普通微生物外源基因在細(xì)菌中的表達(dá)

普通微生物外源基因在細(xì)菌中的表達(dá)第一頁，共四十五頁，2022年，8月28日大腸桿菌畢赤酵母番茄葉子Hela細(xì)胞第二頁，共四十五頁，2022年，8月28日大腸桿菌中表達(dá)外源基因1.同源克隆獲得對(duì)蝦整合素的cDNA全長序列第三頁，共四十五頁，2022年，8月28日大腸桿菌中表達(dá)外源基因2.整合素多序列比對(duì)和空間結(jié)構(gòu)分析金屬離子結(jié)合位點(diǎn)第四頁，共四十五頁，2022年，8月28日大腸桿菌中表達(dá)外源基因3.整合素的βA結(jié)構(gòu)域的重組與蛋白純化M12M3456TrxβAM:蛋白marker1：pET32-integrin重組蛋白誘導(dǎo)前2：pET32-integrin重組蛋白誘導(dǎo)后3：純化的pET32-integrin重組蛋白4：pET32誘導(dǎo)前5：pET32誘導(dǎo)后6；純化的Trx蛋白第五頁，共四十五頁，2022年，8月28日大腸桿菌中表達(dá)外源基因4.整合素在大腸桿菌中大量培養(yǎng)及純化第六頁，共四十五頁，2022年，8月28日大腸桿菌中表達(dá)外源基因5.整合素重組蛋白的活性鑒定第七頁，共四十五頁，2022年，8月28日表達(dá)載體表達(dá)載體：具有宿主細(xì)胞基因表達(dá)所需調(diào)控序列，能使克隆的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。第八頁，共四十五頁，2022年，8月28日克隆載體與表達(dá)載體的區(qū)別克隆載體：高拷貝、導(dǎo)入原核細(xì)菌、大量復(fù)制。表達(dá)載體：高拷貝或低拷貝、導(dǎo)入工程菌或細(xì)胞（導(dǎo)入的基因由克隆載體產(chǎn)生、高蛋白表達(dá)效率?？寺≥d體是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，這是用來區(qū)別克隆載體和表達(dá)載體的標(biāo)志。表達(dá)載體第九頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、外源基因的轉(zhuǎn)錄1、啟動(dòng)子

位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游，為RNA聚合酶結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA控制序列。-35區(qū)：RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)-10區(qū)：RNA聚合酶于該處解開DNA雙鏈，并決定轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)第十頁，共四十五頁，2022年，8月28日啟動(dòng)子的種類（1）Lac啟動(dòng)子:正調(diào)控乳糖操縱子啟動(dòng)子

Lac啟動(dòng)子受CAP（分解物激活蛋白）和cAMP的正調(diào)控第十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日啟動(dòng)子的種類（1）Lac啟動(dòng)子:(IPTG)負(fù)調(diào)控

Lac啟動(dòng)子受阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控，lacUV5失去了CAP和cAMP的正調(diào)控，只要有乳糖或異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)時(shí)就可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。第十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日啟動(dòng)子的種類（2）Trp啟動(dòng)子:Trp啟動(dòng)子的阻遏蛋白必須與色氨酸結(jié)合才有活性，因此，缺乏色氨酸時(shí)，該啟動(dòng)子啟動(dòng)，色氨酸豐富時(shí)，則停止轉(zhuǎn)錄。色氨酸操縱子第十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日啟動(dòng)子的種類（3）Tac啟動(dòng)子:Tac啟動(dòng)子是一組由Lac和Trp人工構(gòu)建啟動(dòng)子，受Lac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)，它的啟動(dòng)能力比Lac和Trp

都強(qiáng)。啟動(dòng)子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac第十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日啟動(dòng)子的種類（4）PL、R啟動(dòng)子:cI基因編碼λ噬菌體基因組cI基因的溫度敏感突變株cI857ts溫度30℃42℃產(chǎn)生阻遏蛋白阻遏啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄cI857ts蛋白失活啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄第十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日啟動(dòng)子的種類（5）T7噬菌體啟動(dòng)子:通過加入誘導(dǎo)物或升溫，啟動(dòng)T7RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄，合成T7RNA聚合酶，識(shí)別T7啟動(dòng)子，從而啟動(dòng)外源基因高效表達(dá)。第十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、外源基因的轉(zhuǎn)錄2、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)與控制主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式：（1）誘導(dǎo)物誘導(dǎo)（2）溫度誘導(dǎo)（3）RNA聚合酶調(diào)節(jié)第十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、外源基因的轉(zhuǎn)錄3、轉(zhuǎn)錄終止子

一段位于基因或操縱子的3′端，具有終止轉(zhuǎn)錄功能的特定DNA序列。-RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn)，RNA的延伸也停止，完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放下來。第十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、外源基因的翻譯1、核糖體結(jié)合位點(diǎn)√1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，簡稱SD序列；√mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列；√位于mRNA起始密碼子AUG上游3~10bp左右，富含嘌呤序列。真核生物的mRNA上沒有SD序列，原核細(xì)胞表達(dá)真核基因時(shí)，要置于SD序列后。第十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、外源基因的翻譯2、密碼子的偏愛性密碼子高頻出現(xiàn)的密碼子稱為偏愛密碼子，對(duì)應(yīng)于豐富的tRNA密碼子，低頻出現(xiàn)的密碼子為稀有密碼子。第二十頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、外源基因的翻譯3、終止密碼子蛋白質(zhì)翻譯過程中終止肽鏈合成的信使核糖核酸（mRNA）的三聯(lián)體堿基序列。一般情況下為UAA、UAG和UGA，它們不編碼氨基酸。第二十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日比較啟動(dòng)子和起始密碼子、終止子和終止密碼子截然不同的概念。啟動(dòng)子和終止子都是一段特殊的DNA序列，屬于基因的非編碼區(qū)，分別位于編碼區(qū)的上游和下游，負(fù)責(zé)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄；起始密碼子和終止密碼子都是mRNA上的三聯(lián)體堿基序列，分別決定翻譯的起始和終止。第二十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日表達(dá)載體的要求與主要調(diào)控元件利用原核細(xì)胞表達(dá)真核基因時(shí)應(yīng)注意：基因的編碼區(qū)必須是連續(xù)的；基因必須置于原核細(xì)胞啟動(dòng)子、SD序列和終止子之下；產(chǎn)生的mRNA必須相對(duì)穩(wěn)定并能有效進(jìn)行翻譯和蛋白折疊防止蛋白酶的降解。第二十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、外源基因的表達(dá)產(chǎn)物1、非融合蛋白表達(dá)外源蛋白不與宿主蛋白融合，使其自身單獨(dú)表達(dá)。非融合蛋白表達(dá)載體AUG第二十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、外源基因的表達(dá)產(chǎn)物防止非融合蛋白降解的措施√采用蛋白酶含量很低的突變株作為宿主菌√利用胞內(nèi)蛋白酶抑制劑√分泌、包涵體第二十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、外源基因的表達(dá)產(chǎn)物2、融合蛋白表達(dá)融合蛋白表達(dá)載體麥芽糖結(jié)合蛋白

蛋白酶裂解位點(diǎn)

外源蛋白凝血因子Xa外源蛋白第二十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、外源基因的表達(dá)產(chǎn)物融合蛋白表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)√較易獲得高效表達(dá)；√在細(xì)胞內(nèi)比較穩(wěn)定；√許多融合蛋白可用作抗原。融合蛋白中目標(biāo)蛋白的分離純化√酶法：加入蛋白酶切位點(diǎn)Ile-Glu-Gly-Arg可被凝血因子Ⅹa識(shí)別并在C端切開；√化學(xué)法：外源蛋白與細(xì)菌蛋白之間加入Met，用CNBr裂解。第二十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日3、外源基因的分泌產(chǎn)物分泌表達(dá)信號(hào)肽√釋放有活性的蛋白；√免受宿主細(xì)胞中蛋白酶降解。第二十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日3、外源基因的分泌產(chǎn)物包涵體√難溶、非正確折疊、無生物活性；√可獲得大量的外源蛋白。第二十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日第七節(jié)：基因工程的應(yīng)用及展望第三十頁，共四十五頁，2022年，8月28日一、基因工程藥物胰島素全球糖尿病發(fā)病人數(shù)共3.82億，中國占到全球的四分之一，共9800萬。胰島素參與調(diào)節(jié)碳水化合物和脂肪代謝，控制血糖平衡，因此胰島素可用于治療糖尿病。第三十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日重組人胰島素方法一：AB鏈合成——已被淘汰以人工合成的人胰島素A鏈和B鏈基因分別與半乳糖苷酶基因連接，形成融合基因，分別在大腸桿菌中表達(dá)A鏈和B鏈，然后再通過化學(xué)氧化作用，通過二硫鍵連接起來。通過胰島素原的cDNA合成，表達(dá)產(chǎn)物是胰島素原，經(jīng)工具酶切開，除去C-肽得人胰島素。方法二：逆轉(zhuǎn)錄法第三十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日重組人胰島素方法一：AB鏈合成第三十三頁，共四十五頁，2022年，8月28日重組人胰島素方法二：逆轉(zhuǎn)錄法第三十四頁，共四十五頁，2022年，8月28日乙肝疫苗接種人群廣泛乙肝病毒表面抗原基因酵母細(xì)胞蛋白純化乙型肝炎疫苗第三十五頁，共四十五頁，2022年，8月28日埃博拉病毒HIV禽流感病毒疫苗？第三十六頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因大豆2006年，轉(zhuǎn)基因大豆依然是最主要的轉(zhuǎn)基因作物，占全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的57%。轉(zhuǎn)基因大豆主要有兩種，即抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆和抗蟲轉(zhuǎn)基因大豆。美國的轉(zhuǎn)基因大豆出油率高、價(jià)格比中國東北大豆更便宜，中國中糧集團(tuán)等公司都大量進(jìn)口美國大豆。第三十七頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用大豆產(chǎn)品第三十八頁，共四十五頁，2022年，8月28日爭論你對(duì)轉(zhuǎn)基因食品什么態(tài)度？第三十九頁，共四十五頁，2022年，8月28日二、基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物第四十頁，共四十五頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)基因豬用途及展望2、增加抗病性通過轉(zhuǎn)基因來增強(qiáng)豬對(duì)疾病的抵抗力也是一項(xiàng)很有前途的研究領(lǐng)域，但是，這方面的研究仍較少。

1、提高生產(chǎn)性能

獲得的轉(zhuǎn)基因豬生長速度提高11.8%～14.2%，也留下了一些后遺癥，死胎和畸形率較高，患關(guān)節(jié)病、胃潰瘍、腎病和生殖能力喪失癥的較為普遍。

3、作為人類疾病的研究模型建立了包括皮膚、消化器管和心血管系統(tǒng)等相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)基因豬模型。.。

第四十一頁，共四十五頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)基因豬用途及展望4、用作生物反應(yīng)器人們可以將編碼罕見的，具有醫(yī)用價(jià)值的人體蛋白基因轉(zhuǎn)移給豬，使其在豬體的血液或乳腺等組織中表達(dá)，從而可以在乳汁或血液中獲取轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物。

5、異種器官移植

第四十二頁，共四十五頁，2022年，8月28日三、基因治療

指向靶細(xì)胞中引入具有正常功能的基因，以糾正或補(bǔ)償