激光共聚焦顯微鏡原理

激光掃描共聚焦顯微鏡LSCM

Laserscanningconfocalmicroscope以激光作為光源，激光器發(fā)出的激光通過(guò)照明針孔形成點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)透鏡、分光鏡形成平行光后，再通過(guò)物鏡聚焦在樣品上，并對(duì)樣品內(nèi)聚焦平面上的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。樣品被激光激發(fā)后的出射光波長(zhǎng)比入射光長(zhǎng)，可通過(guò)分光鏡，經(jīng)過(guò)透鏡再次聚焦，到達(dá)探測(cè)針孔處，被后續(xù)的光電倍增管檢測(cè)到，并在顯示器上成像，得到所需的熒光圖像，而非聚焦光線被探測(cè)針孔光欄阻擋，不能通過(guò)探測(cè)針孔，因而不能在顯示器上顯出熒光信號(hào)。這種雙共軛成像方式稱為共聚焦。因采用激光作為光源，故稱之為“激光掃描共聚焦顯微鏡”。第一頁(yè)，共47頁(yè)。發(fā)展歷史1957年，MalwinMinsky在其專利中首次闡明了激光共聚焦顯微鏡技術(shù)的基本工作原理，1967年，Egger第一次成功能共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個(gè)光學(xué)橫斷面，1970年，Sheppard和Wilson推出第一臺(tái)單光束共聚集激光掃描顯微鏡1987年，White和Amos在Nature雜志發(fā)表了“Confocalmicroscopycomeofage”,標(biāo)志著LSCM已成為科學(xué)研究的重要工具。第二頁(yè)，共47頁(yè)。普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡圖像的差別第三頁(yè)，共47頁(yè)。第四頁(yè)，共47頁(yè)。激光共聚焦顯微鏡的基本原理利用放置在光源后的照明針孔(P1)和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔(P2)實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)；激光經(jīng)過(guò)照明針孔形成點(diǎn)光源，由物鏡聚焦在樣品焦面的某個(gè)點(diǎn)上，只有該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光線被探測(cè)器阻擋，不能到達(dá)PMT探測(cè)器，從而提高了成像效果。照明針孔和探測(cè)針孔共焦，共焦點(diǎn)為被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面。第五頁(yè)，共47頁(yè)。LSCM的基本組成激光發(fā)射器顯微鏡部分掃描裝置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)第六頁(yè)，共47頁(yè)?；窘Y(jié)構(gòu)——激光光源LASER“Lightamplificationbystimulatedemissionofradiation”受激發(fā)射的輻射光放大。第七頁(yè)，共47頁(yè)。激光光源的產(chǎn)生受激吸收：處于較低能級(jí)的粒子在受到外界的激發(fā)（即與其他的粒子發(fā)生了有能量交換的相互作用，如與光子發(fā)生非彈性碰撞），吸收了能量時(shí)，躍遷到與此能量相對(duì)應(yīng)的較高能級(jí)。自發(fā)輻射：粒子受到激發(fā)而進(jìn)入的激發(fā)態(tài)，不是粒子的穩(wěn)定狀態(tài)，自發(fā)地從高能級(jí)激發(fā)態(tài)（E2）向低能級(jí)（E1）躍遷，同時(shí)產(chǎn)生光輻射的過(guò)程。眾多原子以自發(fā)輻射發(fā)出的光，不具有相位、偏振態(tài)、傳播方向上的一致，是物理上所說(shuō)的非相干光。受激輻射：除自發(fā)輻射外，處于高能級(jí)E2上的粒子還可以另一方式躍遷到較低能級(jí)。當(dāng)一個(gè)外來(lái)光子帶來(lái)的能量正好對(duì)應(yīng)能級(jí)差時(shí)（E2-E1），也會(huì)引發(fā)粒子以一定的概率，迅速地從能級(jí)E2躍遷到能級(jí)E1，同時(shí)輻射一個(gè)與外來(lái)光子頻率、相位、偏振態(tài)以及傳播方向都相同的光子的過(guò)程。受激輻射第八頁(yè)，共47頁(yè)。激光光源的產(chǎn)生單色性好方向性好亮度高相干和偏振性好激光的特征激光就是受激幅射產(chǎn)生的，激光束里處于相同狀態(tài)的光子是相干的，偏振的，并沿同一方向傳播的。激光器：405，440，635，488，559第九頁(yè)，共47頁(yè)。掃描器系統(tǒng)針孔：confocal一個(gè)重要組成部分，它是放在檢測(cè)器及激光光源前面的一個(gè)小孔，作用是控制光切片的厚度，對(duì)實(shí)現(xiàn)斷層掃描成像，排除焦面雜散光起關(guān)鍵作用分光鏡：作用是按照波長(zhǎng)來(lái)改變光線的傳播方向。發(fā)射熒光分色鏡：作用是選擇出一定的波長(zhǎng)范圍的光進(jìn)行檢測(cè)，不同型號(hào)的儀器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主要由濾光片、棱鏡和光柵三種類型。檢測(cè)器：采用高靈敏度的光電倍增管，其檢測(cè)的范圍和靈敏度可根據(jù)強(qiáng)度進(jìn)行連續(xù)調(diào)節(jié)。第十頁(yè)，共47頁(yè)。熒光顯微鏡系統(tǒng)類型：正置，倒置光路：光源：汞燈、氙燈，觀察分辨樣品中產(chǎn)生熒光物質(zhì)的成分與位置。

源發(fā)濾光片：選擇適合熒光物質(zhì)激發(fā)波波長(zhǎng)的范圍

雙色分光鏡：初步分開激發(fā)和發(fā)射光組件、

阻濾片：獲得更純的發(fā)射熒光

物鏡：激發(fā)和發(fā)射都由同一物鏡實(shí)現(xiàn)。

目鏡：10×用于LSCM的熒光顯微鏡：側(cè)面有掃描器接口，裝有微量步進(jìn)馬達(dá)，有防振裝置，有光路轉(zhuǎn)換裝置，配高數(shù)值孔徑的物鏡。第十一頁(yè)，共47頁(yè)。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應(yīng)用軟件第十二頁(yè)，共47頁(yè)?；竟δ芏喾N圖像掃描方式2D:xy，xz，xt3D：XYZ，Xyt4D：XYZt光譜掃描多色熒光同時(shí)檢測(cè)：圖像分析與定量處理：3D重建，立體重建，斷面輪廓分析。圖像分析：特定區(qū)域的強(qiáng)度、周長(zhǎng)的測(cè)量，以及延時(shí)觀察分析t等。熒光光譜拆分第十三頁(yè)，共47頁(yè)。組織和細(xì)胞中的熒光來(lái)源自發(fā)熒光：指組織細(xì)胞不經(jīng)過(guò)任何熒光染色便能在短波長(zhǎng)光的激發(fā)下發(fā)射出的熒光，GFP就具有自發(fā)熒光，是標(biāo)記靶蛋白的特異性熒光探針。熒光染色：很多熒光染料與組織細(xì)胞作用，能夠在光的作用發(fā)出特征波長(zhǎng)的熒光，借以觀察組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和功能。有些可做活體染色。免疫熒光：熒光抗體法產(chǎn)生熒光。外源性熒光物質(zhì)進(jìn)入組織內(nèi)產(chǎn)生的熒光。某些藥物誘發(fā)熒光：生物胺類能與某些醛類物質(zhì)在一定條件下縮合而發(fā)生熒光。酶致熒光：某些酶的反應(yīng)能夠發(fā)射熒光。LSCM主要用于測(cè)定具有熒光的樣品，因此對(duì)本身沒有特征熒光的生物樣品，就需要用熒光標(biāo)記的方法使樣品待測(cè)物質(zhì)具有熒光，然后再進(jìn)行檢測(cè)。第十四頁(yè)，共47頁(yè)。熒光探針熒光標(biāo)記與熒光探針：采用一定的標(biāo)記物，使樣品待測(cè)物質(zhì)具有特定的熒光特征，這種標(biāo)記物被稱為熒光探針。這種組樣品賦予特征熒光的操作過(guò)程稱為熒光標(biāo)記。熒光探針的種類：蛋白質(zhì)、單糖和多糖探針，細(xì)胞器探針、核酸探針、細(xì)胞活性探針、膜結(jié)合受體探針等。第十五頁(yè)，共47頁(yè)。如何選擇探針根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定需要檢定的指標(biāo)確定可供選擇的熒光探針的范圍：根據(jù)需要檢測(cè)的指標(biāo)，選擇應(yīng)成熟的探針或標(biāo)記方法。可通過(guò)查找文獻(xiàn)和試劑公司產(chǎn)品目錄確定可以標(biāo)記待測(cè)物的熒光探針的種類或范圍?？紤]熒光探針的特性：熒光探針與樣品的反應(yīng)特性（與待測(cè)分子或離子反應(yīng)的選擇性或?qū)Ｒ恍缘龋?，熒光探針的靈敏度和熒光強(qiáng)度，熒光探針標(biāo)記后樣品的光譜特征（需要在儀器的檢測(cè)范圍內(nèi)），熒光的穩(wěn)定性，樣品中多重?zé)晒獾南嗷ビ绊懀ū苊夤庾V交叉）。第十六頁(yè)，共47頁(yè)。熒光樣品的制備要求熒光標(biāo)記反應(yīng)特異性強(qiáng)，熒光信號(hào)定位準(zhǔn)確保持樣品應(yīng)有的形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性熒光信號(hào)響應(yīng)百準(zhǔn)確靈敏，具有可重復(fù)性熒光強(qiáng)度適度熒光穩(wěn)定性好。樣品的熒光分布均勻兩種或兩種以上的熒光信號(hào)之間熒光光譜交叉可以得到消除。圖象背景干凈，干擾雜質(zhì)少。第十七頁(yè)，共47頁(yè)。熒光樣品的制備過(guò)程樣品的預(yù)處理組織切片樣品的處理：活組織切片，無(wú)需固定，可觀察和測(cè)定活性狀態(tài)下的一些生理指標(biāo)，缺點(diǎn)是保存條件高，時(shí)間短，切片厚。冰凍切片：熒光背景低，引入雜質(zhì)干擾少。固定組織切片：易操作，樣品易保存，但易引入干擾熒光。細(xì)胞樣本制備：雜細(xì)胞的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要注意鑒別細(xì)胞的種類和純度。細(xì)胞密度約在20-80%，活的細(xì)胞需用專用培養(yǎng)皿。第十八頁(yè)，共47頁(yè)。用熒光探針標(biāo)記樣品標(biāo)記方式：直接標(biāo)記，生物樣品與熒光探針直接作用，使樣品具有熒光。間接標(biāo)記法：熒光探針將某些特定分子標(biāo)記，這些特定分子再與細(xì)胞作用，使樣品具有熒光，如免疫熒光法，熒光標(biāo)記的藥物。顯微注射法：利用顯微注射向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入熒光探針，此法得到的熒光細(xì)胞少，適合監(jiān)測(cè)少量細(xì)胞。膜通透法：利用透膜劑，低滲培養(yǎng)液短期刺激增強(qiáng)探針跨膜能力，從而使探針進(jìn)入細(xì)胞中。確定熒光探針標(biāo)記樣品的條件：標(biāo)記探針的濃度，反應(yīng)溫度，時(shí)間等。第十九頁(yè)，共47頁(yè)。熒光探針標(biāo)記的注意事項(xiàng)熒光強(qiáng)度過(guò)高：看不清細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，不利于形態(tài)觀察，可降低探針濃度，減少反應(yīng)時(shí)間。熒光強(qiáng)度弱：熒光探針濃度過(guò)低，標(biāo)記條件不當(dāng)，探針溶解不充分，探針選擇錯(cuò)誤等。在操作過(guò)程中，避免對(duì)樣品造成損傷防止影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果熒光標(biāo)記要避光進(jìn)行。防止非特異性標(biāo)記，設(shè)立正確的對(duì)照組。熒光標(biāo)記后要盡快上機(jī)采集圖像。第二十頁(yè)，共47頁(yè)。LSCM的優(yōu)越性動(dòng)態(tài)連續(xù)掃描及三維圖像重組LSCM可以對(duì)對(duì)活細(xì)胞和組織或細(xì)胞切片樣品的不同層面進(jìn)行連續(xù)逐層掃描,來(lái)獲得各個(gè)層面的圖像，即所謂的“無(wú)損傷的光學(xué)切片”。激光掃描共聚焦顯微鏡掃描的每個(gè)層面之間的間距可以達(dá)到0.1um甚至更小。獲得的圖像通過(guò)計(jì)算機(jī)重組，可獲得精細(xì)的細(xì)胞骨架、染色體、細(xì)胞器和細(xì)胞膜系統(tǒng)的三維圖像。與普通光學(xué)顯微鏡獲得的圖像相比，LSCM所得到的重組三維圖像清晰度高、立體感強(qiáng),可通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件對(duì)細(xì)胞內(nèi)所研究的結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種測(cè)量，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的空間結(jié)構(gòu)和某些物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位方面的研究中有廣泛的應(yīng)用。第二十一頁(yè)，共47頁(yè)。同時(shí)多種物質(zhì)標(biāo)記利用LSCM，通過(guò)對(duì)膜上、胞漿內(nèi)多種物質(zhì)的熒光標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)在同一樣品上同時(shí)進(jìn)行多重物質(zhì)的觀察，比如檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率及動(dòng)態(tài)變化LSCM的優(yōu)越性第二十二頁(yè)，共47頁(yè)。瞬時(shí)分辨率高可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察活體組織標(biāo)本。LSCM的熒光檢測(cè)器可以毫秒級(jí)或微秒級(jí)的速度檢測(cè)熒光，即其時(shí)間分辨率極高，能對(duì)細(xì)胞內(nèi)的分子進(jìn)行功能性動(dòng)態(tài)觀察。LSCM技術(shù)可對(duì)活細(xì)胞在無(wú)損傷處理的情況下進(jìn)行觀察，跟蹤活細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)和生理過(guò)程隨時(shí)間變化的情況，得到實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的連續(xù)圖像。LSCM的優(yōu)越性第二十三頁(yè)，共47頁(yè)。高質(zhì)量數(shù)字圖像普通顯微鏡采用的自然光或燈光是一種場(chǎng)光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射光或散射光的干擾。LSCM以激光為光源，激光具有單色性強(qiáng)、方向性好、高亮度﹑相干性好等優(yōu)點(diǎn)，可以避免普通顯微鏡的缺點(diǎn)。一般常用的氣體激光器如氬(Ar)﹑氪(Kr)﹑氦(He)﹑氖(Ne)。由于LSCM的樣品焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像，這樣就避免了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡由于光散射造成的圖像信噪比降低，圖像清晰度和分辨率不高的缺點(diǎn)。而且，LSCM的圖像是以電信號(hào)的形式記錄下來(lái)的，可以采用各種模擬的和數(shù)字的電子技術(shù)進(jìn)行各種圖像處理。LSCM的優(yōu)越性第二十四頁(yè)，共47頁(yè)。LSCM在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用組織和細(xì)胞中分子或結(jié)構(gòu)的定位，定量分析：利用LSCM可以在細(xì)胞原位用特異的熒光標(biāo)記探針標(biāo)記出核酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、磷脂、多糖、受體等分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)其定位、定性和定量檢測(cè)，也可觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。如在細(xì)胞原位檢測(cè)核酸、原位檢測(cè)蛋白，抗體及其他分子，檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞器觀察及測(cè)定，檢測(cè)細(xì)胞整合、觀察細(xì)胞骨架，檢測(cè)細(xì)胞間縫隙連接通訊等多種應(yīng)用。標(biāo)本的制備方法主要有免疫熒光組織和細(xì)胞化學(xué)法、熒光蛋白標(biāo)記分子法，熒光細(xì)胞染料標(biāo)記法等。LSCM不但可對(duì)單標(biāo)記或雙標(biāo)記細(xì)胞及組織標(biāo)本的共聚焦熒光進(jìn)行定量分析，還可利用沿縱軸上移動(dòng)標(biāo)本進(jìn)行多個(gè)光學(xué)切片的疊加形成組織或細(xì)胞中熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)的總體圖像，以顯示熒光在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。第二十五頁(yè)，共47頁(yè)。原位檢測(cè)細(xì)胞中的核酸用于細(xì)胞核的定位及形態(tài)學(xué)觀察，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制及斷裂情況以及染色體定位觀察等。常的熒光探針：PI,EB，DAPI,AO,TOTO-1等第二十六頁(yè)，共47頁(yè)。熒光原位雜交（FISH）利用非放射性的熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。用標(biāo)記有熒光的DNA或RNA為探針，在原位測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA片斷，從而對(duì)染色體或基因異常的細(xì)胞、組織樣本進(jìn)行檢測(cè)和診斷。把熒光信號(hào)的高靈敏度、安全性、直觀性和原位雜交的高準(zhǔn)確性結(jié)合起來(lái)。第二十七頁(yè)，共47頁(yè)。原位檢測(cè)蛋白質(zhì)及其它分子常用熒光探針FITC,TRITC,Cy3，Cy5等免疫熒光標(biāo)記：將抗體標(biāo)記上熒光素，與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)的抗原結(jié)合后，通過(guò)檢測(cè)特征性的熒光，定位，定性、定量檢測(cè)樣品中的抗體。既有免疫反應(yīng)的特異性，又有熒光檢測(cè)的敏感性。第二十八頁(yè)，共47頁(yè)。熒光蛋白：跟蹤組織或細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及蛋白定位的標(biāo)記物GFP，綠色熒光蛋白，在任何活細(xì)胞中都表達(dá)，可作為活細(xì)胞的分子探針，GFP連接上目的基因后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可分析目的基因的生物學(xué)功能和特性。可對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察，可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化過(guò)程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá)，如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位，蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位，還可用于觀察分子的運(yùn)動(dòng)，及蛋白之間的相互作用。第二十九頁(yè)，共47頁(yè)。檢測(cè)細(xì)胞凋亡AnnexinV/PI雙染：AnnexinV是檢測(cè)凋亡早期細(xì)胞膜損傷的方法，凋亡早期細(xì)胞膜膜磷脂失去平衡，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）會(huì)從細(xì)胞內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，暴露于細(xì)胞外環(huán)境中，AnnexinV與磷脂具有高度親和力，可與轉(zhuǎn)移到膜外的PS結(jié)合。對(duì)于凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能透膜而使其染紅。兩者配合使用可以初步確定細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。第三十頁(yè)，共47頁(yè)。檢測(cè)細(xì)胞器標(biāo)記線粒體：Rodamin123，JC1,MitotrackerGreenFM,MitoTrackerRed標(biāo)記溶酶體：Lysotrackergreen，Lysotrackerblue,Lysotrackerred標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：DiOC6標(biāo)記高爾基體：NBDC6-ceramine第三十一頁(yè)，共47頁(yè)。斑馬魚腦部的血管與神經(jīng)元

綠色：神經(jīng)元

紅色：血管第三十二頁(yè)，共47頁(yè)。藍(lán)色細(xì)胞核，綠色微管第三十三頁(yè)，共47頁(yè)。第三十四頁(yè)，共47頁(yè)。LSCM在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用活體細(xì)胞和組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：利用相應(yīng)的特異性熒光標(biāo)記所要觀察的物質(zhì)后，用LSCM可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)單個(gè)細(xì)胞不同部位或不同組織區(qū)域接受刺激后的整個(gè)變化過(guò)程。如：實(shí)時(shí)定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca離子的變化，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)PH變化、檢測(cè)膜電位的變化、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生、檢測(cè)藥物等跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞過(guò)程及其定位、檢測(cè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、等多種對(duì)活細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。第三十五頁(yè)，共47頁(yè)。游離鈣離子變化熒光探針此類探針多為鈣離子螯合劑，可用常用的探針Fluo-3，其乙酰羥甲基酯(AM)形式為不帶電荷的親脂性化合物，易于滲透脂膜進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)，在胞內(nèi)被非特異酯酶水解，釋放出無(wú)熒光的游離酸形式的熒光探針?lè)肿?，探針?lè)肿右坏┡cCa離子結(jié)合便形成復(fù)合物，并產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，從而發(fā)揮其鈣探針的作用。一般來(lái)說(shuō)，電生理記錄裝置加攝像技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)離子量變化的速度相對(duì)較快，但其圖像本身的價(jià)值較低，而LSCM可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中鈣離子濃度動(dòng)態(tài)變化的圖像。常用探針Fluo-3-AM，Indo-1,Fura-2，CalciumGreen-1，CalciumGreen-2等。第三十六頁(yè)，共47頁(yè)。藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程及定位分布為檢測(cè)藥物分子、病毒、細(xì)菌等外界物質(zhì)能否跨膜進(jìn)入細(xì)胞（或組織），需要利用這些物質(zhì)特異性的自發(fā)熒光或?qū)ζ溥M(jìn)行熒光標(biāo)記。這些具有熒光的物質(zhì)與細(xì)胞（或組織）充分作用后，如果與細(xì)胞（或組織）結(jié)合，則細(xì)胞（或組織）中會(huì)有特征熒光出現(xiàn)，利用激光共聚集顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞（或組織）內(nèi)該熒光出現(xiàn)的位置和含量，還可檢測(cè)該物質(zhì)跨膜進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程。第三十七頁(yè)，共47頁(yè)。熒光漂白技術(shù)原理：使用強(qiáng)激光照射，將細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)區(qū)域的熒光分子漂白，然后觀察未漂白的熒光分子的運(yùn)動(dòng)。GFP較適合用于光漂白研究的熒光分子：它比較亮，穩(wěn)定，在活細(xì)胞內(nèi)沒有毒性，在使用低激光強(qiáng)度拍攝圖像時(shí)漂白較少，其次，在使用高強(qiáng)度激光照射時(shí)，GFP的光漂白是非可逆的，并且GFP的光漂白不會(huì)造成細(xì)胞損傷，另外，分子融合技術(shù)將GFP與特定蛋白分子融合，使得光漂白技術(shù)可用于研究蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。兩種漂白實(shí)驗(yàn)：一是熒光漂白丟失（FLIP），觀察漂白后的熒光丟失現(xiàn)象；二是熒光漂白恢復(fù)（FRAP），觀察的熒光恢復(fù)現(xiàn)象。第三十八頁(yè)，共47頁(yè)。熒光漂白丟失FLIP將細(xì)胞內(nèi)一個(gè)區(qū)域的熒光分子反復(fù)漂白，然后觀察漂白區(qū)域外熒光丟失的情況。可以研究不同部位的熒光分子的轉(zhuǎn)運(yùn)或連續(xù)性，如GFP整合蛋白分子在不同細(xì)胞器內(nèi)的分布等。第三十九頁(yè)，共47頁(yè)。熒光漂白恢復(fù)（FRAP）FRAP是利用高能量激光束將細(xì)胞內(nèi)某一部分中選定靶區(qū)域的某種熒光淬滅，然后觀察鄰近相同的非淬滅熒光標(biāo)記物重新擴(kuò)散入該區(qū)域的速度和方式，從而分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸、受體在細(xì)胞膜上的流動(dòng)和大分子組裝等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。第四十頁(yè)，共47頁(yè)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子間或蛋白質(zhì)分子內(nèi)的相互作用?？梢垣@得兩個(gè)蛋白分子之間相互作用的空間信息。關(guān)于蛋白分子的共定位，蛋白分子聚合體，轉(zhuǎn)錄機(jī)制，蛋白折疊等問(wèn)題可通過(guò)FRET來(lái)解決。第四十一頁(yè)，共47頁(yè)。LSCM在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用長(zhǎng)時(shí)程觀察細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)：目前的LSCM的軟件一般均可自動(dòng)控制進(jìn)行定時(shí)和定方式的激光掃描，新一代的LSCM探測(cè)效率提高，只需很小激光量就可達(dá)到較好的圖像質(zhì)量，從而減小了每次掃描時(shí)激光束對(duì)細(xì)胞的損傷，因此可以用于數(shù)小時(shí)的長(zhǎng)時(shí)間的定時(shí)掃描，記錄細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。第四十二頁(yè)，共47頁(yè)。激光共聚焦顯微鏡在各研究領(lǐng)域中應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動(dòng)性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細(xì)胞凋亡等；

生物化學(xué)：酶、核酸、FISH、受體分析等；藥理學(xué)：藥物對(duì)細(xì)胞的作用及其動(dòng)力學(xué)等；生理學(xué)：膜受體、離子通道、離子含量、分布、動(dòng)態(tài)等；遺傳學(xué)和組胚學(xué)：細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷等；

神經(jīng)生物學(xué)：神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運(yùn)輸和傳遞等；

微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)：細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)等；

病理學(xué)及病理學(xué)臨床應(yīng)用：活檢標(biāo)本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷等；

生物學(xué)、免疫學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)：免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)）的定位，細(xì)胞膜受體或抗原的分布,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位等。第四十三頁(yè)，共47頁(yè)。復(fù)習(xí)題LSCM成像原理簡(jiǎn)述LSCM在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第四十四頁(yè)，共47頁(yè)。超微結(jié)構(gòu)復(fù)習(xí)題簡(jiǎn)述細(xì)胞核，線粒體，高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞膜，溶酶體的基本結(jié)構(gòu)。線粒體嵴的類型、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和意義線粒體腫脹和積水變，嵴內(nèi)腫脹，線粒體肥大和增生，巨線粒體常見的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包含物粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)肥大和增生的形態(tài)特征粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫粒和多聚核糖體解聚形態(tài)特征和意義微絨毛形態(tài)特征纖毛形態(tài)特征常見的病理改變類型常見的細(xì)胞連接類型，基本結(jié)構(gòu)核體次級(jí)溶酶體的分類第四十五頁(yè)，共47頁(yè)。共聚焦實(shí)驗(yàn)分組2012.10.30102760宋鵬112679吳士超112680母亞雯119526劉麗娜122779公丕海122790徐世慧122826