干細(xì)胞調(diào)控中去泛素化酶的作用探析,細(xì)胞生物學(xué)論文

干細(xì)胞調(diào)控中去泛素化酶的作用探析,細(xì)胞生物學(xué)論文摘要：胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)是能夠進(jìn)行自我更新和多系分化的細(xì)胞系,幾乎所有的干細(xì)胞都具有這兩大特性。干細(xì)胞的這種特性遭到各類因素的控制和調(diào)節(jié),如基因表示出調(diào)控層面的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、RNA層面的可變剪接、蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)在機(jī)體內(nèi)代謝調(diào)控等。華而不實(shí),蛋白質(zhì)翻譯后修飾(posttranslationalmodifications,PTMs)機(jī)制之一泛素蛋白酶體系統(tǒng)在調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新、增殖和分化中起著核心作用。該文綜述了泛素動(dòng)態(tài)變化在干細(xì)胞自我更新和分化調(diào)節(jié)中的重要作用,泛素連接酶和去泛素化酶作為泛素蛋白酶體系統(tǒng)中研究最為深切進(jìn)入和廣泛的酶分子,對(duì)于維持干細(xì)胞自我更新和分化的蛋白分子穩(wěn)態(tài)有重要作用。該文將重點(diǎn)對(duì)去泛素化酶的作用進(jìn)行總結(jié)和歸納,以充分揭示泛素動(dòng)態(tài)調(diào)控對(duì)干細(xì)胞自我更新和分化的奉獻(xiàn)。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：干細(xì)胞;自我更新和分化;去泛素化酶;Abstract：ESCs(embryonicstemcells)andiPSCs(inducedpluripotentstemcells)aretheclassofcelllinescapableofself-renewalandmulti-lineagedifferentiation.Almostallstemcellspossessthesetwocharacteristics.Thischaracteristicofstemcellsiscontrolledandregulatedbymanyfactors,suchastranscriptionfactorregulationatthelevelofgeneexpression,mRNAalternativesplicingregulation,proteinpost-translationalmodification,etc.GivenUPS(ubiquitinproteasomesystem),whichisamajormachineryasapartoftheproteinpost-translationalmodifications,hasplayedgreatrolesintheregulationofproteindynamics.ThereisnodoubtUPSplaysakeyroleinregulatingtheself-renewal,reproductionanddifferentiationofstemcells.AmongthethreekindsofenzymescontainedintheUPS,theE3ligasesanddeubiquitinasesarethemostresearchedandhighlyfocused.Herethisstudyconcludedtheimportantcellularrolesofubiquitindynamicsintheregulatingofstemcellcharacteristics,focusingonthesummaryandinductionoftheroleofDUBs(deubiquitinates)inthecontrolofstemcellfatetofullyuncoverthecontributionofubiquitindynamicstostemcellself-renewalanddifferentiation.Keyword：stemcell;self-renewalanddifferentiation;deubiquitinase;1998年,THOMOSON[1]成功從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和囊胚中分離出人胚胎干細(xì)胞(humanembryonicstemcells,hESCs)。由于這類細(xì)胞具有無(wú)限自我更新能力且能被誘導(dǎo)分化成內(nèi)、中、外三個(gè)胚層細(xì)胞進(jìn)而成為成熟細(xì)胞的分化潛能而備受青睞。在體內(nèi),干細(xì)胞的這種分化潛能,一方面遭到多能性基因表示出和多能性轉(zhuǎn)錄因子,如Sox2、含POU構(gòu)造域的八聚體結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-bindingtranscriptionfactor4,Oct4)(也叫Pou5f1)、Nanog、Kruppel樣因子4(kruppel-likefactor4,Klf4)、Lin28和cMyc等的調(diào)控;另一方面通過(guò)遷移至特定環(huán)境,在微環(huán)境因子和細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)因子共同刺激下,促進(jìn)分化相關(guān)基因表示出引起細(xì)胞分化,最終成為在個(gè)體中不同位置發(fā)揮作用的細(xì)胞、組織、器官[2]。2006年,YAMANAKA[3]將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Sox2、Oct4、Klf4和cMyc)轉(zhuǎn)入成熟體細(xì)胞將后者誘導(dǎo)成類似胚胎干細(xì)胞功能的多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs),即既能自我更新又能各向分化的細(xì)胞類型,這進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于細(xì)胞在多能和分化狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的重要作用。鑒于干細(xì)胞在基礎(chǔ)研究和臨床治療方面的宏大潛能,針對(duì)干細(xì)胞的自我更新、生長(zhǎng)分化的各類研究迅速增長(zhǎng)。作為生命存在基礎(chǔ)的中心法則決定了生命基礎(chǔ)信息的產(chǎn)生,而各類蛋白質(zhì)作為中心法則的一般結(jié)果,其從生成到降解的各個(gè)經(jīng)過(guò)都影響著細(xì)胞生命活動(dòng),這具體表現(xiàn)出在干細(xì)胞里,則對(duì)干細(xì)胞命運(yùn)有著宏大影響[4]?；蚍g得來(lái)的蛋白,經(jīng)翻譯后修飾,在不同的通路和活動(dòng)中動(dòng)態(tài)地調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)各個(gè)機(jī)器的正常運(yùn)轉(zhuǎn),確保了干細(xì)胞對(duì)于環(huán)境中的各類刺激能夠快速響應(yīng)[5],進(jìn)而決定是增殖還是分化。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitinproteasomesystem,UPS)作為生物體內(nèi)主要的蛋白調(diào)節(jié)和代謝系統(tǒng),在干細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用,遭到廣泛關(guān)注[6]。泛素分子是一個(gè)擁有76個(gè)氨基酸的小蛋白質(zhì),能夠以單體形式或多聚鏈形式共價(jià)修飾在蛋白底物上。這種修飾造成的拓?fù)鋵W(xué)的構(gòu)像變化決定了底物后續(xù)命運(yùn),通常底物可能喪失其穩(wěn)定性被蛋白酶體機(jī)器降解、而或者底物與其他分子結(jié)合強(qiáng)弱被改變、又或者在細(xì)胞內(nèi)的定位改變等。泛素化修飾經(jīng)過(guò)通常由3類酶執(zhí)行:E1泛素激活酶、E2泛素聚合酶和E3泛素連接酶。對(duì)于將泛素分子從底物上移去的經(jīng)過(guò)也由一類酶負(fù)責(zé)執(zhí)行,其被稱為去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)。作為泛素化的逆反響經(jīng)過(guò),去泛素化酶在體內(nèi)的作用通常有:(1)幫助未成熟的泛素分子成熟,或從頭翻譯產(chǎn)生泛素分子;(2)通過(guò)其硫酯鍵中間體在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行小的親核反響介入到蛋白的泛素化經(jīng)過(guò);(3)斷裂細(xì)胞中的暫時(shí)無(wú)用多聚泛素鏈,構(gòu)成泛素單體分子;(4)解除底物上連接的泛素分子,去除泛素化對(duì)底物的作用。因而,去泛素化酶也廣泛地介入到蛋白酶體、溶酶體依靠的蛋白降解,基因表示出調(diào)控,細(xì)胞周期調(diào)控,細(xì)胞分裂時(shí)染色體分離,激酶活化,細(xì)胞凋亡,蛋白定位,DNA損傷修復(fù),精子發(fā)生和中間信號(hào)調(diào)節(jié)分子的降解等[7]多種生命活動(dòng)經(jīng)過(guò)中。去泛素化酶介入的上述這些事件,與干細(xì)胞的自我更新、干細(xì)胞蟄伏、細(xì)胞分化等經(jīng)過(guò)也息息相關(guān)[6]。本文將從基因轉(zhuǎn)錄水平去泛素化酶在染色質(zhì)核小體上的修飾對(duì)于多能性基因或細(xì)胞分化相關(guān)基因的抑制或激活,翻譯后修飾水平去泛素化酶對(duì)于核心多能轉(zhuǎn)錄因子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié),以及細(xì)胞水平泛素蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)于干細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞自噬的調(diào)控等方面概括去泛素化酶對(duì)于干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控的重要意義。1、組蛋白去泛素化對(duì)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展為研究者們認(rèn)識(shí)特異性表示出在胚胎干細(xì)胞中或者同時(shí)存在于其他干細(xì)胞種類中的去泛素化酶和E3連接酶的種類提供了研究手段和圖譜[8]。干細(xì)胞若維持干性則需要干細(xì)胞多能性因子的表示出或發(fā)育相關(guān)基因的抑制,具體表現(xiàn)出在染色質(zhì)水平則是遭到一群蛋白分子的調(diào)控?；蚪M雙鏈DNA作為遺傳物質(zhì)載體,在高等真核生物中不是裸露存在的,而是與細(xì)胞核內(nèi)的組蛋白(H1、H2A、H2B、H3、H4)構(gòu)成致密的染色質(zhì)。生物體在染色質(zhì)這個(gè)構(gòu)造平臺(tái)上完成與DNA相關(guān)的生命活動(dòng)。染色質(zhì)的三維構(gòu)造空間和動(dòng)態(tài)變化為某個(gè)基因的表示出提供了時(shí)間和空間上的獨(dú)特性。通常以為,PcG(polycombgroup)和TrxG(trithoraxgroup)蛋白復(fù)合體分別介入了染色質(zhì)的抑制和激活狀態(tài)[9]。這種抑制和激活作用保障了發(fā)育相關(guān)基因不會(huì)在特定時(shí)間和空間外表示出。與甲基化、磷酸化或乙酰化等小尺寸的修飾不同,泛素化修飾將一個(gè)或多個(gè)約8kDa的蛋白共價(jià)結(jié)合在組蛋白上,引起組蛋白構(gòu)像變化,影響了染色質(zhì)的構(gòu)造,進(jìn)而導(dǎo)致基因的表示出調(diào)控遭到影響。干細(xì)胞基因組中,組蛋白的泛素化和去泛素化修飾對(duì)干細(xì)胞染色質(zhì)穩(wěn)態(tài)和基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行著重要調(diào)節(jié)[10]。組蛋白的泛素化通常是單泛素化,泛素化位點(diǎn)具有物種保守性(如H2AK119、H2BK120)。組蛋白H1的泛素連接酶E3通常有環(huán)指蛋白R(shí)NF8和RNF168,主要介入DNA雙鏈斷裂信號(hào)調(diào)控,組蛋白H3的泛素化被以為在核小體的組裝中起作用[11]。如此圖1所示,組蛋白H2A和H2B的泛素化和去泛素化在調(diào)節(jié)基因表示出方面有重要意義[10]。1.1、組蛋白H2A的去泛素化胚胎細(xì)胞發(fā)生發(fā)展經(jīng)過(guò)中,多梳組蛋白(polycombgroup,PcG)亞基PRC1(polycombrepressivecomplex1,PRC1)和PRC2(polycombrepressivecomplex2,PRC2)抑制著細(xì)胞生長(zhǎng)經(jīng)過(guò)中重要的轉(zhuǎn)錄因子基因的表示出,PRC2一般會(huì)在這些基因上產(chǎn)生H3K27me3轉(zhuǎn)錄抑制標(biāo)記,此標(biāo)記不會(huì)自發(fā)引起染色質(zhì)的聚集,但是會(huì)使得其他促進(jìn)染色質(zhì)壓縮的蛋白(如Eed、Cbx)停泊在這個(gè)標(biāo)記上,而Cbx是PRC1復(fù)合體的成分,能夠看出,PRC1的存在促進(jìn)了PRC2對(duì)于染色質(zhì)的壓縮,促進(jìn)異染色質(zhì)構(gòu)成[12]。當(dāng)然,這種異染色質(zhì)化導(dǎo)致的基因抑制除表現(xiàn)為組蛋白甲基化外也同時(shí)存在其他類型的修飾,如磷酸化、糖基化、乙?；约氨疚闹忻枥L敘述的泛素化等[13]。PRC1通過(guò)其亞基RING1A/B(在鼠中)或RING2(在人中)對(duì)組蛋白H2A進(jìn)行單泛素化,抑制干細(xì)胞分化基因的表示出[14]。RING1A和RING1B的缺失會(huì)導(dǎo)致泛素化的H2A大量降低,細(xì)胞喪失胚胎干細(xì)胞特性,形態(tài)改變,趨向于分化。突變Ring1B(也叫Rnf2)引起早期胚胎發(fā)育紊亂,但是通常與其泛素化酶活性的異常無(wú)關(guān),講明RING1A/B在體內(nèi)還存在與其功能相冗余的E3連接酶,過(guò)表示出E3連接酶(如MDM2、TRIM37、DZIP3等)也會(huì)引起H2A的單泛素化水平增加[15]。單泛素化的H2A(表示為ubH2A,后文同)阻礙轉(zhuǎn)錄激活標(biāo)記H3K4me2和H3K4me3的構(gòu)成,而且會(huì)伴隨著基因轉(zhuǎn)錄激活信號(hào)H3K36me2的去甲基化,進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄起始[16],而且在胚胎干細(xì)胞的分化中,多能特異性基因相關(guān)組蛋白上兩種狀態(tài)的修飾(H3K4me3和H3K27me3)變成單狀態(tài)修飾(H3K27me3),多能特異性基因遭到表觀遺傳修飾而沉默[17]。因而,不難理解,H2A的去泛素化酶可能與基因轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。圖1去泛素化酶通過(guò)調(diào)控組蛋白的去泛素化調(diào)節(jié)細(xì)胞干性基因和分化基因表示出Fig.1SchematicrepresentationofthestemcellpluripotencyassociatedgeneordifferentiatedgeneexpressionregulatedbydeubiquitinatesA:分化相關(guān)基因上H2B的泛素化狀態(tài)被去泛素化酶USP44移除,分化基因發(fā)生沉默;而多能性相關(guān)基因組蛋白H2A上的泛素化被去泛素化酶USP22移除,細(xì)胞多能性基因表示出,細(xì)胞的干性得到維持,進(jìn)行自我更新。B:分化相關(guān)基因上組蛋白H2A的泛素化狀態(tài)被去泛素化酶Mysm1和USP16特異性移除,引起分化基因表示出,細(xì)胞分化。A:theubiquitinatedstateofH2Bonthetypicaldifferentiation-relatedgeneswereremovedbythedeubiquitinationenzymeUSP44,andthenthedifferentiationgenesweresilenced;whereastheubiquitinatedhistoneH2Aonthepluripotency-relatedgenesweredeubiquitinatedbyenzymeUSP22,thenthegenesexpressed,thesecellskeeppluripotencyandcanbeself-renewed.B:theubiquitinatedstateofhistoneH2Aonthedifferentiation-relatedgenesisspecificallyremovedbythedeubiquitinationenzymesMysm1andUSP16,causingtheexpressionofdifferentiationgenesandcelldifferentiation.However,theubiquitinatedhistoneH2Bonthepluripotency-relatedgenescouldbereversedbydeubiquitinases,whichcausepluripotency-relatedgenesexpressionandthenthecelldifferentiation.通過(guò)免疫共沉淀的方式方法能夠挑選到很多去泛素化酶分子,尤其是在干性轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子區(qū),表示清楚去泛素化酶影響著干細(xì)胞中染色質(zhì)的組裝和基因表示出[11]。對(duì)于這些去泛素化酶的研究有助于揭示其在染色質(zhì)組裝和干細(xì)胞干性調(diào)節(jié)中的機(jī)制。能夠?qū)bH2A進(jìn)行去泛素化的DUB分子已有一些報(bào)道:如USP16、Mysm1(2A-Dub)、USP21、USP22、USP7、USP11、USP3、BAP1、BRCA36等[18]不同家族的去泛素化酶分子都直接或間接地影響著H2A的泛素化狀態(tài)。如表示出USP16的基因在人21號(hào)染色體上,報(bào)道稱usp16突變是引起唐氏綜合征發(fā)生的原因之一,詳細(xì)可能是由于usp16基因含量增加,導(dǎo)致抑制性的ubH2A含量減少,分化基因表示出,細(xì)胞分化,引起個(gè)體早衰。YANG等[19]發(fā)現(xiàn),USP16缺失的ESCs中,由于不能引起相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因上的ubH2A去泛素化而不能進(jìn)行細(xì)胞分化,外源輸入有活性的USP16能夠拯救USP16缺陷導(dǎo)致的ESCs分化失敗現(xiàn)象。間接調(diào)節(jié)ubH2A的去泛素化酶如USP7和USP11可通過(guò)調(diào)節(jié)PRC1的含量,影響H2A的泛素化[20]。有趣的是,去泛素化酶USP26能夠去泛素化穩(wěn)定PRC1復(fù)合體的組分CBX4和CBX6,進(jìn)而促進(jìn)H2A的泛素化,導(dǎo)致多能性因子Sox2和Nanog的表示出被抑制,負(fù)性調(diào)控iPSC的重編程[21]。ZHAO等[22]發(fā)現(xiàn),組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferases,HAT)復(fù)合體具有在基因位點(diǎn)處松弛染色質(zhì)的功能,而這一功能的實(shí)現(xiàn)借助于2mDa的GCN5含HAT的TFTC/STAGA復(fù)合體,此復(fù)合體中含有額外的共激活亞基ATXN7L3、USP22和ENY2,均是H2A、H2B的去泛素化酶,去泛素化酶聯(lián)合HATTFTC/STAGA復(fù)合體中其他成分一起對(duì)抗沉默的異染色質(zhì),和細(xì)胞核受體分子一起激活基因的轉(zhuǎn)錄。去泛素化酶還能夠通過(guò)穩(wěn)定H2A穩(wěn)定干性因子的表示出,Mysm1是金屬蛋白酶家族的去泛素化酶,研究表示清楚Mysm1通過(guò)其ubH2A去泛素化酶活性促進(jìn)雄激素受體靶向基因的表示出,若敲除Mysm1基因,小鼠的造血干細(xì)胞維持、自我更新和分化均遭到影響[23]。泛素C末端水解酶BAP1是一個(gè)多功能酶,也具有ubH2A去泛素化酶活性,然而BAP1針對(duì)ubH2A的去泛素化酶活性在這個(gè)多功能酶復(fù)合體中的作用仍不清楚[18]。USP21對(duì)ubH2AK119的去泛素化促進(jìn)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的激活,促進(jìn)肝臟再生[16]。ubH2A在細(xì)胞中這種抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用,表示清楚了其對(duì)于干細(xì)胞多能性維持是有利的,但是在去泛素化酶Mysm1的研究中,似乎ubH2A對(duì)于造血干細(xì)胞的穩(wěn)定起到抑制作用。生物體是一個(gè)高度活潑踴躍和動(dòng)態(tài)變化的有序機(jī)體,每一種狀態(tài)都遭到精到準(zhǔn)確的調(diào)控,弄清楚其發(fā)生的機(jī)制有利于我們更好地理解和解決由這些經(jīng)過(guò)紊亂導(dǎo)致的疾病。1.2、組蛋白H2B的泛素化與H2A的泛素化相反,組蛋白H2B的泛素化與基因的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。研究人員通過(guò)ChIP-on-chip技術(shù)揭示,H2B的單泛素化主要集中在一些高頻表示出的基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)[24]。人RNF20/RNF40復(fù)合體是組蛋白H2B的泛素連接酶,組蛋白H2B的泛素化會(huì)增加H3K4或H3K79甲基化的水平,促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄,泛素化的H2B使得染色質(zhì)中H2B和H2A構(gòu)成二元復(fù)合物,被RNA聚合酶II替代,促進(jìn)RNA聚合酶II在DNA上的轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)[25]。而且ubH2B也是催化H3K4me2/me3標(biāo)志構(gòu)成的COMPASS復(fù)合體(為TrxG蛋白復(fù)合體的一種成員)的組成成分,一般以為COMPASS復(fù)合體的作用就是促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活。誘導(dǎo)H2BK123泛素化會(huì)抑制COMPASS作用,阻礙H3K4me2/me3的構(gòu)成。上述證據(jù)表示清楚,ubH2B有助于基因的轉(zhuǎn)錄活化。除此之外,H2B的單泛素化也是H3K27乙?；?基因表示出標(biāo)志)的前提條件[26],在PRC1沒有被招募時(shí),H3K27的去甲基化酶UTX抑制PRC1的招募,而在PRC1被招募以后,UTX仍然能夠減少PRC1對(duì)H2A的單泛素化修飾,表示清楚了UTX能夠促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)UTX表示出量下調(diào)時(shí),PRC1復(fù)合體中RINGfinger成分(Bim1和Ring1A蛋白)升高,伴隨著HOX基因處H2A單泛素化水平升高[26],基因轉(zhuǎn)錄被抑制。泛素化H2A和H2B的這種協(xié)同互作對(duì)于基因的精細(xì)調(diào)控意義重大。ubH2B促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄依靠于去泛素化酶,如在酵母中,去泛素化酶Ubp8是SAGA乙?；D(zhuǎn)移酶復(fù)合體的成分,能夠去泛素化ubH2B,建立正確的組蛋白甲基化H3K4me和H3K36me形式,一般以為在建立了H3K4me和H3K36me后,招募染色體重塑因子、組蛋白乙?；蛉ヒ阴；敢约敖M蛋白去甲基化酶,隨后DNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄延伸。然而,也有研究表示清楚,H2B的單泛素化也會(huì)抑制基因的表示出,如酵母中另一個(gè)去泛素化酶Ubp10也能對(duì)ubH2B進(jìn)行去泛素化,但Ubp10通常在染色質(zhì)沉默位點(diǎn)維持低水平的H2Bub1和H3K4me/H3K79me,H3K79me3也是端粒酶和核糖體RNA聚集位點(diǎn),Ubp10通過(guò)調(diào)節(jié)泛素化H2B維持轉(zhuǎn)錄抑制性染色質(zhì)狀態(tài)[27]。而ubH2B的作用不僅僅在于構(gòu)成正確的H3K4me構(gòu)造,還會(huì)促進(jìn)染色質(zhì)開放,使染色質(zhì)構(gòu)造開放,調(diào)節(jié)核小體的組裝和去組裝,促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[28]。所以,能夠看出ubH2B的E3和DUB分子對(duì)于基因的激活都是必需的,也表示清楚組蛋白H2B的泛素化去泛素化的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于基因的表示出非常重要。去泛素化酶USP22、USP44和USP7是細(xì)胞中反向調(diào)控H2B泛素化的去泛素化分子。USP22在基因啟動(dòng)子上完成ubH2B的去泛素化,調(diào)節(jié)雌雄激素受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄[29]。在腫瘤干細(xì)胞中USP22還介入cMyc靶基因的激活[30]。證明了ubH2B在某些情況下也會(huì)介導(dǎo)基因的沉默,其去泛素化酶則調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄激活。USP22是轉(zhuǎn)錄復(fù)合體SAGA的亞基,也是Ubp8的同源蛋白,SUSSMAN等[31]研究發(fā)現(xiàn),USP22對(duì)于胚胎干細(xì)胞向三胚層分化有調(diào)節(jié)作用,USP22抑制Sox2位點(diǎn)基因的轉(zhuǎn)錄,并且以為這種抑制作用與USP22對(duì)Sox2啟動(dòng)子處ubH2BK200的去泛素化相關(guān)。USP44通過(guò)介導(dǎo)H2B的去泛素化,導(dǎo)致分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄沉默,維持干細(xì)胞干性狀態(tài)[32]。USP7作為H2B的去泛素化酶,通常也被以為是PRC1復(fù)合體的組成部分,控制著H2A的泛素化水平。USP7能夠催化H2B的去泛素化,也能和PRC1復(fù)合體互相作用調(diào)控同源異型基因的沉默[33]。去泛素化酶對(duì)于核小體組蛋白H2A和H2B的這種泛素動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)對(duì)于基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞命運(yùn)決定起著不可或缺的作用,保證了正常生命活動(dòng)的進(jìn)展。2、去泛素化酶對(duì)干細(xì)胞特性的調(diào)控干細(xì)胞兩大特性(即自我更新和多向分化)的發(fā)生很大程度上取決于干細(xì)胞多能性因子或者分化傾向因子的表示出及抑制狀態(tài)之間的平衡作用。而生命體中對(duì)干細(xì)胞因子表示出的調(diào)節(jié)一般在兩個(gè)方面:基因表示出層面干細(xì)胞多能性基因及其調(diào)控基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯;蛋白質(zhì)層面包括翻譯后修飾的加工以及隨后的蛋白降解經(jīng)過(guò)。2.1、去泛素化酶對(duì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控轉(zhuǎn)錄翻譯及基因表示出層面的調(diào)控具體表現(xiàn)出在信號(hào)通路中遭到一些信號(hào)分子的刺激;翻譯后修飾(post-translationalmodifications,PTMs)通過(guò)對(duì)蛋白合成后的再加工,調(diào)控著細(xì)胞生理經(jīng)過(guò)。蛋白的翻譯后修飾牽涉到生命活動(dòng)的各方面。在干細(xì)胞調(diào)控中,磷酸化、乙?；?、甲基化、sumo化、泛素化修飾等協(xié)調(diào)互作,保證了細(xì)胞特性的維持或轉(zhuǎn)換。假如把各類修飾比喻成化裝師,則各類修飾作用的底物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子是站在舞臺(tái)表演的演員,而整個(gè)細(xì)胞乃至個(gè)體的生命經(jīng)過(guò)則是這場(chǎng)浩大的劇目。各類翻譯后修飾中,干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的降解主要遭到蛋白代謝通路之一泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitinproteasomesystem,UPS)的調(diào)控,通過(guò)泛素化降解或構(gòu)像變化而發(fā)揮不同的作用。決定細(xì)胞的多能性狀態(tài)(分為穩(wěn)定多能狀態(tài),預(yù)分化多能狀態(tài))或者誘導(dǎo)干細(xì)胞走向分化的轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)也遭到去泛素化酶的精細(xì)調(diào)節(jié)(圖2)。下面將詳細(xì)展開描繪敘述去泛素化酶對(duì)主要的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。2.1.1、NanogNanog在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中是調(diào)控多能性的重要分子,在沒有白細(xì)胞抑制因子LIF和轉(zhuǎn)錄因子STAT3的情況下能夠維持干細(xì)胞的自我更新,Nanog與其他的干細(xì)胞多能性因子Sox2和Oct4能夠構(gòu)成正負(fù)反應(yīng)通路共同調(diào)節(jié)著干細(xì)胞的多能性,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)Nanog的表示出調(diào)控對(duì)于維持生物的正常生長(zhǎng)特別重要,缺乏或下調(diào)Nanog的表示出將導(dǎo)致干細(xì)胞分化[34]。在Nanog序列構(gòu)造N-端47～72位有一個(gè)PEST的序列(包含多個(gè)P、E、S、T氨基酸),通常會(huì)招募泛素化酶對(duì)其泛素化隨后經(jīng)蛋白酶體降解,人胚胎干細(xì)胞中Nanog的半衰期在120min[35]。研究表示清楚,泛素連接酶FBXW8(含F(xiàn)框和WD40域的蛋白8)會(huì)對(duì)Nanog進(jìn)行多聚泛素化引起其含量降低,導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞分化[36]。細(xì)胞中還存在一些穩(wěn)定Nanog水平的去泛素化酶。本課題組與其他的一些研究組[37,38,39]均發(fā)現(xiàn),去泛素化酶USP21能夠通過(guò)去除Nanog上的泛素分子信號(hào),穩(wěn)定多能干細(xì)胞中Nanog的水平,維持干細(xì)胞的多能性狀態(tài)。華而不實(shí),JIN等[38]的研究顯示,USP21不僅在翻譯后修飾階段通過(guò)去泛素化穩(wěn)定Nanog蛋白水平外,還能夠在轉(zhuǎn)錄水平在Nanog的引導(dǎo)下調(diào)節(jié)H2A的去泛素化,增加組蛋白H3K4三甲基化(H3K4me3)的水平,正向促進(jìn)Nanog的轉(zhuǎn)錄,增加干細(xì)胞中的Nanog含量。更有趣的是,ESCs中的LIF/STAT3信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)USP21的表示出,當(dāng)沒有LIF時(shí),細(xì)胞分化刺激信號(hào)激活ERKs通路引起USP21和Nanog磷酸化,磷酸化的USP21對(duì)Nanog不能再起穩(wěn)定作用,導(dǎo)致Nanog被泛素蛋白酶體途徑降解?？梢?細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境中的各類信息通過(guò)刺激信號(hào)通路的激活或關(guān)閉,影響著細(xì)胞內(nèi)蛋白的調(diào)節(jié)作用,精細(xì)調(diào)控著干細(xì)胞的狀態(tài)。然而,盡管ESCs中敲除USP21導(dǎo)致細(xì)胞分化,但是USP21基因敲除小鼠的各類發(fā)育和生命活動(dòng)未見影響,一方面表示清楚了細(xì)胞層面和組織個(gè)體層面存在一定的差異性;另一方面可以能是去泛素化酶的代償性功能冗余,在體內(nèi)可能存在一些其他的去泛素化酶與USP21有功能穿插。除胚胎干細(xì)胞外,OH等[40]的研究表示清楚,在乳腺干細(xì)胞生長(zhǎng)分化經(jīng)過(guò)中,USP34是上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換的負(fù)調(diào)控子,在乳腺干細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)中,USP34表示出水平較低,而且USP34的敲除使得乳腺細(xì)胞成球能力提升,并且伴隨著Nanog、Oct4和Sox2水平的升高,細(xì)胞的干性加強(qiáng)。尋找和鑒定生物體內(nèi)Nanog的去泛素化酶有利于對(duì)干細(xì)胞的特性進(jìn)行更深層的分析和理解。圖2去泛素化酶調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性和自我更新示意圖Fig.2Schematicrepresentationofthestemcellpluripotencyandself-renewalregulatedbydeubiquitinateA:干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子被去泛素化酶穩(wěn)定后,調(diào)節(jié)干性維持相關(guān)基因的表示出,使細(xì)胞只發(fā)生自我更新。B:在沒有去泛素化酶穩(wěn)定多能性因子的情況下,細(xì)胞分化相關(guān)基因表示出,細(xì)胞趨向分化。A:thetranscriptionalfactorswerestabilizedbydeubiquitinateandpromotedtheexpressionofstemcellpluripotentgene,keepingthestemcellself-renewalonly.B:whereasthedifferentiatedgeneswereexpressedanddifferentiatedcellswereproducedwithoutthedeubiquitinatestostablizethetranscriptionalfactors.2.1.2、Sox2Sox2是蛋白構(gòu)造和序列與Y染色體性別決定域(sex-determiningregionofchromosomeY,SRY)蛋白極為類似的一個(gè)大家族成員。Sox2可與Oct4、Klf4、cMyc一起將成熟的終末分化細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成多能干細(xì)胞,重建細(xì)胞多能性[3]。Sox2是維持iPSCs、ESCs和NSCs干性的細(xì)胞外表標(biāo)志物,也是調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和ESC分化的重要分子之一,同時(shí)Sox2能夠使iPSC和ESCs分化至神經(jīng)干細(xì)胞[41],可見這個(gè)分子在干細(xì)胞命運(yùn)決定中的關(guān)鍵地位。Sox2包含高度可變區(qū)(highmobilitygroup,HMG)能夠與堿基A、T豐富的序列構(gòu)成L型結(jié)合外表,這種L型外表導(dǎo)致了DNA的彎曲,介入了基因的轉(zhuǎn)錄激活。高度可變區(qū)的一些區(qū)域與其C末端的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。Sox2的活性遭到多種翻譯后修飾的聯(lián)合調(diào)控,Sox2T118位點(diǎn)的磷酸化是由Akt1介導(dǎo)的,而Sox2K119的甲基化是由Set7介導(dǎo)的,WWP2則是Sox2的泛素化酶,Akt1抑制WWP2對(duì)Sox2的泛素化作用,而Set7能夠促進(jìn)WWP2的泛素化作用;干性狀態(tài)時(shí),Akt1的作用超過(guò)Set7的作用,當(dāng)細(xì)胞分化時(shí),Set7表示出量上調(diào),引起Sox2降解,細(xì)胞分化[42]。Sox2對(duì)干細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)影響具體表現(xiàn)出為干細(xì)胞需要維持干性狀態(tài)時(shí),Sox2與Oct4構(gòu)成異源二聚體激活干性基因的表示出,抑制分化基因表示出;而細(xì)胞需要分化時(shí),Sox2、Oct4解體,Sox2與其他蛋白互相作用,調(diào)節(jié)一系列分化基因的表示出[43]。Sox2引起的細(xì)胞分化有1200多個(gè)基因的介入,Oct4和Sox2正向反應(yīng)調(diào)節(jié)相互的活性,穩(wěn)定了細(xì)胞的多能性狀態(tài)[44]。細(xì)胞中也存在著一些去泛素化酶來(lái)直接或間接地調(diào)節(jié)干細(xì)胞狀態(tài)。如上文中提到過(guò),USP22能夠調(diào)節(jié)ubH2B的去泛素化,干細(xì)胞中其結(jié)果是導(dǎo)致Sox2基因表示出的抑制,而引起干細(xì)胞向三胚層分化的發(fā)生[31]。USP22可結(jié)合在Sox2基因的啟動(dòng)子區(qū),去除Sox2基因啟動(dòng)子區(qū)被RNF20泛素化的ubH2B上的泛素標(biāo)記,引起Sox2基因轉(zhuǎn)錄失活。Sox2基因啟動(dòng)子的再次開放則需要移除USP22,阻斷Sox2的表示出能夠拯救USP22缺失引起的細(xì)胞不能分化的表型,消耗USP22能夠增加Sox2的含量,Sox2調(diào)控的下游Nanog的表示出量也會(huì)增加,但是Oct4的水平不變。在Sox2的基因啟動(dòng)子區(qū),USP22的存在使得核小體變得更為致密,USP22底物ubH2B的含量降低,表示清楚Sox2在USP22作用的下游,且USP22是在轉(zhuǎn)錄翻譯層面調(diào)節(jié)著Sox2的水平,影響著干細(xì)胞的狀態(tài)[31]。WEI等[45]研究發(fā)現(xiàn),干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子BTB和CNC同源1蛋白(BTBdomainandcnchomolog1,BACH1)能夠招募去泛素化酶USP7,穩(wěn)定干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Nanog、Sox2、Oct4在細(xì)胞中的水平,穩(wěn)定干細(xì)胞的多能性狀態(tài)。去泛素化酶USP9x可直接作用于Sox2,穩(wěn)定Sox2的水平,促進(jìn)細(xì)胞的增殖。USP2、USP14對(duì)Sox2的蛋白水平也有影響。在一些針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析中(表1),檢測(cè)出USP15、USP24、USP34、USP37和USP49等都與Sox2有互相作用,但是在干細(xì)胞中發(fā)揮作用的去泛素化酶的報(bào)道不多。近來(lái),本課題組[46]研究發(fā)現(xiàn),OTU家族去泛素化酶OTUD7B能夠?qū)UL4ADET1-COP1引起的Sox2的多聚泛素化進(jìn)行去泛素化,穩(wěn)定了神經(jīng)祖細(xì)胞(neuralprogenitorcells,NPCs)中Sox2蛋白含量,維持了NPCs的干性,阻止了分化發(fā)生。能否還存在其他去泛素化酶分子通過(guò)Sox2影響細(xì)胞的干性維持或分化選擇仍然需要進(jìn)一步探究。2.1.3、cMyccMyc是重編程誘導(dǎo)分子,介入直接激活多能性標(biāo)志物,在細(xì)胞中的作用是保持mESC干細(xì)胞狀態(tài)。cMyc的生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)介入細(xì)胞增殖的靶基因。除了轉(zhuǎn)錄水平上控制cMyc分子含量,cMyc含量和功能也遭到轉(zhuǎn)錄后修飾水平的調(diào)節(jié)。由GSK-3介導(dǎo)的cMyc的保守構(gòu)造BoxI位點(diǎn)中Thr58和Ser62位點(diǎn)的磷酸化修飾會(huì)進(jìn)一步招募SCFFBXW7對(duì)cMyc進(jìn)行泛素化,引起隨后的蛋白降解[47]。在神經(jīng)干細(xì)胞分化中,cMyc起著重要作用,cMyc通常被泛素連接酶TRIM32泛素化降解,引起干細(xì)胞的神經(jīng)系分化。因而在神經(jīng)生成的經(jīng)過(guò)中伴隨著TRIM32水平的升高,同時(shí)TRIM32從成神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至神經(jīng)元的細(xì)胞核。然而,在神經(jīng)組織中有一類增殖細(xì)胞C其細(xì)胞核中已經(jīng)含有TRIM32但是卻不向神經(jīng)方向分化,在增殖細(xì)胞C中cMyc能夠被TRIM32泛素化降解,研究者通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)挑選出去泛素化酶USP7與cMyc的穩(wěn)定相關(guān),發(fā)現(xiàn)正是由于細(xì)胞中存在的去泛素化酶USP7能夠去除cMyc的泛素化,進(jìn)而穩(wěn)定了神經(jīng)干細(xì)胞[48]。而且作者發(fā)現(xiàn)抑制USP7的功能,神經(jīng)干細(xì)胞的另一重要標(biāo)志物Sox2的表示出水平也下降了,提示USP7在神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖中有重要作用。SUN等[49]發(fā)現(xiàn),USP36能夠在細(xì)胞核內(nèi)去泛素化cMyc穩(wěn)定本身水平,而且cMyc會(huì)靶向調(diào)控USP36的表示出,兩者構(gòu)成正向反應(yīng)循環(huán),可見細(xì)胞中存在不同定位的去泛素化酶調(diào)節(jié)著cMyc的水平。進(jìn)一步地,有研究表示清楚USP28[50]也被以為是cMyc的去泛素化酶,能夠通過(guò)去泛素化解除Fbw7對(duì)cMyc的泛素化作用,穩(wěn)定cMyc的水平,但是與USP7和USP36不同,USP28的這種去泛素化作用是在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生的,而且研究的是在肺癌中的USP28的去泛素化作用。同樣地,USP13能夠拮抗FBXL14對(duì)cMyc的泛素化,維持膠質(zhì)細(xì)胞瘤干細(xì)胞的干性生長(zhǎng)[51]。PAN等[52]發(fā)現(xiàn),cMyc可以以被USP37穩(wěn)定,而且USP37幫助癌細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境。除此之外,去泛素化酶USP22也被以為是cMyc的輔助因子,調(diào)節(jié)cMyc靶向基因的轉(zhuǎn)錄[31],與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。2.1.4、Oct4Oct4在調(diào)節(jié)多能性ESCs的命運(yùn)和多能干細(xì)胞的重編程中發(fā)揮重要作用。Oct4含有一個(gè)N-端激活域、一個(gè)POU域、一個(gè)C-端激活域。POU域包含2個(gè)構(gòu)造上獨(dú)立的DNA結(jié)合域(NH2末端POUS域和C末端POUH域),Oct4依靠本身獨(dú)特的構(gòu)像既能與其他轉(zhuǎn)錄因子一起構(gòu)成異二聚體和也能與DNA序列一起構(gòu)成同二聚體。其POU域?qū)τ贠ct4的細(xì)胞質(zhì)定位是必須的,Oct4有5個(gè)賴氨酸殘基介導(dǎo)E3泛素連接酶的辨別和泛素分子的連接[53]。Oct4的過(guò)表示出會(huì)促進(jìn)細(xì)胞分化到內(nèi)胚層和中胚層,Oct4的表示出下降時(shí)促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向外胚層的分化[44]。表1轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)去泛素化酶匯總綜合來(lái)看,泛素連接酶FBXW8和ITCH主要在細(xì)胞處于多能性狀態(tài)時(shí)調(diào)控Oct4的豐度,而WWP2、DPF2、TRIM6是在細(xì)胞開場(chǎng)分化時(shí)發(fā)揮作用[53]。例如,WWP2作為Oct4的泛素化酶以劑量依靠的方式介導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化[54],在干細(xì)胞維持干性自我更新時(shí),WWP2不影響Oct4的表示出,但是當(dāng)細(xì)胞需要分化時(shí),WWP2就會(huì)發(fā)揮降低Oct4水平的功能,促進(jìn)細(xì)胞退出多能性狀態(tài)進(jìn)入分化狀態(tài)[54]。類似地,TRIM家族的成員TRIM6在干細(xì)胞處于多能性狀態(tài)時(shí)不影響cMyc的表示出水平,然而TRIM6會(huì)影響Oct4的轉(zhuǎn)錄水平[55]。BAHNASSAWY等[56]研究發(fā)現(xiàn),TRIM32也能夠調(diào)節(jié)Oct4的泛素化,TRIM-NHL家族的其他成員在調(diào)節(jié)細(xì)胞多能性和重編程中的作用也已經(jīng)有所報(bào)道,所以TRIM32在干細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞的多能性缺乏為奇。類似Sox2對(duì)干細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)節(jié),Oct4水平的波動(dòng)均會(huì)影響干細(xì)胞的干性[53],因而,去泛素化酶對(duì)這些經(jīng)過(guò)的精到準(zhǔn)確控制對(duì)于干細(xì)胞的狀態(tài)轉(zhuǎn)換是非常關(guān)鍵的。在ESCs的分化經(jīng)過(guò)中,USP34/44是調(diào)節(jié)Oct4的去泛素化酶,但是兩者調(diào)節(jié)作用下Oct4的含量波動(dòng)是朝著不同方向變化的。USP34的缺失促進(jìn)Oct4的水平增加[40],而USP44的缺失則導(dǎo)致Oct4的水平下降[32]。能夠看出USP34和USP44在胚胎干細(xì)胞的干性維持方面的功能是反向的,而且Oct4并非兩者的直接底物,進(jìn)一步證實(shí)了去泛素化酶在干細(xì)胞調(diào)控經(jīng)過(guò)中的多態(tài)性和復(fù)雜性。另一項(xiàng)研究顯示,去泛素化酶PSMD14作為26S蛋白酶體亞基19S的成分,在多能干細(xì)胞中也有高表示出,其表示出含量的下降會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中Oct4表示出水平的降低,引起干細(xì)胞形態(tài)異常和細(xì)胞分化的發(fā)生。降低PSMD14的表示出,導(dǎo)致蛋白酶體活性喪失,引起K48和K63型的多聚泛素化蛋白聚集,Oct4的表示出丟失,ESC分化。去泛素化酶PSMD14通過(guò)去泛素化作用幫助蛋白酶體活性的維持,保證細(xì)胞干性,同時(shí)保證成熟體細(xì)胞重編程的效率[8],但是Oct4能否是PSMD14的直接底物尚不清楚。直接作用于Oct4的去泛素化酶還有待研究和鑒定,但是毋容置疑,這類工作是有重要意義的。2.1.5、Klf4Klf4是保守的鋅指轉(zhuǎn)錄因子,與多能轉(zhuǎn)錄因子互相作用,調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多能性狀態(tài)和重編程。持續(xù)性表示出Klf4抑制ESCs的分化,因而細(xì)胞的分化事件發(fā)生需要降低Klf4的表示出量[57]。同源敲除klf4基因遠(yuǎn)端加強(qiáng)子引起Klf4轉(zhuǎn)錄本減少17倍,但是其蛋白水平只減少不到2倍,可見對(duì)Klf4在轉(zhuǎn)錄后的控制超過(guò)了轉(zhuǎn)錄水平[58]。Klf4因子比擬穩(wěn)定,半衰期超過(guò)了24h,因而轉(zhuǎn)錄水平上應(yīng)對(duì)其含量變化進(jìn)行的調(diào)節(jié)不敏感。但其穩(wěn)定性與所處環(huán)境相關(guān),細(xì)胞需要分化時(shí),針對(duì)Klf4的翻譯后修飾使其穩(wěn)定性下降,半衰期下降到2h下面,細(xì)胞退出多能狀態(tài)[59]。在人的ESC和iPSCs細(xì)胞中都能夠發(fā)現(xiàn)高水平的USP22,而且Klf4會(huì)被同時(shí)招募至usp22的啟動(dòng)子區(qū),結(jié)合H3K4me3,啟動(dòng)usp22基因的轉(zhuǎn)錄,而轉(zhuǎn)錄翻譯出來(lái)的USP22能夠促進(jìn)cMyc的表示出,抑制Sox2的表示出,可見Klf4不僅能夠調(diào)控干細(xì)胞多能性基因可以以通過(guò)調(diào)控去泛素化酶的基因表示出,調(diào)節(jié)干細(xì)胞的狀態(tài)[31]。本課題組鑒定出在肺癌發(fā)生中,去泛素化酶USP10是Klf4的特異性去泛素化酶[60],然而在干細(xì)胞中直接去泛素化Klf4的去泛素化酶分子還未有報(bào)道,需進(jìn)一步研究。將調(diào)控上述5種轉(zhuǎn)錄因子的去泛素酶進(jìn)行總結(jié)和梳理后(表1),能夠看到盡管已有部分去泛素化酶直接(dirctly)或間接地(indirectly)以正面的(positive)保衛(wèi)作用或負(fù)面的(negative)降解作用調(diào)控各類轉(zhuǎn)錄因子的含量和表示出,該領(lǐng)域仍然存在大量空白有待被挖掘和研究。2.2、去泛素化酶通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期影響干細(xì)胞的分化維持細(xì)胞周期的靜止是各類組織、器官、細(xì)胞以及哺乳動(dòng)物造血干細(xì)胞抵抗外界壓力的有效防御手段[65]。在大多數(shù)體細(xì)胞中,細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展需要細(xì)胞周期蛋白(cyclins)等促有絲分裂活性的激酶復(fù)合體對(duì)Rb蛋白(retinoblastomaprotein,Rb)進(jìn)行磷酸化,如CDK4-cyclinD和CDK2-cyclinE激酶復(fù)合體等。當(dāng)小鼠ESCs遭到持續(xù)的MAPK信號(hào)激活后,其持續(xù)表示出的CDK2-cyclinE持續(xù)磷酸化Rb,ESCs也就能跨越G1到S期的轉(zhuǎn)化,持續(xù)自我更新。而在多能干細(xì)胞進(jìn)行分化時(shí),G1期顯著延長(zhǎng),所以細(xì)胞不再自我更新。小鼠干細(xì)胞有著極短的細(xì)胞周期進(jìn)程和迅速的G1期跨越,其原因可能是為了避免細(xì)胞感悟外在環(huán)境中的分化信號(hào),維持多能性狀態(tài)[66]。而且,在選擇用于重編程獲得iPSC的成體細(xì)胞時(shí),分化經(jīng)過(guò)中離干細(xì)胞更近的細(xì)胞以及細(xì)胞周期進(jìn)展快的細(xì)胞會(huì)更有優(yōu)勢(shì),而且,實(shí)驗(yàn)表示清楚可通過(guò)抑制p53/p21通路或者外源表示出Lin28來(lái)加快細(xì)胞周期進(jìn)行,增加成纖維細(xì)胞向iPSC轉(zhuǎn)換的速度。除此之外,cMyc在促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展中的角色也為其能夠促進(jìn)細(xì)胞重編程效率的作用提供了一種機(jī)制上的支撐[67]。在細(xì)胞分裂時(shí),細(xì)胞分裂周期蛋白25磷酸酶家族(CDC25A、B、C)負(fù)責(zé)移除細(xì)胞周期依靠激酶(cyclin-dependentkinases,CDK2)催化位點(diǎn)處的抑制性磷酸化信號(hào),使得CDK2活化以調(diào)控G1/S和G2/M細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換。比照小鼠的其他細(xì)胞類型,CDC25A在胚胎干細(xì)胞中的表示出含量更高層次,表示清楚了其可能主要負(fù)責(zé)非典型的G1/S期的轉(zhuǎn)換。而CDC25A蛋白豐度主要遭到多聚泛素化和蛋白酶降解的影響,如去泛素化酶DUB3(也被稱為USP17L2)能夠通過(guò)去泛素化穩(wěn)定CDC25A的蛋白量(圖3)。胚胎干細(xì)胞中去泛素化酶DUB3的表示出使得G1期的時(shí)長(zhǎng)維持在較短的水平,保證干細(xì)胞的自我更新。盡管還有4種介入CDC25A穩(wěn)定性的去泛素化酶USP13、29、48和Dub2A,華而不實(shí)只要USP48的mRNA水平在細(xì)胞分化經(jīng)過(guò)中顯著降低,但是其表示出水平仍然很高直到分化期末[68]。DUB3在細(xì)胞中與USP48的功能能否冗余還需要進(jìn)行驗(yàn)證。在形式生物果蠅中,Bam與Otu發(fā)揮協(xié)同作用負(fù)性調(diào)節(jié)CycA的泛素化,導(dǎo)致CycA在生殖干細(xì)胞(germlinestemcells,GSCs)中的積累,進(jìn)而引起細(xì)胞向生殖細(xì)胞的分化。而且Bam和Otu是和其他成分一起構(gòu)成了去泛素化酶復(fù)合體完成的CycA的去泛素化[69]。圖3DUB3含量變化重塑細(xì)胞周期和干細(xì)胞譜系選擇Fig.3ThedosageofDUB3regulatethecell-cycleremodelingandlineagecommitmentofpluripotentstemcellsA:高劑量DUB3使得細(xì)胞維持自我更新和多能性。B:DUB3含量下降時(shí),細(xì)胞G1期延長(zhǎng),細(xì)胞發(fā)生分化。向上短箭頭表示去泛素化酶含量上升,而向下短箭頭表示去泛素化酶含量下降,順時(shí)針箭頭表示細(xì)胞周期反向,箭頭上標(biāo)記叉號(hào)代表不能對(duì)底物進(jìn)行磷酸化。A:ahighlevelofDUB3madethecellpronetobeself-renewalandpluripotencymaintenance.B:whenthelevelofDUB3decreased,theG1phaseexpandedandcelldifferentiated.Shortupwardarrowindicatesanincreaseinthecontentofdeubiquitinase,ashortdownwardarrowindicatesadecreaseindeubiquitinasecontent,aclockwisearrowindicatestheorientationofcellcycle,andacrossonthearrowindicatesthattheprocesseswereinhibited.除此之外,CDC20是E3連接酶后期促進(jìn)復(fù)合體或細(xì)胞周期體(anaphasepromotingcomplexorcyclosome,APC/C)的共激活分子,能夠促進(jìn)多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子的降解。而USP44是CDC20的去泛素化酶,USP44的活性對(duì)于調(diào)節(jié)紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)和有絲分裂后期染色體的正確分離特別重要。只要存在未連接的動(dòng)粒,CDC20就附著在有絲分裂紡錘體組裝檢點(diǎn)蛋白MAD2上,此時(shí)APC/C不能被激活,當(dāng)CDC20被APC/C泛素化后,會(huì)從MAD2上釋放,激活A(yù)PC/C。USP44逆轉(zhuǎn)了APC/C對(duì)CDC20的作用,保證檢查點(diǎn)正常完成工作。APC/C泛素活性和USP44的去泛素化活性控制著細(xì)胞周期的進(jìn)程[70],而在前文中,USP44還能夠介導(dǎo)核小體組蛋白H2B的去泛素化,導(dǎo)致分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的沉默,維持干細(xì)胞干性狀態(tài)[32]。這些方面的調(diào)控對(duì)于干細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控也具有重要意義。所以,去泛素化酶能夠通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程來(lái)調(diào)控細(xì)胞的命運(yùn),能夠幫助我們更好地研究和理解干細(xì)胞的生命活動(dòng)。2.3、去泛素化酶對(duì)干細(xì)胞內(nèi)自噬調(diào)控與干細(xì)胞生長(zhǎng)分化的關(guān)系自噬是真核生物高度保守的溶酶體介導(dǎo)的催化經(jīng)過(guò),最初是由于細(xì)胞在壓力條件下對(duì)于能量和本身代謝的需求而出現(xiàn)的大規(guī)模降解經(jīng)過(guò)。在機(jī)體需要大量的細(xì)胞重建活動(dòng),如胚胎生成、細(xì)胞分化或者細(xì)胞重編程等事件發(fā)生經(jīng)過(guò)中,自噬的調(diào)控作用非常關(guān)鍵[71]。胚胎干細(xì)胞內(nèi)的高度自噬活動(dòng)保證了細(xì)胞因高速增殖和自我更新而需要的較高的代謝速率,在Atg3敲除的鼠ESC中,自噬功能的缺失導(dǎo)致了細(xì)胞不能移除線粒體,其多能性下降[72]。EPG5是真核生物特異性的一種自噬調(diào)節(jié)分子,能夠介導(dǎo)自噬體和溶酶體的融合,在ESCs中高度表示出,促進(jìn)ESC的特性維持,而去泛素化酶USP8結(jié)合在EPG5的線圈線圈連接區(qū)將移去其非經(jīng)典的K252處的K63泛素鏈,使得EPG5與LC3的互相作用加強(qiáng)[73]。這種互相作用阻止了ESC中的自噬經(jīng)過(guò),維持了ESC的干性。CHEN等[74]發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)時(shí),細(xì)胞內(nèi)的USP44表示出升高,使ubH2B去泛素化,導(dǎo)致調(diào)控細(xì)胞自噬的基因轉(zhuǎn)錄激活,促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生,有利于維持干細(xì)胞的干性。在iPSC細(xì)胞中,細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2結(jié)合在mTOR啟動(dòng)子的抑制性區(qū)域,招募NuRD復(fù)合體介導(dǎo)mTOR的轉(zhuǎn)錄抑制[75],促進(jìn)細(xì)胞的自噬發(fā)生,影響重編程經(jīng)過(guò)。Sox2的去泛素化酶能否會(huì)通過(guò)自噬經(jīng)過(guò)影響iPSC的重編程仍然需要進(jìn)行研究。轉(zhuǎn)錄因子FOXO1介導(dǎo)ESCs中自噬核心機(jī)器基因的表示出增加,降低FOXO1的表示出則降低ESCs中的自噬流,損害細(xì)胞自我更新、多能性和分化[76]。干細(xì)胞中細(xì)胞因子對(duì)自噬通路的調(diào)控與去泛素化酶之間的其他聯(lián)絡(luò)仍然需要通過(guò)大量研究來(lái)揭示。在成體干細(xì)胞中,細(xì)胞的自噬不僅幫助細(xì)胞加強(qiáng)對(duì)壓力的抗性,對(duì)于細(xì)胞的自我更新和分化也具有調(diào)節(jié)作用。多能干細(xì)胞利用線粒體的自噬機(jī)制避免氧化損傷,通過(guò)降低線粒體的含量,營(yíng)造一個(gè)低氧的微環(huán)境,躲避活性氧的傷害。如,造血干細(xì)胞借助自噬去除活潑踴躍的線粒體,保持一個(gè)代謝率極低的靜止?fàn)顟B(tài)[72]。3、去泛素化酶對(duì)干細(xì)胞特性調(diào)控的其他方面舉例作為一個(gè)新的去泛素化酶成員,Mindy1在胚胎干細(xì)胞中高表示出,能促進(jìn)干細(xì)胞的自我更新[77],在胚胎發(fā)育前期Mindy1的表示出迅速下降,直到發(fā)育完成后又逐步增加,在干細(xì)胞生長(zhǎng)分化中的這種變化機(jī)制當(dāng)前還沒研究清楚。已有多項(xiàng)研究表示清楚,蛋白酶體復(fù)合物在干細(xì)胞多能性、分化狀態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。例如,蛋白酶體亞基影響轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II等順式作用原件的數(shù)量和活性,抑制細(xì)胞類型特異性基因的表示出,維持干細(xì)胞的狀態(tài),除此之外蛋白酶體亞基中的另外一些成員能夠直接結(jié)合在特定基因位點(diǎn),沉默基因的表示出[5]。相反地,干細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子FOXO4促進(jìn)蛋白酶體亞基PSMD11的表示出[78],轉(zhuǎn)錄因子Nrf2可以以通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶體的活性促進(jìn)干細(xì)胞的干性維持,避免分化發(fā)生[79]。轉(zhuǎn)錄因子和蛋白酶體之間的這種相互調(diào)節(jié)維持了細(xì)胞的特性。19S蛋白酶復(fù)合體亞基的成分PSMD11(在鼠中是PSMD14)作為一個(gè)去泛素化酶分子,通過(guò)辨別相應(yīng)的底物,在蛋白代謝經(jīng)過(guò)中發(fā)揮校對(duì)官的作用,將有可能危害干細(xì)胞活性的毒性蛋白或錯(cuò)誤折疊的蛋白通過(guò)蛋白酶體途徑降解,保證干細(xì)胞的特性[78],也解釋了為什么干細(xì)胞中的蛋白酶體的數(shù)量一般比分化細(xì)胞中要高,可見干細(xì)胞利用蛋白酶體途徑為自個(gè)的活性保駕護(hù)航。4、結(jié)束語(yǔ)和瞻望泛素蛋白酶體系統(tǒng)影響著細(xì)胞多能性的維持和消失。通過(guò)泛素化關(guān)鍵多能性轉(zhuǎn)錄因子如Oct4、Nanog、cMyc、Klf4和Sox2等調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多能性狀態(tài)。泛素蛋白酶體系統(tǒng)在干細(xì)胞多能性誘導(dǎo)、維持和遺失方面的作用也越來(lái)越多地被報(bào)道,這類研究對(duì)于將來(lái)再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞替代治療和藥物藥效評(píng)估及挑選等多個(gè)領(lǐng)域有重要意義。比方,怎樣高效地獲得重編程的細(xì)胞、怎樣通過(guò)改變泛素蛋白酶體系統(tǒng)地調(diào)控調(diào)節(jié)細(xì)胞的狀態(tài)?通過(guò)泛素蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)于細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控,對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和蛋白翻譯的調(diào)節(jié),對(duì)損傷蛋白的控制和降解,維持多能性細(xì)胞的增殖潛能和多能性狀態(tài)等機(jī)制研究,有助于揭示蛋白質(zhì)代謝和細(xì)胞發(fā)育的機(jī)制。胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞都具有自我更新和多向分化的獨(dú)特特性,它們自發(fā)地向中、外、內(nèi)三胚層分化。隨著泛素蛋白酶體對(duì)于信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控逐步得到揭示,泛素蛋白酶體信號(hào)對(duì)于干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)也得到日益增長(zhǎng)的研究。泛素蛋白酶體系統(tǒng)介入到幾乎所有細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控中,如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞自我更新、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、氧化應(yīng)激、免疫反響和細(xì)胞凋亡等[80]。去泛素化酶作為泛素蛋白酶體系統(tǒng)的一部分,其在細(xì)胞生命活動(dòng)中也充當(dāng)著重要角色。研究去泛素化酶在干細(xì)胞特性調(diào)控中的作用有助于理解細(xì)胞的生命活動(dòng),有利于開發(fā)再生醫(yī)學(xué)治療各類疾病的新途徑。綜上,在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,研究泛素蛋白酶體系統(tǒng)和干細(xì)胞多能性調(diào)控之間的互相作用機(jī)制有重大生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。以下為參考文獻(xiàn)[1]THOMSONJA,ITSKOVITZ-ELDORJ,SHAPIROSS,etal.Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts[J].Science,1998,282(5391):1145-7.[2]BLANPAINC,LOWRYWE,GEOGHEGANA,etal.Self-renewal,multipotency,andtheexistenceoftwocellpopulationswithinanepithelialstemcellniche[J].Cell,2004,118(5):635-48.[3]TAKAHASHIK,YAMANAKAS.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors[J].Cell,2006,126(4):663-76.[4]BAHARVANDH,HAJHEIDARIM,ASHTIANISK,etal.Proteomicsignatureofhumanembryonicstemcells[J].Proteomics,2006,6(12):3544-9.[5]SZUTORISZH,GEORGIOUA,TORAL,etal.Theproteasomerestrictspermissivetranscriptionattissue-specificgenelociinembryonicstemcells[J].Cell,2006,127(7):1375-88.[6]WERNERA,MANFORDAG,RAPEM.Ubiquitin-dependentregulationofstemcellbiology[J].TrendsCellBiol,2021,27(8):568-79.[7]HANPUDEP,BHATTACHARYAS,DEYAK,etal.Deubiquitinatingenzymesincellularsignalinganddiseaseregulation[J].IubmbLife,2021,67(7):544-55.[8]BUCKLEYSM,ARANDA-ORGILLESB,STRIKOUDISA,etal.Regulationofpluripotencyandcellularreprogrammingbytheubiquitin-proteasomesystem[J].CellStemCell,2020,11(6):783-98[9]BRANDM,NAKKAK,ZHUJ,etal.Polycomb/trithoraxantagonism:cellularmemoryinstemcellfateandfunction[J].CellStemCell,2022,24(4):518-33.[10]CAOJ,YANQ.HistoneubiquitinationanddeubiquitinationintranscriptionDNAdamageresponse,andcancer[J].FrontOncol,2020,2:26[11]BELLEJI,NIJNIKA.H2A-DUBbingthemammalianepigenome:expandingfrontiersforhistoneH2Adeubiquitinatingenzymesincellbiologyandphysiology[J].IntJBiochemCellBiol,2020,50:161-74.[12]MARGUERONR,LIGH,SARMAK,etal.Ezh1andEzh2maintainrepressivechromatinthroughdifferentmechanisms[J].MolecularCell,2008,32(4):503-18.[13]SCHUETTENGRUBERB,BOURBONHM,DICROCEL,etal.Genomeregulationbypolycombandtrithorax:70yearsandcounting[J].Cell,2021,171(1):34-57.[14]BOYERLA,PLATHK,ZEITLINGERJ,etal.Polycombcomplexesrepressdevelopmentalregulatorsinmurineembryonicstemcells[J].Nature,2006,441(7091):349-53.[15]BHATNAGARS,GAZINC,CHAMBERLAINL,etal.TRIM37isanewhistoneH2Aubiquitinligaseandbreastcanceroncoprotein[J].Nature,2020,516(7529):116-20.[16]NAKAGAWAT,KAJITANIT,TOGOS,etal.DeubiquitylationofhistoneH2Aactivatestranscriptionalinitiationviatrans-histonecross-talkwithH3K4di-andtrimethylation[J].GenesDev,2008,22(1):37-49.[17]MIKKELSENTS,KUMC,JAFFEDB,etal.Genome-widemapsofchromatinstateinpluripotentandlineage-committedcells[J].Nature,2007,448(7153):553-60.[18]SCHEUERMANNJC,ALONSOAGDA,OKTABAK,etal.HistoneH2AdeubiquitinaseactivityofthePo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