益氣活血藥對心肌組織及H9C2細胞Cx43表達和凋亡影響精品課件

1研究背景心肌縫隙連接蛋白43心肌細胞凋亡心血管系統(tǒng)疾病是危害人類健康的常見病。心肌縫隙連接蛋白43和細胞凋亡的異常在心血管疾病的發(fā)病過程中都扮演了重要角色。

第1頁/共42頁第一頁，共43頁。2心肌縫隙連接蛋白43(CX43)縫隙連接是一種特殊膜結(jié)構(gòu)，由兩個連接子對接而成，每個連接子包含來自毗鄰細胞的六個連接蛋白，直接連接兩個細胞的胞質(zhì)，允許相鄰細胞間電信號和化學(xué)信號的直接通訊。連接蛋白家族有20多個成員，就心室而言，表達最豐富的是Cx43。第2頁/共42頁第二頁，共43頁。3Cx43是維持心肌細胞間化學(xué)偶聯(lián)和電偶連的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)

心肌缺血時，Cx43分布和表達異常會導(dǎo)致心肌細胞電偶聯(lián)的缺失，易于發(fā)生室性心律失常甚至猝死。并且Cx43的異常還會導(dǎo)致心肌細胞間的代謝障礙。

第3頁/共42頁第三頁，共43頁。4心肌細胞凋亡細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是一種生理現(xiàn)象，但病理狀態(tài)下細胞凋亡的增加與心肌缺血、缺血再灌注損傷和心力衰竭的發(fā)生都密切相關(guān)。

過度的細胞凋亡會加速心肌細胞的丟失，造成心功能的惡化，并促進心室重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展。

第4頁/共42頁第四頁，共43頁。5材料與方法第5頁/共42頁第五頁，共43頁。6實驗材料實驗動物雄性SD大鼠，體重200～240g，許可號：SCXK（京）2006-0009。實驗細胞RatH9C2心肌細胞系（ATCC?Number：CRL-1446?）實驗用藥生脈注射液（紅參、麥冬、五味子），10ml/支，雅安三九藥業(yè)有限公司（批號：100301）血塞通注射液（三七總皂苷），250mg/10ml/支，昆明制藥集團股份有限公司（批號：10DL04）。主要試劑兔抗Cx43多克隆抗體（批號：10440704）Hoechst凋亡細胞核和凋亡小體染色試劑盒（#C1100）第6頁/共42頁第六頁，共43頁。7實驗方法第7頁/共42頁第七頁，共43頁。8整體實驗分組與給藥方法大鼠隨機分為：益氣活血組：生脈注射液聯(lián)合血塞通注射液卡托普利組：卡托普利模型組：生理鹽水假手術(shù)組：生理鹽水連續(xù)給藥一個月

第8頁/共42頁第八頁，共43頁。9心肌梗死大鼠模型制備

參照文獻，采用冠脈結(jié)扎法制作大鼠心肌梗死模型?！醮T仁,王振濤,趙明鏡,李敏.心氣虛病證動物模型及其評價體系的構(gòu)建.中國實驗動物學(xué)報.2002;10(1):33-38.

第9頁/共42頁第九頁，共43頁。10心梗模型大鼠心電圖和心臟超聲評價結(jié)扎冠脈前 結(jié)扎冠脈后模型組 心功能比較采用心電圖和心臟超聲評價心梗大鼠造模是否成功。術(shù)后與術(shù)前比較，大鼠心電圖ST段明顯抬高。取材前超聲檢查顯示模型大鼠左心室內(nèi)徑明顯擴大，室壁變薄，收縮運動減弱，心功能降低。第10頁/共42頁第十頁，共43頁。11在體電刺激誘發(fā)室顫實驗方法參照文獻，大鼠麻醉后固定，呼吸機輔助呼吸，開胸暴露心臟，連接刺激電極。采用程控電刺激誘發(fā)室顫，記錄室顫閾值?！袼刹?王碩仁,姚立芳,等.參松養(yǎng)心膠囊對大鼠心梗后心肌重構(gòu)和和室顫閾值影響的研究.中國中藥雜志.2009,34(16):2101-2104第11頁/共42頁第十一頁，共43頁。12細胞實驗分組與給藥方法正常對照組模型組血塞通低劑量組血塞通高劑量組細胞實驗以大鼠H9C2心肌細胞系為研究對象，分為兩個實驗。實驗1：生脈聯(lián)合血塞通注射液對H9C2細胞Cx43損傷的影響實驗2：生脈聯(lián)合血塞通注射液對H9C2細胞凋亡的影響兩個實驗均分為以下八組生脈低劑量組生脈高劑量組生脈和血塞通低劑量組生脈和血塞通高劑量組第12頁/共42頁第十二頁，共43頁。13細胞實驗1：誘導(dǎo)H9C2細胞Cx43損傷的方法參照文獻，采用TPA造成Cx43的損傷。TPA是一種蛋白激酶C的激活劑，可以增加Cx43的磷酸化，從而降低Cx43通道的通透性，還能顯著地降低縫隙連接的組裝，并使Cx43失去穩(wěn)定性?！狶ampePD,TenBroekEM,BurtJM,etal.Phosphorylationofconnexin43onserine368byproteinkinaseCregulatesgapjunctionalcommunication[J].JCellBiol,2000,149(7):1503-1512.——LampePD,LauAF.Theeffectsofconnexinphosphorylationongapjunctionalcommunication[J].IntJBiochemCellBiol,2004,36(7):1171-1186.

第13頁/共42頁第十三頁，共43頁。14細胞實驗1：H9C2細胞Cx43檢測方法

采用免疫細胞化學(xué)法檢測Cx43的表達主要步驟：用4%多聚甲醛固定細胞15min，血清封閉，滴加1:100稀釋一抗4℃孵育過夜。次日加二抗，37℃孵育30min，DAB顯色，倒置顯微鏡拍照觀察。

第14頁/共42頁第十四頁，共43頁。15細胞實驗2：誘導(dǎo)H9C2細胞凋亡的方法參照文獻，使用AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞凋亡。

血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是一種生物活性物質(zhì)，可使血管收縮，血壓升高，并能夠誘導(dǎo)心肌細胞的凋亡。——裴兆輝,馬虹,朱妙章等.血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細胞凋亡機制的研究進展[J].心臟雜志,2005,17(5):482-483.第15頁/共42頁第十五頁，共43頁。16細胞實驗2：H9C2細胞凋亡檢測方法

采用Hoechst染色法檢測細胞凋亡主要步驟：用4%多聚甲醛固定細胞，PBS洗滌1次，加入Hoechst染色液，室溫孵育10min，吸棄染液，PBS洗滌1次，倒置熒光顯微鏡觀察拍照，分析凋亡細胞占總細胞數(shù)的百分比。

第16頁/共42頁第十六頁，共43頁。17統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(X±ｓ)表示。先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

第17頁/共42頁第十七頁，共43頁。18結(jié)果第18頁/共42頁第十八頁，共43頁。19前期工作課題組前期對心肌梗死大鼠模型進行了中醫(yī)證候和西醫(yī)病理方面的中西醫(yī)結(jié)合研究。其中基因表達譜芯片的工作提示：心肌縫隙連接和細胞凋亡是心梗大鼠基因差異表達的聚集點之一。據(jù)此線索，本研究重點觀察益氣活血藥對心肌縫隙連接和凋亡的影響。第19頁/共42頁第十九頁，共43頁。20心肌梗死大鼠差異基因的生物信息學(xué)分析第20頁/共42頁第二十頁，共43頁。21心肌梗死大鼠心肌Cx43mRNA和蛋白表達的變化

在芯片實驗基礎(chǔ)上，對心梗大鼠Cx43的基因和蛋白表達進行了驗證，結(jié)果同樣證實心肌梗死發(fā)生后Cx43mRNA和蛋白的表達均明顯降低。第21頁/共42頁第二十一頁，共43頁。22心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡率變化

在凋亡方面，我們動態(tài)觀察了從冠脈結(jié)扎術(shù)后3天到12周，心肌細胞凋亡率的變化，模型組在各個時點凋亡率均明顯高于假手術(shù)組。并且從3天到4周，模型組凋亡率先呈下降趨勢，而后從4周到12周凋亡率又逐漸增加。第22頁/共42頁第二十二頁，共43頁。23整體動物實驗結(jié)果基于以上前期工作，本研究首先進行動物實驗，從組織水平觀察益氣活血藥的心臟保護作用。動物實驗分為以下4部分：在體電刺激誘發(fā)室顫實驗心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)改變心肌Cx43基因表達檢測心肌Cx43免疫組化實驗第23頁/共42頁第二十三頁，共43頁。24動物實驗1：益氣活血藥對在體電刺激誘發(fā)室顫的閾值影響室顫閾值的降低，表明心臟電穩(wěn)定性差，容易發(fā)生室顫。與假手術(shù)組比較，心梗模型組室顫閾值降低，益氣活血藥治療后室顫閾值提高。第24頁/共42頁第二十四頁，共43頁。25動物實驗2：心臟大體形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

假手術(shù)組模型組益氣活血組卡托普利組

取材時可見，模型組大鼠梗死范圍較大，室壁變薄和心腔擴大明顯。益氣活血藥治療后，梗死范圍有一定程度的縮小。第25頁/共42頁第二十五頁，共43頁。26益氣活血藥對心梗大鼠臟體比值（全心重/體重）的影響

心肌梗死大鼠的心重/體重比明顯增加，益氣活血藥治療后，臟體比值下降。第26頁/共42頁第二十六頁，共43頁。27益氣活血藥對心梗大鼠左心室內(nèi)徑的影響

模型組左心室內(nèi)徑明顯高于假手術(shù)組，益氣活血藥治療后，左室內(nèi)徑變小。第27頁/共42頁第二十七頁，共43頁。28益氣活血藥對心梗大鼠心肌梗死百分比的影響益氣活血藥治療后，心肌梗死范圍明顯縮小。第28頁/共42頁第二十八頁，共43頁。29動物實驗3：益氣活血藥對心梗大鼠心肌Cx43mRNA表達的影響

心肌梗死大鼠Cx43mRNA表達明顯降低，益氣活血藥治療后Cx43mRNA表達增加。第29頁/共42頁第二十九頁，共43頁。30動物實驗4：心肌Cx43免疫組化染色

免疫組化染色心肌Cx43呈棕黃色顆粒表達，假手術(shù)組界線清晰成線狀排列，主要位于閏盤內(nèi)，分布整齊。模型組Cx43表達明顯減弱甚至消失，殘存的Cx43界線不清，分布紊亂。與模型組比較，益氣活血組和卡托普利組Cx43表達增加，分布比較整齊。第30頁/共42頁第三十頁，共43頁。31益氣活血藥對心梗大鼠心肌Cx43蛋白表達的影響圖像分析顯示，模型組Cx43表達的強度和陽性面積均低于假手術(shù)組；益氣活血藥治療后，Cx43的表達和面積均顯著增加。第31頁/共42頁第三十一頁，共43頁。32細胞實驗在動物實驗基礎(chǔ)上，本研究進一步開展細胞實驗，擬從心肌Cx43和細胞凋亡角度，探討益氣活血藥的藥效機制。細胞實驗分為以下兩部分：生脈注射液聯(lián)合血塞通注射液對H9C2細胞Cx43損傷的影響

生脈注射液聯(lián)合血塞通注射液對H9C2細胞凋亡的影響

第32頁/共42頁第三十二頁，共43頁。33細胞實驗細胞實驗以大鼠H9C2心肌細胞系為研究對象，H9C2來源于胚胎期心臟，具有心肌細胞的特性，可以模擬心肌細胞，常用于與心肌細胞相關(guān)的機制研究。

H9C2細胞HE染色200×H9C2細胞HE染色400×第33頁/共42頁第三十三頁，共43頁。34細胞實驗1：生脈聯(lián)合血塞通注射液對H9C2細胞Cx43損傷的影響細胞免疫化學(xué)染色顯示，Cx43呈棕黃色表達，

TPA刺激H9C2細胞后，Cx43的表達明顯降低。單獨使用血塞通注射液或生脈注射液干預(yù)都可以增加Cx43的表達，而二者聯(lián)合使用效果更佳并且高劑量趨勢更明顯。

第34頁/共42頁第三十四頁，共43頁。35細胞實驗2：生脈聯(lián)合血塞通注射液對H9C2細胞凋亡的影響Hoechst染色是一種經(jīng)典而快速的細胞凋亡檢測方法。正常細胞染色后細胞核呈藍色；細胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)固縮，細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色高亮。第35頁/共42頁第三十五頁，共43頁。36結(jié)果顯示：AngⅡ處理后H9C2細胞凋亡率顯著增加，血塞通注射液和生脈注射液都具有降低凋亡率的作用，其中生脈注射液和血塞通注射液聯(lián)合使用時抑制凋亡的效果最明顯。

細胞實驗2：生脈聯(lián)合血塞通注射液對H9C2細胞凋亡的影響第36頁/共42頁第三十六頁，共43頁。37討論第37頁/共42頁第三十七頁，共43頁。38討論Cx43異常是引起心臟電重構(gòu)而誘發(fā)心律失常重要因素之一；而凋亡的過度增加會加速心肌細胞丟失，心功能惡化，促進心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。Cx43與凋亡的關(guān)系比較復(fù)雜：一方面由Cx43組成GJ開放時，有利于凋亡信號的傳遞，促進心肌細胞的凋亡；另一方面心肌缺血使Cx43遭到破壞，相鄰心肌細胞間物質(zhì)和信號快速交換的通道被切斷，又不利于心肌細胞的同步運動、新陳代謝和生存。但是無論如何，心肌Cx43損傷和心肌細胞凋亡的增加都是導(dǎo)致患者病情惡化甚至猝死的病理學(xué)基礎(chǔ)。第38頁/共42頁第三十八頁，共43頁。39本研