真核基因在大腸桿菌中表達

基因與基因工程基因操作的主要技術(shù)原理基因克隆的酶學基礎(chǔ)基因克隆的載體基因的分離與鑒定基因的表達與調(diào)節(jié)已講述的內(nèi)容第1頁/共65頁第一頁，共66頁。講述的內(nèi)容提綱

真核基因的大腸桿菌表達體系大腸桿菌的表達載體真核基因在大腸桿菌中的表達影響真核基因表達效率的因素第2頁/共65頁第二頁，共66頁。第一節(jié)真核基因的大腸桿菌表達體系第3頁/共65頁第三頁，共66頁。1.大腸桿菌表達體系基因工程的重要目標制備大量純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物因此，要選擇能高水平表達異源真核蛋白的表達系統(tǒng)目前常用的表達系統(tǒng)細菌（大腸桿菌）、酵母、昆蟲細胞、植物和哺乳動物細胞等第4頁/共65頁第四頁，共66頁。背景清楚，特別是對其基因工程表達調(diào)控的分子機理研究的比較深入。安全，且有多種不同的菌株和質(zhì)粒載體。已有許多真核基因在大腸桿菌中實現(xiàn)高效表達。培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，因此易于進行批量生產(chǎn)大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)越性第5頁/共65頁第五頁，共66頁。真核基因與原核基因的差別：編碼基因的不連續(xù)性，含有內(nèi)含子序列，大腸桿菌不具備對pre-RNA進行加工剪接的能力。轉(zhuǎn)錄信號的不同：真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA不具備結(jié)合細菌核糖體所必須的SD序列；細菌的RNA聚合酶不能識別真核啟動子。真核基因mRNA5’-端有帽子結(jié)構(gòu)，3’-端有poly(A)尾巴，影響其穩(wěn)定性及與細菌核糖體結(jié)合的能力，從而阻礙正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯。真核基因在大腸桿菌中表達存在許多障礙第6頁/共65頁第六頁，共66頁。解決方案將克隆的真核基因插入到原核啟動子的下游。從真核細胞中分離完整加工的mRNA，采用反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并連接到合適的載體上，可以克服內(nèi)含子問題。如果知道蛋白質(zhì)的氨基酸序列，且分子量不太大，可以用化學方法合成不含內(nèi)含子序列的寡聚核苷酸片斷。對于細菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通過突變的方法消除。第7頁/共65頁第七頁，共66頁。許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物存在翻譯后的修飾過程：磷酸化、糖基化等，大腸桿菌中無此過程，因此，表達的蛋白無法正確折疊，由此產(chǎn)生的三級結(jié)構(gòu)通常是不可溶的，常形成包涵體，無活性。表達的真核蛋白質(zhì)被細菌的蛋白酶識別并降解。真核基因在大腸桿菌中表達存在許多障礙第8頁/共65頁第八頁，共66頁。2.克隆基因正確表達的基本條件最基本條件：能夠進行正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯轉(zhuǎn)錄：真核基因置于原核啟動子的下游

3’-末端具有轉(zhuǎn)錄終止子翻譯：mRNA分子具有RBS（ribosomebindingsite）包括AUG或GUG和與16SrRNA3’-末端互補的

SD（Shine-Dalgarno）序列。第9頁/共65頁第九頁，共66頁。另一個重要條件：編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應能維持正常的穩(wěn)定性。表達蛋白被大腸桿菌蛋白酶降解。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)形成的速率與其穩(wěn)定性有關(guān)。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的正確形成需要分子伴侶的參與。大腸桿菌不可能對所有外源蛋白都存在正確的分子伴侶。第10頁/共65頁第十頁，共66頁。第二節(jié)大腸桿菌的表達載體第11頁/共65頁第十一頁，共66頁。PSDCDSTTAmprOriRBSStartcodonStopcodon大腸桿菌表達載體的基本結(jié)構(gòu)特征第12頁/共65頁第十二頁，共66頁。1.表達載體的基本成分啟動子：影響外源基因的表達水平使外源基因高水平表達必須具備的條件：強啟動子啟動子呈現(xiàn)一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平：表達的外源蛋白可能對寄主細胞不利。誘導型啟動子：能通過簡單的方式使用廉價的誘導物使外源基因獲得表達，如IPTG、溫度等。第13頁/共65頁第十三頁，共66頁。轉(zhuǎn)錄終止子上游啟動子會抑制下游啟動子的轉(zhuǎn)錄功能(啟動子封堵作用)，因此需要在克隆基因編碼區(qū)的3’-末端接上一個有效的轉(zhuǎn)錄終止子。轉(zhuǎn)錄終止子能增強mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。第14頁/共65頁第十四頁，共66頁。翻譯起始序列：決定mRNA的翻譯起始效率。未鑒定出其保守結(jié)構(gòu)，只能采取一些方法降低mRNA5’-末端二級結(jié)構(gòu)的形成，增加RBS中A、T含量，堿基定點突變等。增強子：特殊的序列元件，能顯著增強外源基因的表達效率。第15頁/共65頁第十五頁，共66頁。翻譯終止子：必須存在終止密碼子。構(gòu)建表達載體時通常裝上全部的三個終止密碼子(UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖體的跳躍現(xiàn)象。大腸桿菌最偏愛的密碼子：UAA當為四聯(lián)核苷酸UAAU時，終止效率進一步增強。第16頁/共65頁第十六頁，共66頁。2.常用的大腸桿菌表達載體lac啟動子的表達載體阻遏物iPOzayRNA聚合酶結(jié)合區(qū)阻遏物結(jié)合區(qū)核糖體結(jié)合區(qū)乳糖操縱子結(jié)構(gòu)模型第17頁/共65頁第十七頁，共66頁。IDNAZYAOPmRNA阻遏蛋白pol沒有乳糖存在時阻遏基因第18頁/共65頁第十八頁，共66頁。mRNA阻遏蛋白有乳糖存在時IDNAZYAOPpol啟動轉(zhuǎn)錄mRNA乳糖半乳糖β-半乳糖苷酶第19頁/共65頁第十九頁，共66頁。lac操縱子受lac阻遏物的負調(diào)節(jié)。培養(yǎng)基中缺乏乳糖或其它誘導物時，lac阻遏物同操縱單元結(jié)合，關(guān)閉乳糖操縱子的活動。培養(yǎng)基中加入乳糖或其它誘導物(IPTG)時，同阻遏物結(jié)合，使乳糖操縱子去阻遏。因此，我們可以通過加入IPTG誘導來實現(xiàn)外源基因的表達。第20頁/共65頁第二十頁，共66頁。lac操縱子的控制區(qū)，包括核糖體結(jié)合區(qū)、RNA聚合酶結(jié)合區(qū)及阻遏物結(jié)合區(qū)都位于長203bp的HaeIII片斷上。203bp的HaeIII片斷含有l(wèi)ac啟動子、操縱單元及β-半乳糖苷酶的前8個密碼子?？梢詫⒃撈瑪嗖迦氲劫|(zhì)粒中，構(gòu)建含有l(wèi)ac啟動子的質(zhì)粒表達載體。第21頁/共65頁第二十一頁，共66頁。這種多拷貝質(zhì)粒中的操縱單元可以把大腸桿菌中所有的lac阻遏物都結(jié)合掉，使細菌染色體的β-半乳糖苷酶基因解抑制。含有質(zhì)粒載體（lac啟動子、操縱單元）的大腸桿菌能夠合成β-半乳糖苷酶，因此菌落在加有X-gal(底物)的瓊脂平板上呈藍色。這種顯色反應可用來快速鑒定陽性克隆。第22頁/共65頁第二十二頁，共66頁。trp啟動子的表達載體第23頁/共65頁第二十三頁，共66頁。TrpTrp高時Trp低時mRNAOPtrpR調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶RNA聚合酶?色氨酸操縱子第24頁/共65頁第二十四頁，共66頁。色氨酸不是作為誘導物，而是作為輔阻遏物結(jié)合trp阻遏分子。被色氨酸激活的trp阻遏分子同操縱單元結(jié)合后，就使得RNA聚合酶失去同trp啟動子結(jié)合的機會，從而關(guān)閉trp基因的轉(zhuǎn)錄。因此，當色氨酸濃度低時，trp基因轉(zhuǎn)錄才能開始。第25頁/共65頁第二十五頁，共66頁。將trp操縱子插入到質(zhì)粒載體中，可以構(gòu)建含有trp啟動子的表達載體。這種載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)3-吲哚丙烯酸誘導，可使外源基因獲得高效表達。該表達載體優(yōu)點：表達蛋白產(chǎn)量高于lac操縱子表達系統(tǒng)。第26頁/共65頁第二十六頁，共66頁。PL啟動子的表達載體第27頁/共65頁第二十七頁，共66頁。來源于λ噬菌體，是一種最廣泛使用的大腸桿菌表達載體的啟動子之一。受阻遏基因cI編碼蛋白的正調(diào)控。cI基因存在一個溫度敏感突變等位基因，即cI857。cI857或存在于大腸桿菌染色體上，或存在于相容性的質(zhì)粒分子上。第28頁/共65頁第二十八頁，共66頁。cI阻遏蛋白在42℃時失活，因此大腸桿菌在42℃培養(yǎng)時，

PL啟動子啟動轉(zhuǎn)錄；而在28-30℃培養(yǎng)時，cI阻遏蛋白有活性，使PL啟動子處于抑制狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄停止。利用這一特性，我們只要簡單地改變培養(yǎng)溫度，就可以誘導或關(guān)閉PL啟動子的活性。將PL啟動子克隆到質(zhì)粒載體上，可以構(gòu)建由PL啟動子啟動的表達載體。第29頁/共65頁第二十九頁，共66頁。第30頁/共65頁第三十頁，共66頁。BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalIXhoI,SacI,HindIII第31頁/共65頁第三十一頁，共66頁。第三節(jié)真核基因在大腸桿菌中的表達第32頁/共65頁第三十二頁，共66頁。1.外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位細胞質(zhì)中表達：易形成包涵體包涵體：由不可溶性蛋白聚集折疊形成，是外源基因高效表達時常發(fā)生的一種特殊生理現(xiàn)象。包涵體形成的理化參數(shù)：對E.coli80種蛋白研究獲得。

電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基的組分、半胱氨酸的組分、脯氨酸的組分、親水性和氨基酸殘基的總數(shù)。第33頁/共65頁第三十三頁，共66頁。分析蛋白質(zhì)的氨基酸組分可以預測包涵體形成的概率。每種氨基酸出現(xiàn)在各種二級結(jié)構(gòu)中的傾向或者頻率不同。例如：Glu(谷aa)主要出現(xiàn)在螺旋中

Asp(天冬aa)和Gly(甘aa)主要分布在轉(zhuǎn)角中

Pro也常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)角中，但一般不會出現(xiàn)在螺旋中第34頁/共65頁第三十四頁，共66頁。第35頁/共65頁第三十五頁，共66頁。表達蛋白形成包涵體的優(yōu)缺點：優(yōu)點：易于分離蛋白被保護而免受胞內(nèi)酶的降解蛋白質(zhì)沒有活性，不會對寄主細胞造成傷害缺點：很難恢復生物學活性蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量低第36頁/共65頁第三十六頁，共66頁。解決方案：限制包涵體的形成⑴外源基因與分子伴侶共表達分子伴侶：能夠阻止聚合作用而使蛋白質(zhì)正確折疊。⑵使用硫氧還蛋白缺陷的寄主菌株目的：維持有利的氧化還原電位⑶低溫誘導，降低蛋白質(zhì)的合成速率⑷與高可溶性的多肽融合表達第37頁/共65頁第三十七頁，共66頁。周質(zhì)中表達優(yōu)點：周質(zhì)中細胞蛋白少，有利于外源蛋白的純化。周質(zhì)中的氧化環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的正確折疊。周質(zhì)中蛋白質(zhì)的降解作用小。條件：需要信號肽的引導，使表達蛋白由細胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運到周質(zhì)。信號肽：有原核的信號肽，也有真核的信號肽。第38頁/共65頁第三十八頁，共66頁。蛋白轉(zhuǎn)運過程相當復雜蛋白質(zhì)跨膜過程還與細胞的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)。即使存在信號肽，也不能保證蛋白正確轉(zhuǎn)運到周質(zhì)中。如：免疫球蛋白與T-細胞受體分子結(jié)構(gòu)相似。免疫球蛋白可以在周質(zhì)中表達。

T-細胞受體不能在周質(zhì)中表達。第39頁/共65頁第三十九頁，共66頁。細胞外表達：易于分離純化，但相當困難。原因：細菌細胞有兩層膜，即內(nèi)膜和外膜，表達蛋白需跨越兩層膜屏障。解決方案：⑴利用大腸桿菌固有的途徑：將外源蛋白與

E.coli分泌型蛋白融合表達。

⑵增加E.coli細胞外膜的滲漏性：信號肽序列、透化劑、與細菌素釋放蛋白或具透化作用的基因共表達。第40頁/共65頁第四十頁，共66頁。2.融合蛋白的表達融合基因的概念：具有來自兩個或兩個以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。DNA體外重組構(gòu)建的融合基因：外源基因與啟動子融合：編碼產(chǎn)物不一定是融合蛋白。兩個或以上不同基因的編碼序列組成的融合基因：編碼產(chǎn)物為單一的多肽序列，稱為融合蛋白、雜種蛋白、嵌合蛋白。第41頁/共65頁第四十一頁，共66頁。融合蛋白質(zhì)配偶體作用：阻止包涵體的形成改善蛋白質(zhì)的折疊性能限制蛋白酶的酶解簡化蛋白質(zhì)的檢測與純化程序種類：GST、His6、MBP等第42頁/共65頁第四十二頁，共66頁。表達融合蛋白的策略用融合載體表達融合蛋白質(zhì)：在設(shè)計時注意外源基因與靶基因連接后仍保持正確的讀碼框。BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalIXhoI,SacI,HindIIIpGEX-KG5.0kbPtacBspMIBalIPstIAlwNIpBR2332oriMluIBstEIINarIEcoRVBssHIIStopCodonsIGSTAmpLacIGAATTCTAGAEcoRIXbaI第43頁/共65頁第四十三頁，共66頁。用融合載體組合表達融合蛋白質(zhì)：在克隆外源基因時，不用考慮讀碼框問題。第44頁/共65頁第四十四頁，共66頁。用pBR322質(zhì)粒載體表達融合蛋白質(zhì)

pBR322質(zhì)粒載體中含有唯一的PstI位點用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶和dGTP或dCTP進行同聚物加尾。G、C配對，T4DNA連接酶連接后，總有一部分具有正確的讀碼結(jié)構(gòu)。GGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCC第45頁/共65頁第四十五頁，共66頁。融合蛋白的純化：利用與融合蛋白中的配偶體相對應的配體作為吸附劑，制備親和層析柱。通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白被滯留下來，其它蛋白則流出柱外。通過洗脫處理，可回收到純化的融合蛋白。第46頁/共65頁第四十六頁，共66頁。第47頁/共65頁第四十七頁，共66頁。融合蛋白的切割：配偶體的存在可能影響融合蛋白的功能。方法：化學切割：如溴化氰特異切割甲硫氨酸殘基，AUG不是起始密碼子時編碼，適合鏈內(nèi)不含甲硫氨酸殘基的多肽的切割。MetGST外源蛋白第48頁/共65頁第四十八頁，共66頁。

酶切割：如凝血因子Xa，在融合基因之間插入編碼Xa的識別序列，融合蛋白純化后可用Xa切除大腸桿菌的多肽，得到天然的目標蛋白。Ile-Glu-Gly-ArgGST外源蛋白第49頁/共65頁第四十九頁，共66頁。3.外源蛋白在大腸桿菌中的穩(wěn)定性

影響因素：蛋白的酶解作用：細菌細胞的蛋白酶能選擇性地酶解異常蛋白質(zhì)，包括外源蛋白。

解決方案：外源蛋白在周質(zhì)或胞外表達使用蛋白酶缺陷的菌株低溫培養(yǎng)、與分子伴侶共表達

消除蛋白酶切割位點、目標蛋白的疏水性修飾第50頁/共65頁第五十頁，共66頁。結(jié)構(gòu)決定因子：N-氨基酸性質(zhì)及內(nèi)部的PEST序列N-端法則：N-端為精aa、賴aa、亮aa、苯丙aa、酪aa、色aa時，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性差。N-端附近的內(nèi)部賴aa是遍在蛋白質(zhì)的受體，易受依賴于遍在蛋白質(zhì)的蛋白酶降解。PEST序列：指真核蛋白中富含脯aa、谷aa、絲aa、蘇aa的區(qū)段，易發(fā)生胞內(nèi)降解，該序列的磷酸化作用增加了與鈣離子結(jié)合，從而促進依賴于鈣離子的蛋白酶的降解。第51頁/共65頁第五十一頁，共66頁。表達部位：周質(zhì)與胞外所含蛋白酶較少，在這些部位表達的蛋白不易被降解。分子伴侶的穩(wěn)定作用：阻止聚合作用，促進蛋白質(zhì)的正確折疊。一種分子伴侶的超量表達無法使蛋白正確折疊，不同類型分子伴侶彼此協(xié)調(diào)參與蛋白質(zhì)的折疊。第52頁/共65頁第五十二頁，共66頁。第四節(jié)影響真核基因表達效率的因素第53頁/共65頁第五十三頁，共66頁。影響因素：啟動子的強度、DNA轉(zhuǎn)錄起始序列密碼子的選擇、mRNA的二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄的終止、質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性寄主細胞的生理特征等第54頁/共65頁第五十四頁，共66頁。1.5’-UTR對克隆基因表達效率的影響啟動子結(jié)構(gòu)的影響：啟動子序列具有2種保守序列，即-35區(qū)(5’-TTGACA)和-10區(qū)(5’-TATAAT)。啟動子序列與此越相似，其表達能力越強。-35區(qū)和-10區(qū)之間的距離：也是影響克隆基因表達效率的重要因素。距離越接近17bp，啟動子的活性越強。對于某些啟動子，-35區(qū)上游的10-100bp序列：起上游激活物的作用。第55頁/共65頁第五十五頁，共66頁。啟動子與克隆基因之間距離的影響：發(fā)生2-3nt長度的變化，就能顯著影響翻譯的效率。與質(zhì)粒mRNA5’-端的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)：SD序列或AUG密碼子參與mRNA分子的堿基配對會明顯降低mRNA的翻譯效率。要獲得良好表達，AUG密碼子或SD序列必須處于易接觸的部位，以利于與核糖體結(jié)合起始翻譯過程。mRNA5’-末端與SD序列的距離也是影響翻譯效率的重要因素，距離小于15nt時，翻譯效率會顯著下降。第56頁/共65頁第五十六頁，共66頁。提高克隆基因表達效率的方案：建立克隆庫：使目的基因放置在與啟動子不同距離的位置上，從重組體中篩選產(chǎn)量最高的克隆。對于表達產(chǎn)物難以測定的基因，可先將其N-端片斷與報告基因融合，再建立克隆庫，通過報告基因產(chǎn)物的活性來篩選克隆基因有效表達的重組菌落。最后將該質(zhì)粒中的報告基因用克隆基因的C-端片斷替換，即得到高效表達克隆基因的重組質(zhì)粒。第57頁/共65頁第五十七頁，共66頁。質(zhì)粒的拷貝數(shù)的影響：提高表達效率的途徑：增加mRNA的數(shù)量。影響mRNA合成速率的因素有兩種，即啟動子的強度和基因的拷貝數(shù)。提高基因的拷貝數(shù)：將其克隆到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體上。質(zhì)粒的不穩(wěn)定性的影響：發(fā)生質(zhì)粒丟失保持抗生素的選擇壓力將質(zhì)粒分配功能區(qū)par克隆到質(zhì)粒載體上2.質(zhì)粒的生物學特性對表達效率的影響第58頁/共65頁第五十八頁，共66頁。

對無質(zhì)粒的細胞進行反選擇P1λcIT1P2外源基因T2轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株溶源性細菌質(zhì)粒丟失重組細菌λcI缺陷的λphageλ阻遏物喪失細菌死亡溶菌第59頁/共65頁第五十九頁，共66頁。3.mRNA轉(zhuǎn)錄物的分子特性對表達效率的影響轉(zhuǎn)錄起始序列的影響：SD序列的影響：起始密碼子上游的5-10nt，核糖體的結(jié)合位點。與16SrRNA互補程度越高，轉(zhuǎn)譯的效率越高。SD序列后的4個堿基的影響：為4A或4T時轉(zhuǎn)譯效率最高，為4C或4G時效率只有最高轉(zhuǎn)譯效率的50%或25%。起始密碼子AUG上游三聯(lián)密碼子組成的影響：UAU或CUU時轉(zhuǎn)譯最有效，UUC、UCA、AGG時效率下降20%。AUG下游密