在時(shí)穩(wěn)定。它催化超氧負(fù)離子歧化為H2O2。

第一百頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日新鮮豬血去血漿，離心紅細(xì)胞0.9%NaCl,反復(fù)洗滌3次收集工藝路線浮洗凈紅細(xì)胞溶血血去離子水，5℃,30min溶血物去血紅蛋白乙醇，氯仿,15min上清液沉淀丙酮，0℃沉淀物去離子水55-65℃，10-15min黃綠色澄清液沉去不溶蛋白，透析丙酮，去離子水，0℃，6-8h透析液吸附、吸脫、超濾、濃縮、干燥DEAE-SephadexA50,磷酸緩沖液（K3PO4），pH7.6SOD成品圖3-6豬血SOD生產(chǎn)工藝路線第一百零一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）工藝要點(diǎn)①收集：離心去黃色血漿，紅細(xì)胞用0.9%NaCI溶液離心浮洗3次。②溶血、去血紅蛋白：加去離子水，5℃下攪拌30min后加入乙醇和氯仿，攪拌15min；離心去血紅蛋白，收集上清液。第一百零二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日③沉淀、熱處理：0℃下將上清液加入倍體積的丙酮，產(chǎn)生絮狀沉淀；離心去上清液，得沉淀物；沉淀物加適量蒸餾水溶解，上清在55-65℃下熱處理10-15min，除去熱變性蛋白，收集黃綠色澄清液。④沉淀、去不溶蛋白：澄清液在0℃下加入適量丙酮，使其產(chǎn)生大量絮狀沉淀；離心去上清液；沉淀用去離子水溶解，除不溶性蛋白；上清液置透析袋中得透析液。第一百零三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日⑤吸附、洗脫、超濾、凍干：透析液加到用磷酸緩沖液平衡好的DEAE-SephadexA50柱上吸附，用磷酸鉀緩沖液梯度洗脫，收集SOD活力洗脫液，超濾濃縮后，冷凍干燥得SOD成品。⑥電泳鑒定條件：0.5%瓊脂糖凝膠平板電泳法，用聚丙稀酰胺凝膠電泳方法鑒定更靈敏。第一百零四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日3、用肝臟生產(chǎn)核糖核酸（RNA）

用肝臟生產(chǎn)的動(dòng)物RNA具有其他生物來源RNA所不具有的藥物功能。提純難度較大。（1）工藝路線圖(圖3-7肝RNA生產(chǎn)工藝路線)勻漿健康豬/牛肝0.1mol/LNaCl,0.05mol/L檸檬酸鈉，PVS(聚乙烯硫酸脂），Triton×100(表面化性劑）清液提取三乙醇胺，SDS,EDTA,苯酚，震蕩，離心清液除蛋白氯仿，震蕩，離心，反復(fù)三次清液沉淀醋酸鉀，－20℃乙醇，0℃，1h離心沉淀除糖原0.001mol/LEDTA,NaAc,K2HPO4,乙二醇甲醚，0℃離心清液精制制0.2mol/LNaAc,CTAB,0℃,離心0.5h沉淀洗滌0.1mol/LNaAc,EDTA,70%乙醇，反復(fù)洗5次，離心沉淀溶解0.001mol/L,EDTA,0.14mol/LNaAc,溶解，過濾除菌無菌RNA溶液制劑裝灌，凍干RNA成品第一百零五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）工藝要點(diǎn)①勻漿：肝用生理鹽水洗凈，切成小塊，加入1-2倍量檸檬酸鈉、聚乙烯硫酸脂（PVS）TritonX100（pH7.0）溶液，用組織搗碎機(jī)搗成勻漿，離心。②提?。杭尤氲润w積三乙醇胺、十二烷基磺酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA，pH9.0）溶液，攪拌均勻后，加等體積苯酚（含0.2%8-羥基喹啉）及等體積氯仿；室溫振蕩30min，離心20min。第一百零六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日③除蛋白：離心清液中加入等量氯仿振蕩，反復(fù)2-3次，至中間界面無明顯蛋白層為止。④乙醇沉淀：清液中加入1/10體積KAC和兩倍體積－20℃乙醇；0℃放置1h，離心得白色沉淀。⑤除糖原：將沉淀溶于含EDTA-0.01mol/LNaAc溶液中，加入等體積K2HPO4,攪拌下再加入等體積乙二醇甲醚，0℃放0.5h，離心得清液。第一百零七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日⑥絡(luò)合：清液在0℃下攪拌加入等體積0.2mol/LNaAc溶液和1/4體積1%十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）；0℃放0.5h；離心取沉淀。⑦洗滌：沉淀用NaAc，70%乙醇溶液反復(fù)洗滌5次，至無泡沫為止。第一百零八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日

先確定與某種疾病有關(guān)的具有預(yù)防或治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白合成的基因分離或進(jìn)行人工合成，利用重組DNA技術(shù)將該基因加以改造，再將改造后的基因?qū)肟梢圆粩喾敝车氖荏w細(xì)胞，從而大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)。通過這種方法生產(chǎn)的新型生物制品稱為基因工程生物制品。上游技術(shù)：工程菌的構(gòu)建下游技術(shù)：目的基因產(chǎn)物的分離純化第四節(jié)基因工程生物制品的制備第一百零九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日基因工程菌的構(gòu)建的技術(shù)路線目的DNA片段和載體的連接目的DNA片段和載體的制備重組子篩選連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的純化表達(dá)的目的載體的選擇引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵什么是克隆？一、上游技術(shù)：工程菌的構(gòu)建第一百一十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日(一）、目的基因的分離制備與鑒定

（1）目的基因所處染色體的確定（2）目的基因的獲取

目的基因可以是染色體DNA、cDNA或人工合成的DNA，目的基因不同，獲取方法也不同。A、限制性內(nèi)切酶切取目的基因B、用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA（又稱cDNA法）C、化學(xué)合成目的基因第一百一十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日

用來分離原核基因的方法。獲取的基因是染色體DNA。破碎細(xì)胞→分離染色體→限制性內(nèi)切酶作用→目的基因A、限制性內(nèi)切酶切取目的基因

用來分離真核基因的方法。以目的基因的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（cDAN）。B、用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA（又稱cDNA法）第一百一十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日C、化學(xué)合成目的基因

利用磷酸二酯法、磷酸三酯法等方法合成?；瘜W(xué)合成的先決條件是必須要知道DNA的堿基順序。此法一般只能合成較短的多肽激素基因。世界上第一個(gè)人工化學(xué)合成并表達(dá)的基因是生長(zhǎng)素釋放抑制素基因。第一百一十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日

在獲取目的基因后，應(yīng)首先考慮所得基因是否是所需要的目的基因。凝膠電泳及酶切圖譜測(cè)定核酸雜交DNA序列測(cè)定（3）目的基因的鑒定第一百一十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日目的基因的獲取——用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA（又稱cDNA法）1根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確定需要擴(kuò)增的DNA序列，并知道其CDS區(qū)序列（編碼結(jié)構(gòu)基因區(qū),即從起始密碼子區(qū)至終止密碼子區(qū)）ncbi網(wǎng)站查詢第一百一十五頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日第一百一十六頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日第一百一十七頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對(duì)象。

CDS1…624

第一百一十八頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2.選擇所需的載體,確定合適的酶切位點(diǎn)——

原核表達(dá)載體or真核表達(dá)載體所選擇的酶切位點(diǎn)盡量為多克隆位點(diǎn)的中間酶切位點(diǎn)，這樣連接以后再構(gòu)建新的質(zhì)粒時(shí)選擇酶的空間更大些。同時(shí)，保證所需擴(kuò)增的DNA序列中（目的基因）無該酶切位點(diǎn)（generuner分析）。第一百一十九頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2.選擇所需的載體,確定合適的酶切位點(diǎn)。第一百二十頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日2.選擇所需的載體,確定合適的酶切位點(diǎn)ECORI酶切位點(diǎn)：GAATTCBamHI酶切位點(diǎn)：GGATCC第一百二十一頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日3.設(shè)計(jì)引物（1）在下載的目的基因序列里分別找到序列上的起始密碼子和終止密碼子。

第一百二十二頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日第一百二十三頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日由于DNA只能從5’端-到3’端復(fù)制，所以引物是5’-3’，只能和DNA的兩條鏈（有義鏈和反義鏈）的5’端配對(duì)，如下圖所示：F序列和mRNA的5’端相同，和反義鏈的3’端互補(bǔ)。R序列和mRNA的3’端互補(bǔ)，和反義鏈的5’端相同。第一百二十四頁(yè)，共一百四十二頁(yè)，2022年，8月28日（2）酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿基限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定的DNA序列，除此